Открытый доступ
Доступ предоставлен
Только для подписчиков
Том 19, № 4 (2024)
Научные обзоры
Применение генетически модифицированных линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в тканевой инженерии суставного хряща
Аннотация
Зрелый гиалиновый хрящ обладает низким регенеративным потенциалом, и его восстановление на сегодня представляет сложную клиническую и научную проблему. Травмы суставного хряща часто способствуют развитию остеоартрита и, как следствие, потере функциональности сустава и инвалидизации пациентов. Хирургические подходы к восстановлению суставных поверхностей, такие как мозаичная хондропластика и микрофрактурирование, применимые к небольшим размерам дефекта, не могут быть использованы при дегенеративно-дистрофических поражениях хряща. Клеточная терапия с использованием хондроцитов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), является перспективным направлением реконструкции тканей суставного хряща. ИПСК обладают высокой пролиферативной активностью, что позволяет получать аутологичные клетки в количестве, которое требуется для восстановления суставного дефекта индивида. Технология редактирования генома CRISPR-Cas, основанная на системе адаптивного иммунитета бактерий, даёт возможность генетически модифицировать ИПСК с целью получения клеток-прогениторов с заданными характеристиками и свойствами.
В данном обзоре собраны научные работы узкоспециализированной направленности, посвящённые комбинированию технологий ИПСК и CRISPR-Cas для исследований в области регенеративной медицины хряща. Мы аккумулировали статьи за последние двенадцать лет, с момента, когда метод CRISPR-Cas стал доступным мировому сообществу. Сегодня для решения терапевтических задач в области регенеративной медицины суставного хряща CRISPR-Cas применяется с целью повышения эффективности хондрогенной дифференцировки линий ИПСК и получения более гомогенной популяции хондропрогениторных клеток. Другим походом является удаление последовательности рецепторов провоспалительных цитокинов для получения хрящевой ткани, невосприимчивой к воспалению. Наконец, нокаут генов компонентов главного комплекса гистосовместимости позволяет получать хондроциты, «невидимые» для иммунной системы реципиента. Исследования в данном направлении способствуют развитию персонализированной медицины и в перспективе ведут к повышению качества жизни населения в глобальной популяции.
404-424
Оригинальные исследования
Применение полуколичественной петлевой изотермической амплификации для оценки уровня экспрессии генов в культуре клеток Expi293
Аннотация
Обоснование. Клеточные культуры млекопитающих играют ключевую роль в фармакологической промышленности, требуя постоянного мониторинга состояния во время ферментации. Помимо контроля физико-химических параметров важно оценивать состояние клеток, для чего используется анализ экспрессии генов. В настоящее время доминирующим методом служит количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР) с обратной транскрипцией. Однако метод петлевой изотермической амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) также привлекает внимание благодаря своей высокой специфичности, чувствительности и скорости проведения реакции. LAMP становится перспективным инструментом для быстрого анализа экспрессии генов, особенно в условиях ограниченного количества биологического материала или большого объёма проб.
Цель исследования — разработка методики полуколичественной оценки уровня экспрессии целевых генов в культуре клеток человека Expi293 с помощью LAMP.
Материалы и методы. Для проведения LAMP был получен рекомбинантный большой фрагмент ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bst-pol), выполнена его очистка и определены оптимальные условия реакции. В качестве интеркалирующих красителей использовали SYBR Green I и LUCS13. Проанализированы параметры амплификации для различных концентраций фермента и красителя. Для кПЦР использовали стандартные наборы с SYBR Green I. Обе методики сравнивали в процессе анализа экспрессии генов IGF1, FGF2 и EIF3i в клеточных линиях с повышенным уровнем экспрессии этих генов.
Результаты. Показано, что использование красителя LUCS13 обеспечивает классическую S-образную форму кривой накопления сигнала в LAMP, в то время как использование SYBR Green I приводит к её искажению (вызывает артефакты). Оптимальной признана концентрация Bst-pol 40 нг/мкл. При сравнении двух методов установлено, что LAMP обладает большей чувствительностью, позволяет определять экспрессию генов с точностью, сравнимой с кПЦР, демонстрируя более короткое время реакции (до 35 мин).
Заключение. Хотя кПЦР остаётся основным методом оценки уровня экспрессии генов, LAMP предлагает ряд преимуществ, которые делают её привлекательной альтернативой для различных биотехнологических целей. Благодаря высокой скорости, простоте выполнения и доступности, а также высокой чувствительности и специфичности LAMP является ценным инструментом для быстрого анализа экспрессии генов в ходе мониторинга клеточных культур.
425-440
Мультиплексный анализ раковых клеток после обработки индуцированными мембранными везикулами мезенхимальных стволовых клеток
Аннотация
Обоснование. Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой везикулы мембранного происхождения, выделяемые клетками во внеклеточное пространство и играющие важную роль в межклеточной коммуникации путём участия в регуляции ряда биологических процессов. Везикулы обнаруживаются в ткани опухоли, где выполняют роль посредника в передаче сигналов между опухолевыми клетками и клетками микроокружения. Подобно родительским мезенхимальным стволовым клеткам (МСК), ВВ оказывают двойственное влияние на развитие опухолей. Исследования показывают, что ВВ МСК способствуют росту опухоли, с другой стороны, в нескольких работах продемонстрирована их ингибирующая роль.
Цель исследования — оценить эффект воздействия мембранных везикул МСК на молекулярный состав раковых клеток.
Материалы и методы. Индуцированные мембранные везикулы (иМВ) получали из МСК, предварительно выделенных из жировой ткани, с помощью обработки их цитохалазином В. С целью моделирования межклеточной коммуникации между опухолевыми клетками и МСК наносили иМВ в различной концентрации белка на клетки-реципиенты (SH-SY5Y, PC3, MCF7). Для измерения концентрации тотального белка, выделенного из клеток/иМВ человека, использовали метод с бицинхониновой кислотой. Затем проводили анализ молекулярного состава клеток-реципиентов после нанесения на них иМВ МСК с помощью мультиплексного анализа.
Результаты. Мы определили, что после нанесения мембранных везикул МСК на раковые клетки происходят значительные изменения в экспрессии многих биологически активных молекул, включая цитокины, хемокины и факторы роста. В частности, обнаружено увеличение концентрации фактора роста FGF-2, цитокинов G-CSF, Fractalkine, IL-12p40, IL-9, IL-4, IL-6, IL-8, хемокинов IP-10, MCP-1 и других. Анализ также выявил, что большинство из этих молекул связаны с пролиферацией клеток, миграцией и иммунным ответом.
Заключение. Мембранные везикулы МСК способны изменять молекулярный профиль раковых клеток, увеличивая концентрацию молекул, связанных с выживаемостью и миграцией клеток.
441-452
Коррекция мутации F508del в гене CFTR с использованием CRISPR/Cas9 в клетках, полученных от пациентов с муковисцидозом
Аннотация
Обоснование. Муковисцидоз — самое распространённое и неизлечимое генетическое заболевание. Наиболее частой причиной является мутация F508del в гене CFTR, которую гипотетически можно исправить методами редактирования генома. В настоящее время крайне актуальными являются как поиск наиболее эффективной системы редактирования на основе CRISPR/Cas9 для данной мутации, так и выбор клеток-мишеней, которые могли бы поддерживать самообновление и давать дифференцированное потомство клеток лёгких. Такими перспективными мишенями служат индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (чиПСК) и индуцированные базальные клетки дыхательных путей человека (чиБК).
Цель исследования — исправить мутацию F508del в гене CFTR в чиПСК и чиБК, полученных от пациентов с муковисцидозом, с помощью технологии CRISPR/Cas9.
Материалы и методы. Мы получили три линии чиПСК методом репрограммирования фибробластов от пациентов с муковисцидозом и три линии чиБК методом направленной дифференцировки вышеуказанных чиПСК. На основании трёх различных вариантов нуклеазы Cas9, трёх подобранных направляющих РНК и двух одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов мы разработали восемь систем редактирования мутации F508del, которые ввели в чиПСК и чиБК методом электропорации, после чего в трансфицированных клетках оценили уровень негомологичного соединения концов, внесения инделов и направленной гомологичной репарации с помощью глубокого таргетного секвенирования.
Результаты. На чиПСК были протестированы восемь редактирующих систем. Наивысшая эффективность негомологичного соединения концов, внесения инделов и направленной гомологичной репарации наблюдалась при использовании нуклеазы SpCas9(1.1). Мутацию F508del достоверно удалось исправить с помощью комбинации этой нуклеазы с направляющей РНК sgCFTR#sp1 (с эффективностью до 6,6% аллелей в трансфицированных клетках). На чиБК были протестированы две редактирующие системы, которые оказались наиболее эффективными в экспериментах на чиПСК. Мутацию достоверно удалось исправить с помощью обеих систем (эффективность — до 20% аллелей в трансфицированных клетках).
Заключение. Показана возможность высокоэффективной коррекции мутации F508del в гене CFTR в клетках, полученных от пациентов с муковисцидозом, с помощью разработанной системы редактирования на основе системы CRISPR/Cas9. Поскольку чиБК хорошо поддаются трансфекции и редактированию, а также могут быть получены в достаточном количестве из чиПСК, они являются перспективной платформой для разработки генотерапевтического лечения муковисцидоза.
453-472
Морфологическая характеристика десны после применения коллагеновых матриксов Fibro-Gide и FibroMATRIX и соединительнотканных трансплантатов в области дентальной имплантации
Аннотация
Обоснование. Свободные соединительнотканные трансплантаты (ССТ), полученные из области бугра верхней челюсти и твёрдого нёба, а также их заменители — коллагеновые матриксы — широко используют для увеличения объёма мягких тканей вокруг дентальных имплантатов в клинической практике. Однако ещё не представлено сравнительной гистологической оценки их клинического применения.
Цель исследования — выявить структурные различия десны в области применения коллагеновых матриксов Fibro-Gide и FibroMATRIX и ССТ с помощью гистологического исследования и морфометрии.
Материалы и методы. Морфометрию биоптатов ССТ перед их использованием в области дентальных имплантатов проводили с помощью срезов ткани, окрашенных гематоксилином и эозином, по Ван Гизону и по Массону. Морфометрию биоптатов из зон регенерации через 3 мес после операции выполняли аналогичным образом, дополнительно используя иммуногистохимическое окрашивание с антителами к CD45 и CD68.
Результаты. До трансплантации ССТ из области нёба относительный объём жировой ткани составил (9,8±4,8)%, что было статистически значимо больше, чем (7,2±1,1)% для ССТ из области бугра. Относительное количество кровеносных сосудов было больше в ССТ из области нёба, чем из области бугра — (2,3±0,6)% против (1,2±0,6)% соответственно. Через 3 мес после трансплантации наибольшее относительное количество соединительной ткани было в группе с применением ССТ из области бугра и составило (68,8±2,3)%, наименьшее — при использовании материала FibroMATRIX (50,1±1,7)%. Наибольшая относительная площадь кровеносных сосудов была в группах с применением ССТ из области нёба и материала Fibro-Gide — (2,7±0,2)% и (2,0±0,2)% соответственно; наименьшая — при использовании ССТ из области бугра и FibroMATRIX — (1,0±0,2)% и (1,0±0,1)% соответственно.
Заключение. Структура регенерата десны наследует ряд морфологических свойств ССТ, которые связаны с областью его получения: нёба или бугра. Так, бόльшая площадь сосудов и количество фибробластов наблюдаются как в исходном ССТ из области нёба, так и в регенерате, полученном после его применения. Используемые в качестве замены ССТ коллагеновые матриксы Fibro-Gide и FibroMATRIX через 3 мес резорбируются не полностью и провоцируют макрофагальную, лейко- и лимфоцитарную инфильтрацию. Полученные данные гистологического исследования могут прояснить клинические и эстетические различия в результатах применения аутогенных ССТ и их заменителей в виде коллагеновых матриксов.
473-484
Оценка показателей функции митохондриального дыхания мононуклеаров периферической крови у пациентов с хронической сердечной недостаточностью и сахарным диабетом 2-го типа
Аннотация
Обоснование. Предположение, что митохондриальная дисфункция может сопровождать развитие хронической сердечной недостаточности (ХСН) и сахарного диабета 2-го типа (СД2), а также коморбидных форм этих клинических фенотипов, получило подтверждение в реальном клиническом наблюдении на больных. При оценке митохондриального дыхания мононуклеаров периферической крови с помощью митохондриального стресс-теста у больных ХСН как с сохранённой, так и с низкой фракцией выброса, а также у больных СД2 обнаруживается выраженное снижение потребления кислорода митохондриями мононуклеарных клеток периферической крови.
Цель исследования — оценить информативность митохондриального стресс-теста у больных с ХСН, коморбидной с СД2.
Материалы и методы. Обследовано 23 пациента (средний возраст — 69,8±10,1 года) с ХСН с сохранённой фракцией выброса (ХСН-сФВ) и низкой фракцией выброса (ХСН-нФВ). Пациентов разделили на группы в зависимости от наличия сопутствующего СД2. Митохондриальный стресс-тест проводили на анализаторе Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent Technologies, США). Дыхательную функцию митохондрий оценивали в адгезированных мононуклеарах путём одномоментного измерения скорости расхода кислорода и величины экстрацеллюлярного протонного тока.
Результаты. У больных с СД2 по сравнению с группой контроля показатели базального дыхания были снижены в 1,5 раза, резервного дыхания — в 3,5 раза. Наиболее угнетающее действие СД2 на митохондриальное дыхание наблюдалось при ХСН-нФВ: в 2,1–3,0 раза меньше по сравнению с группой контроля. Сопутствующий СД2 был связан с меньшим значением резервного дыхания, в группах с изолированной ХСН значения показателя были меньше в 2,4–4,5 раза, а у лиц с СД2 — в 18,0 раза. Кроме того, у больных СД2 наблюдалось угнетение и немитохондриального дыхания в 1,28 раза по сравнению с контролем.
Заключение. Выявленная у коморбидных пациентов выраженная дисфункция митохондрий сопоставима со стремительным развитием клиники ХСН, сочетанной с СД2, и высокой частотой декомпенсированных клинических случаев. Уменьшение показателей базального дыхания и запасной дыхательной ёмкости является ключевым фактором развития ХСН у пациентов с СД2.
485-495
Белковые партнёры TRIM29 в культуре иммортализованных клеток нормального базального эпителия предстательной железы
Аннотация
Обоснование. E3-убиквитин-лигаза TRIM29 вовлечена в развитие базального эпителия, клеточного ответа на вирусные инфекции и на повреждения ДНК. Кроме того, этот белок может проявлять как онкогенные, так и онкосупрессорные свойства. Однако до сих пор неизвестны молекулярные механизмы, обеспечивающие участие TRIM29 в столь широком спектре биологических процессов.
Цель исследования — определение белков-партнёров TRIM29 и его усечённых форм с последующим выявлением ключевых молекулярных процессов, в которые он вовлечён.
Материалы и методы. Получали клеточные культуры нормального базального эпителия предстательной железы со сверхэкспрессией химерного белка TRIM29-FLAG или его усечённых форм без B-Box-домена или без Coiled-Coil-домена. После этого определяли белки-партнёры TRIM29 и его усечённых форм при помощи иммунопреципитации белка с последующим протеомным анализом (высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией). Результаты были подтверждены вестерн-блот-анализом и иммуноцитохимическим анализом.
Результаты. TRIM29 связывается с 288 белками в нормальном базальном эпителии предстательной железы. Делеция B-Box слабо влияет на белок-белковые взаимодействия TRIM29, а делеция Coiled-Coil-домена лишает TRIM29 большей части белковых партнёров и нарушает его димеризацию. Показано, что TRIM29 локализуется как в ядре, так и в цитоплазме, при этом делеция функциональных доменов не препятствует локализации в различных компартментах, но влияет на связывание с белками, специфичными для этих компартментов. TRIM29 связывается с белками цитоскелета, белками клеточного ответа на стресс и с РНК-связывающими белками. И кроме того, показано, что TRIM29 повышает устойчивость клеток к генотиксичным агентам и влияет на процесс сплайсинга РНК.
Заключение. Протеомный анализ показал, что в нормальном базальном эпителии предстательной железы E3-убиквитин-лигаза связывается с довольно большим количеством белков, выполняющих разные функции в различных компартментах клетки. Полученные результаты согласуются с результатами других исследовательских групп, показавших, что TRIM29 активно участвует в перестройке цитоскелета, клеточном ответе на вирусную инфекцию и на повреждения ДНК. Кроме того, впервые продемонстрировано, что TRIM29 взаимодействует с белками стрессовых гранул и РНК-связывающими белками и способен регулировать сплайсинг РНК, а Coiled-Coil-домен TRIM29 может играть в этом ключевую роль.
496-512