Гены и Клетки

Флуоресцентная микроскопия с временным разрешением (FLIM) активно развивается на протяжении последних двух десятилетий и играет значительную роль в биомедицинских исследованиях. Современные достижения в создании флуоресцентных зондов существенно расширили потенциал данного метода. Учитывая, что время жизни флуоресценции чувствительно к микросреде и молекулярным изменениям, FLIM представляет собой перспективный инструмент для выявления патологических состояний, включая онкологические заболевания. Эта технология позволяет наблюдать структуру опухоли и отслеживать динамические процессы в режиме реального времени, что дает возможность исследователям с поразительной точностью исследовать живые раковые клетки и их микроокружение. Более того, данный метод открывает новые возможности для мониторинга эффективности противоопухолевой терапии. Особый интерес представляет применение FLIM в разработке и оценке эффективности иммунотерапевтических стратегий. В контексте терапии солидных опухолей ключевое значение имеют данные о метаболизме и гетерогенности опухоли, механизмах клеточной гибели, а также о динамике иммунного ответа после терапевтического воздействия.

В настоящем обзоре на основании анализа современных научных данных мы обосновываем целесообразность использования FLIM в качестве важного инструмента в исследованиях, направленных на совершенствование методов иммунотерапии рака.

Обоснование. Культивирование спинномозговых ганглиев является широко используемым подходом для моделирования физиологических и патологических состояний периферической нервной системы in vitro. Имеющиеся литературные данные указывают на то, что постнатальные спинномозговые ганглии содержат пул глиальных стволовых клеток, которые способны дифференцироваться в нейроны после травмы. Следовательно, извлечённые спинномозговые ганглии, содержащие пул стволовых клеток, могут обладать нейрогенным потенциалом ex vivo. Однако в доступной литературе мы не нашли работ, исследующих сохранение регенеративного потенциала спинномозговых ганглиев ex vivo.

Цель. В данном исследовании мы оценили нейрогенный потенциал изолированных спинномозговых ганглиев и создали трёхмерную органотипическую культуру из этих эксплантов.

Методы. Мышиные спинномозговые ганглии, выделенные из шейного, грудного и поясничного отделов позвоночника, краткосрочно и долгосрочно культивировали в виде трёхмерной культуры в геле Geltrex. Морфологию, ультраструктуру и профиль экспрессии генов культивируемых спинномозговых ганглиев анализировали с помощью световой и электронной микроскопии, иммунофлуоресцентного окрашивания и количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Результаты. Установлено, что спинномозговые ганглии, культивируемые в Geltrex в течение 14 дней, стабильно генерировали трёхмерную периганглионарную сеть, состоящую из радиально разветвлённых удлинённых клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами против Tuj1 (нейронспецифический бета-тубулин класса III) показало, что наблюдаемые клетки были нейрональными клетками. Иммуноокрашивание антителами против O4 подтвердило, что клетки, маркированные Tuj1, не были мигрирующими Шванновскими клетками. Количественный анализ общей РНК, выделенной из культуры эксплантов спинномозговых ганглиев с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, выявил значительное увеличение матричной РНК ключевых генов, связанных с нейрогенезом, таких как Neurog1, Neurog2 и Sox2, что указывает на активацию нейрогенной программы в культивируемых эксплантах. Световая и электронная микроскопия показали, что взрослые сенсорные нейроны дегенерировали в эксплантах спинномозговых ганглиев и не вносили вклад в периганглионарную сеть. Используя доступные конфокальные возможности, мы оценили трёхмерные параметры периганглионарной сети по двумерным микроскопическим изображениям, чтобы продемонстрировать топографию нейрональных клеток, экспрессирующих Tuj1, в культуре эксплантов спинномозговых ганглиев.

Заключение. Охарактеризована трёхмерная культура спинномозговых ганглиев. Обнаружено, что выделенные экспланты демонстрируют регенеративную способность в условиях культивирования in vitro и могут представлять собой новую органотипическую модель с нейрогенным потенциалом. Полученная модель может быть релевантной для изучения процессов регенерации в спинномозговых ганглиях, расширяя возможности исследований за пределами традиционных двумерных культур, получаемых из стволовых клеток.

Обоснование. Рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) — один из ключевых белков клеточного сигналинга, контролирующего каскады митоген-активируемых протеинкиназ (mitogen-activated protein kinase, МАРК). Нарушение функционирования EGFR ассоциировано с развитием различных опухолевых заболеваний, что указывает на актуальность разработки таргетных анти-EGFR-препаратов. Одним из перспективных противоопухолевых агентов, способных взаимодействовать с EGFR, является рибонуклеаза (РНКаза) Bacillus pumilus — биназа, цитотоксический потенциал которой в первую очередь обусловлен её активностью в отношении внутриклеточной РНК. При этом мутантные формы биназы K26A и H101E со сниженной каталитической активностью также обладают противоопухолевыми свойствами.

Цель. Оценить вклад взаимодействия мутантных форм биназы с EGFR в их цитотоксический потенциал.

Методы. Характеристику антипролиферативной активности биназы и её мутантных форм — K26A и H101E с остаточной каталитической активностью в размере 11,0 и 0,02% соответственно — проводили методом МТТ-теста на линии клеток эпидермоидной карциномы А431 с повышенным уровнем экспрессии EGFR дикого типа. Взаимодействие РНКаз с EGFR и их способность модулировать МАРК/ERK-каскад исследовали с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Гипотетические модели белок-белкового взаимодействия конструировали с использованием средств компьютерного моделирования. Антимиграционную активность РНКаз оценивали в стандартном тесте на зарастание царапины.

Результаты. Установлено, что биназа и её мутанты снижают пролиферативную активность опухолевых клеток А431 на 40%. Предварительная обработка клеток моноклональным антителом к EGFR цетуксимабом приводит к ослаблению цитотоксического потенциала мутантов биназы. С помощью средств компьютерного моделирования показано, что исследуемые РНКазы способны взаимодействовать с EGFR, при этом предсказано, что биназа обладает большей аффинностью к АТФ-связывающему сайту тирозинкиназного домена, а мутантные производные — к области, отвечающей за эндоцитоз рецептора. Это может опосредовать наблюдаемые различия в скорости интернализации EGFR. В отличие от биназы и мутанта K26A, каталитически неактивный мутант H101E не обладает антимиграционной активностью, что указывает на важность наличия определённого уровня ферментативной активности.

Заключение. EGFR является мишенью цитотоксического действия мутантных форм биназы, взаимодействие с ним приводит к ингибированию сигнального пути МАРК/ERK и гибели опухолевых клеток.

Обоснование. Ожоговая травма, особенно с формированием обширных и глубоких ожогов, вызывает не только локальные повреждения тканей, но и системные изменения в организме, затрагивающие регенеративные способности кожи. Современные методы лечения, в том числе применение клеточных технологий, направлены на ускоренное восстановление кожного покрова в условиях дефицита собственной ткани у пациента. Несмотря на использование клеток, выделенных из неповреждённых участков кожи, их жизнеспособность и способность к формированию эпителиальных структур могут быть значительно снижены. Данное исследование направлено на изучение изменений, происходящих в эпидермисе неповреждённой кожи у пациентов с обширными ожогами, а также на поиск эффективных стратегий для улучшения жизнеспособности культивируемых кератиноцитов.

Цель. Изучение системного влияния ожоговой травмы на жизнеспособность кератиноцитов эпидермиса неповреждённой кожи и разработка подходов к её повышению при культивировании.

Методы. Иммунофлуоресцентное исследование специализированных маркёров проводили на криосрезах кожи от здоровых доноров и от пациентов с ожогами. Долю живых клеток и эпидермальных стволовых клеток в культуре кератиноцитов исследовали методом проточной цитометрии. In vitro изучали способность кератиноцитов, выделяемых из кожи здоровых доноров и доноров с ожогами, к адгезии, формированию колоний и конфлюэнтного слоя клеток.

Результаты. Установлено снижение адгезивности и жизнеспособности кератиноцитов кожи от пациентов с ожогами в первые дни культивирования. Иммунофлуоресцентный анализ выявил аномальную экспрессию кератинов 6 и 17 в эпидермисе неповреждённой кожи ожоговых пациентов, увеличение доли клеток с ядерной локализацией белка YAP1 и снижение экспрессии интегринов, что свидетельствует о формировании провоспалительного фенотипа. Проточная цитометрия показала снижение доли эпидермальных стволовых клеток (ITGα6^high/CD71^low) у пациентов с ожогами. Для улучшения адгезии и выживаемости клеток были предложены методы культивирования с сорбцией культуральной поверхности коллагеном и добавлением ингибитора Rho-ассоциированных киназ к культуральной среде, что способствовало росту клеток и быстрому формированию конфлюэнтного слоя.

Заключение. Использование модифицированного протокола культивирования с применением коллагена I типа и ингибитора Rho-ассоциированных киназ позволяет повысить эффективность масштабирования клеток от пациентов с ожогами. Полученные результаты позволят оптимизировать процесс получения клеточных культур для лечения ожоговых больных, улучшить приживаемость трансплантируемых клеток и в итоге — повысить эффективность тканевой инженерии в комбустиологии.