Articular cartilage tissue engineering using genetically modified induced pluripotent stem cell lines

Full Text

Введение

Гиалиновый хрящ сустава — это плотная, упругая стекловидная ткань, покрывающая суставные эпифизы костей. Артикулярный хрящ обеспечивает амортизацию при движении и снижает коэффициент трения суставных поверхностей, предотвращая их истирание [1, 2]. Повреждения тканей артикулярного хряща зачастую являются необратимыми, сопровождаются хронической болью и ведут к дестабилизации сустава и потере его функциональности. Разрушение тканей хряща происходит вследствие травмы либо дегенеративного заболевания [3, 4]. Например, остеоартрит бедренного и коленного суставов, одно из наиболее распространённых суставных заболеваний, находится на одиннадцатом месте в мире по инвалидизации населения [5]. Сегодня насчитывается уже около 240 млн случаев и прогнозируется дальнейший рост числа пациентов с остеоартритом в связи с ожидаемым увеличением средней продолжительности жизни населения [6, 7]. К разрушению структуры хряща и воспалительным процессам также приводит чрезмерная механическая нагрузка на суставные поверхности [8].

Несмотря на важность выполняемых функций, после повреждения ткани артикулярного хряща млекопитающих в значительной степени ограничены в регенерации нативной структуры. Существующие стратегии медикаментозного и хирургического лечения остеоартрита не приводят к восстановлению функциональности сустава в долгосрочной перспективе [8]. В перечень современных клинических подходов для восстановления тканей артикулярного хряща входят такие методы, как микрофрактурирование, мозаичная хондропластика, а также имплантация аутологичных хондроцитов, известная в англоязычной литературе как метод ACI (autologous chondrocyte implantation) [9–11].

Метод микрофрактурирования заключается в перфорировании субхондральной кости в области повреждения тканей артикулярного хряща для обеспечения свободного доступа клеток костного мозга. Выполняется данная операция достаточно просто и не требует значительных материальных затрат [9, 10, 12, 13]. Однако, согласно клиническим исследованиям, микрофрактурирование демонстрирует лишь незначительное улучшение функциональных и радиологических показателей, даже при использовании новейших синтетических или биологических адъювантов [14].

Более хорошие клинические показатели демонстрирует мозаичная хондропластика, однако она применяется только к небольшим по площади повреждениям хряща, поскольку требуется перенос остеохондральных фрагментов в зону дефекта из областей со здоровой хрящевой поверхностью [15–17].

Технология восстановления хряща ACI ещё не введена в клиническую практику в России, однако заслуживает упоминания, поскольку ACI обладает коротким периодом послеоперационного восстановления и при этом является приемлемо эффективным методом хондропластики в случаях реконструкции небольших хрящевых повреждений. К недостаткам метода можно отнести возрастные ограничения, а также неизбежность дополнительного хирургического вмешательства для забора здоровых тканей хряща [8–10, 18].

Всё же, несмотря на широкое распространение в клинической практике описанных методов хондропластики, в подавляющем большинстве случаев сложная структура хрящевой ткани не восстанавливается, а на месте утраченного хряща формируется фиброзная ткань. Фиброхрящ имитирует ткани гиалинового хряща, однако значительно уступает ему по механическим свойствам, что с течением времени приводит к повторному изнашиванию тканей суставных поверхностей и развитию остеоартрита [10, 19]. Микрофрактурирование, мозаичная хондропластика и технология трансплантации аутологичных хондроцитов по сути своей нацелены на отсрочку крайней меры — эндопротезирования сустава, сопровождающегося длительным периодом реабилитации. При эндопротезировании выживаемость имплантатов без ревизии составляет в среднем 63% за десять лет, при этом случаи осложнений включают инфицирование и асептическое расшатывание протеза [20, 21].

Ввиду всего вышеозвученного большие надежды возлагаются на разработку новых подходов к восстановлению тканей суставов на основе клеточной терапии. Работа с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК) в этом направлении представляется наилучшим вариантом, поскольку эти клетки обладают преимуществами эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), исключая при этом сложные аспекты этического характера, связанные с ЭСК человека.

Сегодня исследования хондрогенеза и научные разработки, нацеленные на лечение суставных заболеваний с участием ИПСК, ведутся в широком диапазоне интересов учёных. Представленный обзор литературы сфокусирован на узкоспециализированном направлении регенеративной медицины суставов, которое включает исследования с применением ИПСК, подвергнутых генетическим модификациям. Мы постарались аккумулировать научные работы с участием ИПСК в открытом доступе за последние двенадцать лет — период существования технологии геномного редактирования CRISPR-Cas, чтобы оценить уже реализуемые научные идеи по данной специализации, а также определить ещё не охваченные исследовательские направления.

Хондроциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Неоспоримым преимуществом ИПСК является плюрипотентность. Плюрипотентные стволовые клетки способны неограниченно делиться, сохраняя способность к дифференцировке в клетки всех эмбриональных зародышевых листков: эктодермы, энтодермы и мезодермы [22, 23]. Впервые ИПСК были получены из культуры соматических клеток соединительной ткани при добавлении четырёх транскрипционных факторов (Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4), позднее названных факторами Яманаки [22, 24]. С тех пор перечень типов клеток человека, которые удалось репрограммировать в ИПСК, был значительно расширен [25]. На сегодняшний день возможно получение ИПСК из клеток легкодоступных биологических материалов: кератиноцитов волосяных фолликулов, клеток периферической крови (Т-клеток, В-клеток, гемопоэтических стволовых клеток и клеток костного мозга) и эпителиальных клеток, обнаруживаемых в моче [26].

В большинстве исследований с участием ИПСК их применяют для моделирования заболеваний in vitro, скрининга лекарств, создания биобанков, поиска молекулярных терапевтических мишеней и разработки новых способов лечения целого ряда заболеваний [27, 28]. Для регенеративной медицины ИПСК — это альтернативный источник получения клеток различных типов тканей для последующего применения в работах по изучению процессов восстановления повреждённых тканей с низким «от природы» регенеративным потенциалом, например тканей гиалинового хряща. На начало 2021 года насчитывалось 137 клинических исследований, в которых в той или иной форме фигурировали ИПСК, но только в 19 исследованиях аллогенные или аутологичные ИПСК были непосредственно задействованы в клеточной терапии пациентов [29], при этом среди них нет ни одной публикации по теме разработки терапевтических методов восстановления хрящевых тканей суставов.

Впервые эффективная хондрогенная дифференцировка in vitro была реализована в 2010 году с использованием ЭСК [30]. Далее хондроциты из ИПСК были получены при совместном культивировании ИПСК и первичной культуры хондроцитов [31]. Обзор текущих протоколов получения хондроцитов из ИПСК подробно представлен в статьях [10] и [32]. Ключевыми факторами, инициирующими хондрогенез, выступают белки суперсемейства трансформирующего фактора роста β (TGF-β, transforming growth factor β) [33–35]. Сигнальный путь TGF-β регулирует клеточный цикл хондроцитов, их выживание, миграцию и переход к гипертрофированному состоянию. Белки TGF-β стимулируют синтез классических маркёров гиалинового хряща, таких как транскрипционный фактор SOX9, коллаген II типа и аггреканы [33–35]. Большинство опубликованных протоколов описывает получение хондроцитов из ИПСК либо через стадию формирования из ИПСК трёхмерных клеточных агрегатов — эмбриоидных телец с последующим культивированием в мезенхимальной среде [36, 37], либо через непосредственную мезодермальную индукцию ИПСК с помощью подобранных коктейлей из активаторов сигнального пути WNT (например, низкомолекулярного соединения CHIR99021, ингибитора фермента GSK-3 (glycogen synthase kinase 3), [38] или рекомбинантного белка Wnt3a [39]) и фактора роста BMP4 (bone morphogenetic protein 4) [39]; возможно добавление и других модуляторов [39]. Следующий за этим запуск хондрогенной дифференцировки проводят с добавлением синтетического глюкокортикоида дексаметазона и факторов хондрогенеза TGF-β1 [37, 40–42] или TGF-β3 [37, 42, 43], также применяют варианты протоколов с добавлением GDF5 (growth differentiation factor 5), FGF2 (fibroblast growth factor 2) и NT4 (neurotrophin 4/5) [39]. При этом дифференцировка стволовых клеток в хондроциты проходит эффективнее в трёхмерных культурах [44–46].

На сегодняшний день получение хондроцитов из ИПСК (ИПСК-хондроциты) и их имплантацию проводили в основном на животных моделях [47]. На модели остеоартрита коленного сустава кролика внутрисуставные инъекции ИПСК-хондроцитов человека привели к улучшению гистологической оценки тканей хряща по шкале ICRS (International Cartilage Repair Society) и снижению экспрессии маркёров воспаления [48]. Однако наилучшие результаты восстановления хрящевых повреждений принадлежат трёхмерным хрящевым имплантатам. У приматов при трансплантации аллогенных хрящевых органоидов, полученных из ИПСК, через 17 нед после операции обнаружили заполнение дефекта тканью, близкой по характеристикам к ткани нативного гиалинового хряща, в то время как в группе, где заживление дефекта проходило без участия хрящевых имплантатов, наблюдали формирование фиброзных тканей в области повреждения [49]. В представленном исследовании на приматах также продемонстрировано скопление CD3⁺ Т-лимфоцитов вокруг аллогенного хрящевого органоида при трансплантации в остеохондральный дефект, в то же время активация иммунных клеток не наблюдалась при трансплантации в область хондрального дефекта [49]. Иммунный ответ (либо его отсутствие) на аллогенный трансплантат в работе обусловлен различием хирургической модели суставного дефекта. Артикулярный хрящ состоит из плотного коллагенового матрикса, продуцируемого хондроцитами, и не содержит кровеносных сосудов, что обеспечивает его клеткам условную иммунологическую привилегированность в суставе [50, 51]. При формировании остеохондрального дефекта, в отличие от дефекта хондрального, нарушают целостность субхондральной кости, открывая свободный доступ клеткам костного мозга, включая иммунные клетки, к аллогенному трансплантату [52]. Опираясь на полученные данные, авторы работы [49] утверждают, что аллогенная трансплантация вполне допустима при восстановлении хондральных дефектов, однако стоит помнить, что авторы проводили моделирование дефекта сустава на здоровых животных, в то время как в клинической практике разрушение хрящевой ткани сустава различной этиологии сопровождается воспалительными процессами в преобладающем количестве случаев [53].

При работе с ИПСК стоит помнить о рисках, сопровождающих их применение. В первую очередь это риск злокачественного перерождения получаемых ИПСК и их производных, обусловленный возникновением мутаций в процессе репрограммирования, длительного культивирования и направленной дифференцировки ИПСК [54–58]. К рискам применения ИПСК в клинической практике также относят их потенциальную туморогенность [10]. Производные ИПСК сохраняют риск формирования опухоли, связанный с потенциальным присутствием некоторого количества недифференцированных плюрипотентных клеток в трансплантируемой ткани [10], при этом в настоящее время ведутся разработки методов их селективного удаления [59–62]. Не стоит также исключать вероятность иммуногенности аутологичных ИПСК-продуктов: сингенные и аутологичные ИПСК и их производные зачастую инициируют иммунный ответ со стороны как Т-лимфоцитов [63, 64], так и NK-клеток (natural killer cells) [65, 66]. Сегодня утверждение о возможности имплантации сингенных и аутологичных ИПСК-производных вне применения иммуносупрессивной терапии является достаточно спорным [67].

Все вышесказанное обусловливает высокие требования, предъявляемые к линиям ИПСК, которые могут быть «допущены» до клинических исследований. Сопоставимость линий ИПСК имеет важное значение и требует согласования стандартизации производства этих клеток, их качественных характеристик и методов анализа. В настоящее время предлагаемые стандарты включают целый перечень требований [68, 69] к общим биологическим свойствам ИПСК, таким как клеточная морфология, клеточный цикл, нормальный кариотип и жизнеспособность. Кроме того, обязательно учитываются специфические свойства ИПСК: наличие определённого набора маркёров плюрипотентности и способность дифференцироваться по пути трёх зародышевых листков. В перечень общих стандартов для характеризации ИПСК также входят тестирование на микробиологическую стерильность и проверка на наличие остаточных компонентов системы репрограммирования. Линии полученных ИПСК подвергаются комплексному исследованию на хромосомную стабильность, что позволяет обнаружить генетические аномалии и хромосомные аберрации.

Тем не менее работа с ИПСК продолжается, и научным сообществом прорабатываются возможности нивелировать риски их применения с помощью не только стандартизации характеризации линий ИПСК, но и, например, редактирования их генома посредством революционного метода CRISPR-Cas.

Система редактирования генома CRISPR-CAS

С момента открытия двойной спирали ДНК технологии, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулой ДНК, предоставили широкий спектр возможностей в биологических исследованиях. Однако внесение направленных изменений в определённую последовательность генома клеток или даже целых организмов долгое время казалось невыполнимой задачей. Первым методом для программируемого редактирования генома стало применение мегануклеаз, химерных нуклеаз типа «цинковые пальцы» (zing finger nucleases, ZFNs) [70] и TAL-эффекторных нуклеаз (TALENs, transcription activator-like effector nucleases) [71], которые распознавали и расщепляли молекулу ДНК в заданных участках последовательности с последующей репарацией. Однако трудности, связанные с дизайном и синтезом подобного рода химерных белков, а также недостаточная эффективность стали препятствием для их широкого распространения.

Технология CRISPR-Cas9, представляющая возможность модификации генома, разработана на основе бактериальной системы CRISPR-Cas типа II, которая обеспечивает бактерии Streptococcus pyogenes адаптивным иммунитетом к патогенным вирусам (бактериофагам) [72–74]. Отличительной чертой системы CRISPR-Cas типа II является использование лишь одного белка эндонуклеазы Cas, в то время как другие типы, I и III, используют комплексы белков [72]. С помощью системы CRISPR-Cas9 бактерия распознаёт последовательность в составе геномной ДНК бактериофага и превентивно разрезает молекулу ДНК с помощью фермента-эндонуклеазы [72]. На основе описанной «адаптивной иммунной системы» бактерии и был разработан искусственный «редактор генома» CRISPR-Cas9.

Настоящим революционным прорывом в области эффективного редактирования генома высших организмов стала адаптация системы CRISPR-Cas9 в качестве инструмента редактирования генома за счёт создания в 2012 году химерной направляющей РНК для внесения двуцепочечных разрывов в интересующую последовательность ДНК [73, 74]. Технология CRISPR-Cas9 была быстро и широко принята научным сообществом как удобный и простой метод редактирования заданных участков в составе больших и сложных геномов высших организмов [74], который может быть легко введён в рутинную работу любой современной молекулярно-биологической лаборатории. Для его реализации требуются несколько основных компонентов: 1) структура crRNA (CRISPR RNA), включающая последовательность РНК, благодаря которой происходит узнавание специфичного участка нуклеотидной последовательности; 2) направляющая РНК (tracrRNA), связывающаяся с эндонуклеазой; 3) белок Cas9, эндонуклеаза, осуществляющая сайт-специфичный двуцепочечный разрыв молекулы ДНК [74]. Впоследствии была разработана sgRNA (single guide RNA), выполняющая функции дуплекса tracrRNA/crRNA [74]. Теперь, в отличие от нуклеаз ZFNs и TALENs, которые требуют существенных затрат для конструирования белков под каждую отдельно взятую задачу, системе CRISPR-Cas9 нужны только изменения последовательности sgRNA, распознающей целевую последовательность геномной ДНК. В лабораторных исследованиях данный метод позволяет осуществлять разрыв нуклеотидной последовательности определённого участка ДНК, после чего в образовавшийся разрыв может быть встроен фрагмент практически любой нуклеотидной последовательности, включая даже целые гены [74]. Метод редактирования генома CRISPR-Cas9 можно использовать для таких целей, как внесение точечных мутаций, удаление или встраивание в определённые участки сторонних генов и их фрагментов, а также замена отдельных нуклеотидных последовательностей.

Различные способы доставки системы CRISPR-Cas9 принято делить на вирусные, включающие рекомбинантные вирусные векторы на основе аденоассоциированного вируса, лентивируса или аденовируса, и невирусные (включая физические подходы) [75]. К невирусным и физическим способам доставки системы CRISPR-Cas9 в клетки-мишени относят микроинъекции, метод электропорации, метод механической клеточной деформации, гидродинамические инъекции, а также перенос на полимерных наночастицах, липидных наночастицах, золотых наночастицах и т.д. [75]. Доступность и экономическая целесообразность невирусных систем доставки системы CRISPR-Cas9 сделали их более привлекательными для применения по сравнению с вирусными системами доставки [75]. Физические и невирусные методы доставки CRISPR-Cas9 подходят для создания модификации в клеточных линиях; для терапии in vivo их практически не применяют [76]. Напротив, вирусные системы доставки до сих пор являются наиболее эффективными системами для доставки плазмидных нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vitro и in vivo [76], несмотря на связанный с их применением повышенный риск попадания в редактируемый геном нежелательных мутаций [77–79].

При использовании системы CRISPR-Cas9 остаётся ненулевая вероятность редактирования генома за пределами целевого участка ДНК. Минимизировать потенциальные нецелевые эффекты и повысить эффективность применения CRISPR-Cas9 помогут использование парной Cas9-никазы, рациональное проектирование sgRNA и правильный подбор целевого сайта редактирования [75].

В научно-исследовательской среде технология CRISPR-Cas9 в короткие сроки получила широкое распространение и была активно внедрена в исследования в различных областях: сельское хозяйство, фундаментальная и прикладная биология, клеточная биология, регенеративная медицина, а также лечение генетических заболеваний [80–83]. Различные варианты редактирования генома применены и к задачам модификации клеточных культур с целью изучения и поиска способов регуляции течения процессов хондрогенной дифференцировки (рис. 1).

 

Рис. 1. Применение генетически модифицированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) для восстановления суставной поверхности. Схематическое изображение пошаговой работы с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками для восстановления дефекта суставной поверхности с указанием стратегий редактирования генома, направленных на увеличение эффективности клеточной терапии. FACS — fluorescence-activated cell sorting (клеточная сортировка, активируемая флуоресценцией); B2M — β2 microglobulin (β-2-микроглобулин); COL2A — collagen type II, α (коллаген типа II, субъединица α); FGF2 — fibroblast growth factor 2 (Basic) (фактор роста фибробластов 2); GDF5 — growth differentiation factor 5 (фактор роста и дифференцировки 5); HLA — human leukocyte antigen (человеческий лейкоцитарный антиген); IL-1RI — interleukin 1 receptor type 1 (рецептор интерлейкина 1, тип 1); NT4 — neurotrophin 4/5 (нейротрофический фактор 4/5); TGF-β — transforming growth factor β (трансформирующий фактор роста β); TRPV4 — transient receptor potential vanilloid 4 (катионный канал с переходным потенциалом рецептора, подсемейство V, член 4).

Fig. 1. Use of genetically modified induced pluripotent stem cells (iPSCs) for articular surface repair. Step-by-step diagram for using induced pluripotent stem cells to repair articular surface defects, highlighting genome editing strategies to enhance the efficacy of cell therapy. FACS, fluorescence-activated cell sorting; B2M, β2 microglobulin; COL2A, collagen type II, α; FGF2, fibroblast growth factor 2 (Basic); GDF5, growth differentiation factor 5; HLA, human leukocyte antigen; IL-1RI, interleukin 1 receptor type 1; NT4, neurotrophin 4/5; TGF-β, transforming growth factor β; TRPV4, transient receptor potential vanilloid 4.

 

Генетически модифицированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки как метод исследования хондрогенеза и инструмент регенеративной медицины суставов

Генетическая модификация ИПСК является относительно новым и эффективным инструментом для исследования процессов хондрогенеза и разработки восстановительной терапии в регенеративной медицине суставов. Путём активации и подавления с помощью геномного редактирования определённых сигнальных путей становится возможным контролировать эффективность хондрогенной дифференцировки, сохранять фенотип хондроцитов в процессе культивирования, регулировать чувствительность хондроцитов к провоспалительным агентам, а также моделировать генетические заболевания, связанные с нарушением процессов хондрогенеза (см. рис. 1).

Одним из препятствий для работы с ИПСК в качестве источника хондроцитов для нужд регенеративной медицины суставов является гетерогенность клеточной популяции, получаемой по завершении протокола хондрогенной дифференцировки ИПСК. Иными словами, полученные ИПСК-производные могут различаться по степени своей хондрогенной дифференцированности, а также какая-то часть клеток может пойти по пути дифференцировки в другие клеточные линии. S.S. Adkar и соавт. в 2019 году [84] предложили повысить гомогенность хондрогенной популяции, дифференцированной из линий ИПСК человека, методом отбора клеток с наилучшими хондрогенными свойствами, ориентируясь на белки-маркёры хондрогенеза. С помощью редактора CRISPR-Cas были получены генетически модифицированные линии ИПСК человека, продуцирующие зелёный флуоресцирующий белок GFP (green fluorecent protein) под промотором гена COL2A, кодирующего один из основных хондрогенных маркёров — коллаген II типа [84]. ИПСК человека, содержащие генетическую модификацию COL2A-GFP, культивировали в течение четырёх недель в хондрогенной среде. После завершения процесса дифференцировки клетки сортировали по интенсивности продуцируемого ими GFP-сигнала, контролируя однородность получаемых хондрогенных клеток. Подобная стратегия позволила авторам работы отобрать из общего пула те клетки, которые демонстрировали наилучшие хондрогенные характеристики [84]. Авторы уверены, что повышение однородности клеточной популяции ИПСК-хондроцитов позволит в будущем улучшить качество и воспроизводимость получаемых ИПСК-продуктов.

В 2020 году A. Dicks и соавт. продолжили исследования на линии ИПСК человека, содержащей генетическую модификацию COL2A-GFP [85]. Авторы предположили, что COL2A-положительные клетки, являясь «истинными» хондропрогениторами, обладают уникальным профилем поверхностных маркёров, определив который, в дальнейшем можно будет избежать генетической модификации COL2A-GFP для ИПСК-хондроцитов. Редактированные ИПСК человека культивировали в хондрогенной среде на протяжении 12 дней, после чего методом клеточной сортировки с помощью активируемой флуоресценции были отобраны клетки с высоким флуоресцентным сигналом GFP (в среднем 4,2% всех клеток). Поскольку поверхностные маркёры PDGFRβ (platelet-derived growth factor receptor β), CD146 или CD166 наиболее сильно коррелировали с экспрессией гена COL2A1, клетки были отсортированы на основе экспрессии этих маркёров. Далее был проведён анализ транскриптома полученной PDGFRβ⁺/CD146⁺/CD166⁺ популяции методом секвенирования РНК единичной клетки (scRNAseq) [85]. Анализ данных показал наличие шести субпопуляций в составе отобранных клеток. Популяция хондропрогениторов CD146⁺/CD166⁺/PDGFRβ⁺/CD45^–, составившая около 16,8% от общей популяции COL2A-GFP хондропрогениторных клеток, по заключению авторов, обладала более высоким хондрогенным потенциалом [85]. При 3D-культивировании хондропрогениторов CD146⁺/CD166⁺/PDGFRβ⁺/CD45^– в формате тканевых гранул (англ. pellets) экспрессия генов хондрогенных маркёров (SOX9, COL2A, ACAN) была выше по сравнению с аналогичной культурой несортированных COL2A-положительных клеток, однако экспрессия генов COL1A1 и COL10A1 также была выше [85]. На основе полученных данных авторы заключили, что сортировка хондрогенных предшественников, получаемых из ИПСК человека, по наличию поверхностных маркёров способствует улучшению хондрогенной дифференцировки и повышает гомогенность клеточной культуры [85].

Другой сложностью работы с хондроцитами является нестабильность их фенотипа в условиях in vitro [46, 86]. Хондроциты, созревая, перестраиваются в гипертрофированные хондроциты, что в свою очередь считается началом перехода хондроцитов в фибробластоподобные клетки или в клетки остеогенной линии [87]. Генетическая модификация ИПСК человека с помощью системы CRISPR-Cas9 была проведена T. Kamakura и соавт. с целью оценить роль коллагена Х типа, кодируемого геном COL10A1, в процессе перехода хондроцита в гипертрофированное состояние [88]. Для достижения цели исследования получены линии ИПСК человека с гетерозиготными (COL10A1⁺/^–) или гомозиготными (COL10A1^–/^–) делециями всего кодирующего участка гена COL10A1. Несколько мутантных клонов были дифференцированы в клетки с признаками гипертрофированных хондроцитов, при этом заметных различий в процессе дифференцировки между исходными и мутантными клеточными линиями не наблюдалось [88]. Чтобы оценить последствия нокаута гена COL10A1 в условиях in vivo, из ИПСК человека центрифугированием формировали гранулы (pellets) и культивировали их в хондрогенной среде для инициации дифференцировки и наработки клетками внеклеточного матрикса. На разных стадиях дифференцировки полученные клеточные гранулы трансплантировали подкожно мышам иммунодефицитной линии. Гистологическая оценка срезов тканей после имплантации, а также анализ транскриптома не выявили существенных различий между гранулами COL10A1⁺/^– и COL10A1^–/^– хондроцитов. Авторы заключили, что недостаток коллагена X типа не оказывает влияния на процессы гипертрофии ИПСК-хондроцитов, однако недостаток коллагена X типа в тканях хряща облегчает процесс дифференцировки клеток в гипертрофированные хондроциты посредством пока ещё не известного механизма [88, 89].

Переход хондроцитов в гипертрофированное состояние является важным этапом процесса эндохондрального окостенения хряща при развитии и росте скелета [90, 91]. В 2023 году A.R. Dicks и соавт. использовали генетическую модификацию ИПСК человека для моделирования молекулярных механизмов заболеваний, вызванных нарушением процесса формирования скелета [92]. Термин «скелетные дисплазии» объединяет гетерогенную группу сравнительно редко встречающихся системных нарушений остеогенеза. Мутации в ионном канале TRPV4 (transient receptor potential vanilloid 4) вызывают ряд скелетных дисплазий, однако механизмы нарушения, обусловливающие различную тяжесть заболевания, остаются неизвестными. Для прояснения молекулярных основ развития скелетных дисплазий, обусловленных мутациями в гене TRPV4, и их влияния на хондрогенную дифференцировку с помощью технологии CRISPR-Cas9 получены ИПСК человека, несущие мутацию V620I (умеренная брахиолмия) или летальную мутацию T89I (метатропическая дисплазия) [92, 93]. В ходе исследования обнаружено, что хондроциты, дифференцированные из контрольных ИПСК, активировали экспрессию генов маркёров гипертрофии в ответ на добавление к клеточной среде морфогенного фактора BMP4. Однако в мутантных хондроцитах процесс гипертрофического созревания не происходил. Результаты исследования показали, что мутации в гене TRPV4 изменяют передачу сигналов BMP в клетках и предотвращают формирование гипертрофированных хондроцитов, что является потенциальным механизмом дисфункционального развития скелета [92].

Клеточная терапия на основе хондрогенных ИПСК-продуктов нацелена на восстановление тканей, повреждённых при травмах и дегенеративных суставных заболеваниях, которые сопровождаются воспалительными процессами. Ткани повреждённого сустава активно синтезируют провоспалительные цитокины, подавляющие пролиферацию хондроцитов и инициирующие разрушение хрящевого матрикса посредством металлопротеиназ [94–96]. Препараты-антагонисты провоспалительных цитокинов могут быть эффективны, однако обладают серьёзными побочными эффектами, ограничивающими их применение [97, 98]. Например, терапия, направленная на ингибирование синтеза фактора некроза опухоли, способна вызывать у пациентов кожный васкулит, системную красную волчанку, волчанко-подобный синдром и саркоидоз [97]. Получение тканевых конструктов, устойчивых к воздействию провоспалительных агентов, ввиду вышесказанного представляется весьма актуальной задачей. Провоспалительный цитокин интерлейкин-1 (interleukin, IL-1) способен ингибировать хондрогенную дифференцировку, что приводит к деградации тканей хряща, получаемых из ИПСК [99, 100]. J.M. Brunger и соавт. [98] редактировали геном мышиных ИПСК с помощью технологии CRISPR-Cas9 для подавления влияния воспалительных процессов на клетки искусственно выращенных из ИПСК хрящевых тканей, пытаясь сохранить их хондрогенные свойства при имплантации в сустав. Авторы получили линию клеток, устойчивых к воспалительным процессам, посредством гомозиготной и гетерозиготной делеции гена IL-1RI, кодирующего рецептор IL-1 [98, 101]. Отсутствие поверхностного белка IL-1RI в отредактированных ИПСК подтверждали с помощью проточной цитометрии, а отсутствие передачи сигналов ― с помощью анализа транскрипции репортеров. Обработка цитокином IL-1 показала, что модифицированная клеточная линия IL-1RI^–/^– обладала полной невосприимчивостью к провоспалительному цитокину, в отличие от исходных клеток и клеток с гетерозиготной делецией. На основе полученных IL-1RI^–/^– ИПСК в ходе хондрогенной дифференцировки сформированы микроткани (трёхмерные клеточные гранулы), которые не были подвержены цитокин-опосредованной деградации и сохраняли экспрессию маркёров хрящевой ткани in vivo [98]. Данная исследовательская работа продвигает концепцию об эффективности и целесообразности применения генетически модифицированных ИПСК, невосприимчивых к провоспалительным цитокинам, в качестве потенциального источника стволовых клеток для инженерии хрящевой ткани [98].

Получение линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для аллогенной трансплантации хондрогенных производных

Применение ИПСК не ограничивается аутологичной трансплантацией, и роль аллотрансплантатов не следует недооценивать [102]. ИПСК способны пролиферировать и дифференцироваться в той же степени, что и ЭСК [103], однако в свете новых данных существуют обоснованные опасения, что иммуногенность аутологичных ИПСК может меняться в процессе репрограммирования и дифференцировки, вызывая иммунный ответ при трансплантации [104]. Кроме того, трудоёмкость создания и сертификации индивидуальных линий ИПСК из соматических клеток для каждого отдельного пациента требует значительных временн´ых и материальных затрат [67, 105]. В то же время способность ИПСК к самовоспроизведению и возможность длительного хранения клеток в биобанках позволяют значительно снизить стоимость и ускорить производство аллогенных ИПСК-продуктов по сравнению с персонифицированными вариантами. При этом получение аллогенных хрящевых имплантатов из сертифицированных ИПСК для широкого круга пациентов позволит решить проблемы, неразрывно связанные с «классической» трансплантацией тканей аллогенного хряща, такие как нехватка донорского материала, различия в качестве хряща между донорами и вероятность передачи заболеваний от донора к реципиенту.

Однако получить донорские клетки с соответствующим локусом главного комплекса гистосовместимости (MHC, major histocompatibility complex), чтобы избежать реакции отторжения трансплантата организмом реципиента, достаточно сложно: большое разнообразие типов белков лейкоцитарного антигена человека (HLA, human leukocyte antigen), компонентов MHC человека, является причиной сложности подбора доноров и основной причиной отторжения трансплантатов вследствие генетических различий между донором и реципиентом [106, 107].

Изобретательно к решению проблемы иммуносовместимости аллогенных ИПСК подошли в Японии (идея принадлежит профессору S. Yamanaka). В 2013 году на базе Киотского университета было инициировано создание биобанка для хранения ИПСК от доноров, гомозиготных по аллелям человеческого лейкоцитарного антигена HLA-A, HLA-B и HLA-DRB1 — трём наиболее важным элементам иммунореактивности [108]. Клетки, полученные из этих линий ИПСК, можно будет трансплантировать реципиентам, гетерозиготным по тем же гаплотипам HLA, значительно снизив риски отторжения тканей. Для населения Японии характерно низкое разнообразие гаплотипов HLA [109]. Согласно подсчётам, 140 уникальных доноров, гомозиготных по HLA, иммуносовместимы с ~90% населения Японии; и для их идентификации потребуется типировать приблизительно 160 000 человек [109]. На начало 2023 года организация CiRA (Center for iPS Cell Research and Application, Киото, Япония) сообщила о создании и клинических испытаниях линий ИПСК от семи доноров, охватывающих четыре наиболее часто встречающихся среди японцев гаплотипа HLA и покрывающих ~40% населения Японии [108]. Реализуемая Японией стратегия банкирования ИПСК, гомозиготных по HLA, эффективна для генетически однородной и/или небольшой по численности популяции, например населения Калифорнии [110] или Великобритании [111]. Однако представленный подход не применим в рамках Российской Федерации, поскольку Россия характеризуется исключительно высокой гетерогенностью как в этническом, так и в генетическом плане [112, 113], что делает подобное мероприятие дорогостоящим, а эффективность подхода — зависящей от случайного обнаружения желаемых гомозиготных гаплотипов HLA.

Другим подходом к решению проблемы иммунологической совместимости трансплантатов, произведённых из аллогенных ИПСК, является редактирование генома клеточной линии для получения ИПСК со сниженной иммуногенностью, позволяющей им быть «невидимыми» для иммунных клеток [105]. Для повышения иммуносовместимости получаемых из ИПСК хондроцитов Y. Jang и соавт. [114] нокаутировали лейкоцитарный антиген человека HLA-B в ИПСК, гомозиготных по HLA-A и гетерозиготных по HLA-B, с помощью системы CRISPR-Cas9. В результате получена гомозиготная по HLA-A линия ИПСК без HLA-B. По результатам теста на определение комплемент-опосредованной цитотоксичности модифицированные ИПСК демонстрировали меньшую иммуногенность in vitro по сравнению с контрольной группой, при этом ИПСК сохраняли плюрипотентные свойства, а также способность дифференцироваться в хондроциты in vitro и формировать тератомы in vivo [114].

Согласно опубликованным данным, хондроциты обладают иммуномодулирующим и иммуносупрессивным свойствами и способны оказывать влияние на иммунокомпетентные клетки [115]. В 2010 году H.D. Adkisson и соавт. [116] проанализировали ювенильные и взрослые хондроциты, полученные от здоровых пациентов, и пришли к выводу, что хондроциты продуцируют только молекулы MHC класса I и практически не экспрессируют на постоянной основе необходимые для Т-клеточного ответа белки MHC класса II, а также не синтезируют лиганды B7-1 (CD80) и B7-2 (CD86), стимулирующие Т-клеточный ответ через рецептор CD28 и угнетающие Т-клетки через взаимодействие с рецептором CTLA-4 (cytotoxic t-lymphocyte associated protein 4) [117]. В дополнение к этому в хондроцитах обнаружены отрицательные регуляторы иммунного ответа ChM-I (chondromodulin-I) и IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), а также конститутивная продукция LLT1 (lectin-like transcript 1), лиганда рецептора NKR-P1A (CD161), ингибирующего NK-клетки [116]. Однако молекулы MHC класса II детектируются на поверхности суставных хондроцитов у пациентов с ревматоидным артритом и остеоартритом [118].

Анализ иммуномодулирующих свойств клеточной линии первичных хондроцитов, полученных от пациентов с полидактилией, также показал, что клетки не экспрессировали молекулы MHC класса II и CD80 и CD86, но продуцировали коингибитор Т-клеточного ответа PD-L2 (CD273) [119]. Не обнаружены белки MHC класса I и II на поверхности хондроцитов, выделенных из интактных тканей артикулярного хряща быка/коровы и кролика [120].

Опираясь на ранее представленные данные, Y. Okutani и соавт. [41] выдвинули гипотезу о том, что генетически модифицированные ИПСК, не способные продуцировать молекулы МНС класса I, вследствие направленной хондрогенной дифференцировки приобретут иммуномодулирующие свойства зрелых хондроцитов, и это будет способствовать снижению цитотоксичности Т-лимфоцитов и NK-клеток при аллогенной трансплантации в суставной дефект. В своей работе Y. Okutani и соавт. [41] исследовали хондрогенные и иммуногенные свойства трёхмерных сфероидов из ИПСК, лишённых белков MHC класса I вследствие нокаута гена B2M, кодирующего β-2-микроглобулин. Нокаут в клетках по гену B2M для инактивации HLA класса I применяется достаточно часто [121–123]. Функциональные комплексы HLA класса I являются гетеродимерами и состоят из тяжёлой α-цепи с высокой степенью полиморфизма и консервативной лёгкой цепи β-2-микроглобулина. Нокаут консервативного гена B2M препятствует синтезу функционального белка и формированию гетеродимеров, позволяя «отключить» сразу все белки HLA класса I (HLA-A, -B, -C, -E, -F и -G) на поверхности клетки. Нокаутированные по B2M ИПСК приматов собирали в трёхмерные хондрогенные сфероиды для аллогенной имплантации в остеохондральный дефект коленного сустава, включив по две особи в исследуемую (B2M^−/−) и контрольную (B2M^+/+) группы [41]. Согласно данным, полученным через 4 нед после операции, имплантация хондрогенных B2M^+/+ и B2M^−/− сфероидов сопровождалась аккумуляцией иммунных клеток в области субхондральной кости у всех четырёх обезьян. При этом скопление CD3⁺ Т-лимфоцитов наблюдали преимущественно вокруг B2M^+/+ имплантатов, в то время как аккумуляция NKG2A-позитивных NK-клеток преобладала в группе B2M^−/− [41].

Полученные результаты согласуются с другими научными работами [124], которые подтверждают, что инактивация гена B2M в клетках при аллогенной трансплантации предотвращает инфильтрацию цитотоксических T-клеток путём истощения всех молекул HLA класса I, однако отсутствие белков HLA на поверхности клеток активирует иммунный ответ NK-клеток [66]. Известно, что на поверхности NK-клеток располагаются ингибирующие рецепторы KIR (killer cell immunoglobulin-like receptor), для которых молекулы HLA класса I являются лигандами (HLA-E, HLA-C и часть HLA-B у человека [125]). Когда NK-клетки распознают эти лиганды на соматических клетках, цитотоксическая активность NK-клеток подавляется ингибирующими сигналами [124]. Этот феномен известен как механизм распознавания «отсутствие своего» (“missing-self recognition”) [126].

Сегодня для индукции иммунной толерантности к аллогенным трансплантатам предлагается стратегия создания ИПСК путём разрушения обоих аллелей HLA-А и HLA-B с сохранением HLA-С, что позволяет уклоняться от Т-клеток и NK-клеток in vitro и in vivo [127]. Согласно подсчётам, при дополнении таких генетически модифицированных ИПСК нокаутом по HLA класса II (например, через инактивацию гена, кодирующего CIITA (class II major histocompatibility complex transactivator) [121, 123, 128, 129]), набора всего из 12 клеточных линий (соответствующих 12 гаплотипам HLA-C), будет достаточно для иммунологической совместимости с ≈90% населения мира [123, 127].

В качестве альтернативной стратегии получения гипоиммуногенных ИПСК, в дополнение к инактивации MHC класса I и II, применяют регуляцию экспрессии трансмембранного белка CD47 [105], одна из функций которого заключается в ингибировании активации NK-клеток. Продемонстрировано, что при аллогенной трансплантации инактивация MHC класса I и II в ИПСК, дополненная усилением экспрессии CD47 через лентивирусную трансдукцию, значительно снижает иммуногенность полученных линий на примере ИПСК мышей, приматов и человека даже в условиях отсутствия иммуносупрессивной терапии [128, 130].

Инженерия гипоиммунных ИПСК и их производных, нацеленная на избегание иммунного распознавания с помощью врождённого и адаптивного иммунитета, на сегодня видится крайне перспективной стратегией для реализации терапии на основе аллогенной трансплантации в клинической практике. Однако стоит помнить, что помимо онкогенности и туморогенности, присущих самим ИПСК, редактирование их генома с помощью CRISPR-Cas может дополнительно приводить к непредвиденным мутациям как в целевом, так и в нецелевых участках генома [131–134]. Сегодня продолжает развиваться и методологическая база для выявления приобретаемых отредактированными линиями ИПСК возможных генетических дефектов, таких как инсерции, микроделеции и потеря гетерозиготности, тем самым улучшая профили безопасности и эффективности применения CRISPR-Cas-редактирования к ИПСК [131, 135, 136]. Важно отметить, что лучшая выживаемость иммунотолерантных ИПСК-производных вследствие ухода от иммунного надзора потенциально может создавать угрозу роста опухолей, «невидимых» для иммунной системы реципиента [137]. С учётом вышесказанного тщательная проверка и сертификация ИПСК и ИПСК-продуктов, получаемых для решения терапевтических задач, требуют значительных затрат времени и ресурсов, но являются обязательными шагами в работе с генетически модифицированным трансплантационным материалом [69].

Заключение

В настоящее время технологии в биомедицине развиваются стремительно. Технология получения линий ИПСК, содержащих требуемую генетическую модификацию, расширяет горизонты в области регенеративной и персонифицированной медицины. Модификация ИПСК позволяет решать сложные биологические задачи, связанные с аутологичной и аллогенной трансплантацией. Редактирование генома даёт возможность получать линии ИПСК, «склонные» к хондрогенной дифференцировке, либо линии ИПСК, способные при культивировании препятствовать формированию гипертрофированных хондроцитов из хондропрогениторов, что позволяет приблизиться к решению непосредственно прикладных медицинских задач, а также отыскать мишени, облегчающие и/или стимулирующие хондрогенез в условиях in vitro и впоследствии — in vivo.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Научное исследование проведено при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-75-10082).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Н.С. Гаврилов — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; Н.В. Игнатьева — концепция научной работы, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; Е.В. Медведева — концепция научной работы, анализ литературных источников, написание текста статьи, редактирование текста с внесением ценного интеллектуального содержания; П.С. Тимашев — критический анализ работы, редактирование текста с внесением ценного интеллектуального содержания.

Additional informaion

Funding source. This work was supported by the Russian Science Foundation (grant number 21-75-10082).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication). N.S. Gavrilov — literature review, collection and analysis of literary sources, preparation and writing of the text of the article; N.V. Ignatyeva — conceptualization, literature review, collection and analysis of literary sources, preparation and writing of the text of the article; E.V. Medvedeva — conceptualization, analysis of literary sources, writing the text, review and editing of the article; P.S. Timashev — review and editing of the article.

About the authors

Nikita S. Gavrilov

The First Sechenov Moscow State Medical University

Email: gavrilovns2001@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-3062-5251
Russian Federation, 8 bldg. 2 Trubetskaya street, 119048 Moscow

Nadezda V. Ignatyeva

The First Sechenov Moscow State Medical University

Author for correspondence.
Email: ignateva_n_v_1@staff.sechenov.ru
ORCID iD: 0009-0008-4421-0495
SPIN-code: 9964-2485

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, 8 bldg. 2 Trubetskaya street, 119048 Moscow

Ekaterina V. Medvedeva

The First Sechenov Moscow State Medical University

Email: medvedevaekaterina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6263-0986
SPIN-code: 1413-5899

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, 8 bldg. 2 Trubetskaya street, 119048 Moscow

Peter S. Timashev

The First Sechenov Moscow State Medical University

Email: timashev_p_s@staff.sechenov.ru
ORCID iD: 0000-0001-7773-2435
SPIN-code: 4836-2560

Dr. Sci. (Chemistry), Associate Professor

Russian Federation, 119048, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

References

Supplementary files