Изменения в морфогенез створки Aulacoseira islandica под влиянием ингибитора γ-тубулина гатастатина

Полный текст

1. Введение

Диатомовые водоросли – одноклеточные эукариоты, принадлежащие к царству Chromista (Cavalier-Smith, 2018); морфология их кремнеземных панцирей очень разнообразна (Round et al., 1990). Систематика диатомей основана на морфологии панцирей и филогении маркерных генов, таких как 18S rRNA и rbcL (Medlin and Kaczmarska, 2004; Theriot et al., 2010). Их кремнеземные панцири состоят из двух створок и системы взаимно перекрывающихся кольцевых поясковых ободков (Pickett-Heaps et al., 1990). Детали панциря синтезируются последовательно в течение клеточного цикла; после митоза происходит морфогенез створки, а поясковые ободки формируются на протяжении интерфазы.

Усилия многих исследователей направлены на поиск генетических и клеточных механизмов, обеспечивающих видовые различия симметрии и строения панцирей диатомей. Известно, что морфогенез створок находится под контролем цитоскелета и роль микротрубочек наиболее изучена (Tesson and Hildebrand, 2010; Bedoshvili and Likhoshway, 2021). Правильное функционирование микротрубочек основано на динамической полимеризации/деполимеризации α- и β-тубулина (Mitchison and Kirschner, 1984; Caudron et al., 2005). Показано, что обработка клеток диатомей ингибиторами микротрубочек приводит к различным аномалиям их створок (Oey and Schnepf, 1970; Cohn et al., 1989; Van de Meene and Pickett-Heaps, 2002; Van de Meene and Pickett-Heaps, 2004; Kharitonenko et al., 2015; Bedoshvili et al., 2018). Колхицин способен остановить деление клетки, однако, для некоторых видов было показано, что морфогенез створки все равно происходит. Так под влиянием колхицина клетки центрических диатомей Cyclotella cryptica и Aulacoseira islandica (Oey and Schnepf, 1970; Bedoshvili et al., 2018) формируют «латеральные» створки, морфология которых сходна с нормальной, однако их лицевая часть прижата к зрелым поясковым ободкам. Предполагалось, что такая морфология становится возможной при нарушении работы микротрубочек под влиянием колхицина в начале митоза (Bedoshvili et al., 2018). После обработки колхицином в клетках происходят нарушения в кариокинезе и цитокинезе, что приводит к формированию латеральной створки в клетке с единственным ядром неправильной формы.

Формирование микротрубочек (и их нуклеация) происходят в клетке не случайным образом, а под контролем специализированного сайта в клетке – микротрубочкового организующего центра (МТОЦ). Диатомовые водоросли имеют специфический ацентриолярный МТОЦ с атипичными особенностями (De Martino et al., 2009). Морфология МТОЦ может быть разнообразной, однако, в основе его структуры лежит γ-тубулин, формирующий крупные комплексы с другими белками (Zheng et al., 1995; Oegema et al., 1999). Эти комплексы не включают в себя α- и β-тубулин, а присутствие в них γ-тубулина является обязательным условием для нуклеации микротрубочек. Ранее было показано, что геном диатомей содержит гены α-, β- и γ-тубулинов (De Martino et al., 2009; Aumeier, 2012; Findeisen et al., 2014). Более детальный анализ позволил идентифицировать структурные особенности предсказанных аминокислотных последовательностей γ-тубулина диатомовых водорослей (Khabudaev et al., 2022), но его значение для морфогенеза кремнеземных створок не было показано.

Гатастатин – недавно синтезированный антиопухолевый препарат, способный связываться с γ-тубулином и блокировать нуклеацию микротрубочек, не оказывая существенного влияния на α- и β-тубулин (Hayakawa et al., 2012). Использование гатастатина позволяет показать роль γ-тубулина в морфогенезе створки диатомовых водорослей. Пресноводная диатомея Aulacoseira islandica оказалась удобной моделью для исследования нарушений морфологии створок благодаря высокому загибу створки и крупным поясковым ободкам. Основной целью настоящей работы было исследование роли γ-тубулина в морфогенезе створки A. islandica.

2. Материалы и методы

2.1. Культивирование

Штамм Aulacoseira islandica Mr553 был выделен из природной популяции оз. Байкал и культивировался в среде DM (Thompson et al., 1988) при 4°С, естественном освещении и циклами день-ночь. Процедуру выделения и культивирования проводили согласно опубликованной ранее методике (Zakharova et al., 2020).

2.2. Скнирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Панцири обрабатывали согласно протоколу, описанному ранее (Kharitonenko et al., 2015). Суспензию очищенных панцирей наносили на покровное стекло, высушивали и размещали на столике для СЭМ с помощью двустороннего углеродного скотча (SPI Supplies, West Chester, USA). Анализ морфологии проводили с использованием сканирующего электронного микроскопа QUANTA 200 (FEI Company, Hillsboro, USA).

2.3. Обработка гатастатином

Культуру A. islandica инкубировали в присутствии гатастатина в течение 48 часов. Концентрации гатастатина выбирали согласно опубликованным данным литературы и рекомендациям производителя (10, 3, 0.3 и 0.03 мкМ). Клетки инкубировали в присутствии PDMPO (Thermo Fisher Scientific, USA) для визуализации формирующихся кремнеземных панцирей. Все эксперименты проводили в трех повторностях. По окончании эксперимента клетки фиксировали параформальдегидом (конечная концентрация в среде – 4 %) в течение 2 часов, после этого отмывали фосфатным буфером (0,1 M, pH 7) и монтировали на предметном стекле в среде Mowiol® 40-88 (Sigma-Aldrich, Germany) для флуоресцентной и лазерной сканирующей микроскопии.

Клетки, формирующие детали панциря (створки сразу после деления или поясковые ободки в течение интерфазы) считали среди 100 случайно встреченных клеток. Клетки без внутреннего содержимого и флуоресценции хлоропластов или PDMPO считали в качестве погибших. Подсчет проводили на оптическом микроскопе Axiovert 200, оснащенном синим фильтром для света с длиной волны 546 нм.

2.4. Иммуноокрашивание и сканирующая лазерная микроскопия (ЛСМ)

Для локализации α-тубулина использовали протокол, предложенный ранее, с модификациями (Pasternak et al., 2015). Клетки в культуре фиксировали 2 % раствором параформальдегида с добавлением 0,1% Triton X-100 в буфере, стабилизирующем микротрубочки (МТСБ – PIPES 0,1M, EGTA 0,01M, MgSO₄*7H₂O 0,01M, KOH 0,1M, pH 7) в течение 20 мин, отмывали тем же буфером и пермеабилизировали в растворе 1% Triton X-100 и 10% DMSO в течение 20 мин при 37 °C. Блокирование проводили в 2% растворе БСА на МТСБ. Для локализации α-тубулина использовали моноклональные антитела к фрагменту α-тубулина цыпленка 426-450 a.о., конъюгированные с Alexa488 (Alexa Fluor® 488 Anti-alpha Tubulin antibody [DM1A] (ab195887), Abcam). Клетки инкубировали с антителами в разведении 1:200 в течение 2 ч при 37°C, после чего отмывали буфером, дополнительно окрашивали DAPI (10 мкг/мл в течение 10 мин) и монтировали на предметные стекла в среде Mowiol® 4-88 (Sigma-Aldrich, Germany).

Препараты исследовали на лазерном сканирующем микроскопе LSM 710 (Zeiss) с иммерсионным объективом Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 (Zeiss). Автофлуоресценцию хлоропластов возбуждали лазером с длиной волны 561 нм; эмиссию регистрировали в диапазоне 650-723 нм. Флуоресценцию Alexa488 возбуждали лазером с длиной волны 488 нм; эмиссию регистрировали в диапазоне 496-647 нм. Флуоресценцию DAPI возбуждали лазером с длиной волны 405 нм; эмиссию регистрировали в диапазоне 410-492 нм. Трехмерные реконструкции были получены из 100 оптических срезов (толщина по оси z 15-30 мкм). Флуоресценцию PDMPO возбуждали лазером с длиной волны 405 нм, эмиссию регистрировали в диапазоне 441-587 нм. Трехмерные реконструкции были получены из 100 оптических срезов (толщина по оси z 15-70 мкм).

3. Результаты

На Рисунке 1 представлена электронная микроскопия панцирей штамма A. islandica 3Mr553. Для исследованного штамма характерно формирование створок с разной высотой загиба у сестринских клеток (Рис. 1A). Все створки имели лопастевидные соединительные шипы и упорядоченные ряды ареол (Рис. 1Б). Поясковые ободки покрывающие створки от начала формирования до следующего деления в некоторых случаях были упакованы настолько плотно, что оставались на створках даже после многостадийной химической (Рис. 1В).

 

Рис.1. Тонкая структура створок и поясковых ободков A. islandica штамм 3Mr553 (СЭМ). Масштаб: А – 5 мкм; Б, В – 1 мкм.

 

В клетках исследованного штамма α-тубулин был локализован в интерфазе и на ранней стадии формирования створки (Рис. 2). Для клеток в интерфазе было характерно звездообразное распределение микротрубочек, их крупные пучки расходились от центра, прижатого к ядру, и косвенно указывали на расположение микротрубочкового центра (Рис. 2A). Тяжи микротрубочек у A. islandica локализовались в тонком слое цитоплазмы и часто для их визуализации было достаточно одного оптического слоя. На ранних стадиях морфогенеза створки упаковка микротрубочек не была настолько плотной, чтобы быть видимой, и крупные тяжи микротрубочек не были обнаружены (Рис. 2Б).

 

Рис.2. Визуализация α-тубулина на ранней стадии формирования створки и в интерфазе на оптических срезах (А, Б) и трехмерных реконструкциях (А-1, Б-1) в клетках A. islandica (ЛСМ). Зеленый – флуоресценция Alexa-488 после окрашивания α-тубулина, синий – флуоресценция DAPI, красный – автофлуоресценция хлорофилла. Масштаб: А, Б – 10 мкм; А-1, Б-1 – 2 мкм.

 

Трехмерные реконструкции створок и поясковых ободков A. islandica, сформированных во время эксперимента и окрашенных PDMPO, представлены на Рисунке 3. За время эксперимента клетки были способны синтезировать от одного до трех поясковых ободков. Среди створок, сформированных в присутствии гатастатина, наблюдались нарушения морфологии. На Рисунке 3 представлены основные зарегистрированные аномалии строения: изменения в строении соединительных шипов (или их отсутствие) и в редких случаях нарушение стриации (неупорядоченные ряды ареол).

 

Рис.3. Створки (слева) и поясковые ободки (справа) A. islandica, сформированные под влиянием гатастатина в разных концентрациях (указаны слева) (ЛСМ, трехмерная реконструкция). Масштаб – 2 мкм.

 

Для исследованного штамма было характерно присутствие в культуре не менее 30 % погибших клеток (Рис. 4). Большинство клеток активно формировали створки и поясковые ободки. При всех концентрациях гатастатина количество мертвых клеток было выше, чем в контроле. Наиболее низким было количество сформированных створок при концентрациях гатастатина 3 и 10 мкM, тогда как при концентрации от 0,03 до 3 мкM количество поясковых ободков оставалось ниже, чем в контроле, но было почти одинаковым (Рис. 4). При концентрациях 3 и 10 мкM, все сформированные створки имели изменения в морфологии.

 

Рис.4. Морфогенез створок и поясковых ободков A. islandica под влиянием гатастатина.

 

4. Обсуждение

Ранее было показано, что γ-тубулин у диатомей представлен в их микротрубочкоом центре (Craticula cuspidata – Aumeier, 2012). Однако даже в крупных клетках некоторых диатомей визуализция γ-тубулина затруднена небольшими размерами микротрубочкового центра. Из всех тубулинов диатомовых водорослей γ-тубулин наименее консервативен (Khabudaev et al., 2022), по этой причине его сложно визуализировать с помощью антител к γ-тубулину других организмов. Несмотря на то, что главная часть МТОЦ представлена γ-тубулином и белками комплекса γ-тубулина, локализация α-тубулина позволяет косвенно определить расположение МТОЦ в клетках A. islandica и показать степень полимеризации микротрубочек. Для крупных клеток диатомовых водорослей, в том числе для Coscinodiscus granii (Tesson and Hildebrand, 2010), тяжи микротрубочек были описаны ранее для клеток, проходящих морфогенез створки, а не для находящихся в интерфазе. Вероятно, это отличие обусловлено небольшим объемом цитоплазмы клеток A. islandica в сравнении с C. granii.

Как уже упоминалось, тубулины высоко консервативные белки, и фрагмент последовательности α-тубулина (426-450 а.о.) идентичен гомологичной последовательности α-тубулина цыпленка, к которому были получены антитела (Khabudaev et al., 2022). Таким образом несмотря на то, что последовательность α-тубулина A. islandica получена не была, нет сомнений в идентификации локализованного белка (Рис. 2).

Электронная микроскопия позволяет описать структуру зрелых створок, однако, различные стадии морфогенеза створки остаются в основном недоступными для исследования, даже несмотря на очистку панцирей от органического вещества, так как формирующиеся створки закрыты поясковыми ободками на протяжение морфогенеза и всего клеточного цикла. Из-за краткого времени экспозиции с гатастатином (48 ч) большинство створок сформированных под его влиянием остаются скрытыми для исследования с помощью СЭМ. Использование прижизненных красителей и лазерной сканирующей микроскопии позволяет наблюдать развивающиеся створки в виде трехмерной реконструкции. Этот метод сделал возможным точно определить створки, формирующиеся именно в текущем эксперименте.

Ранее было показано, что под влиянием колхицина клетки A. islandica формируют створки с единственным центром симметрии в результате нарушенного цитокинеза. В этом случае происходит морфогенез створки, которая располагается как гигантский поясковый ободок (Bedoshvili et al., 2018). Колхицин не вызывал высокую смертность в культуре при выскоих концентрациях (20 и 40 мкг/мл) в отличие от гатастатина. Результаты настоящего исследования показали, что эффект гатастатина является причиной не столько формирования створок с аномальной морфологией, сколько останавливает деление, при этом блокируя морфогенез створки. Также под действием гатастатина не происходит формирование латеральных створок, что может указывать на невозможность морфогенеза створки без участия микротрубочкового центра у A. islandica.

Известно, что гатастатин способен связываться не только с γ-тубулином, но также с α- и β-тубулином, однако, константа диссоциации с последними выше более, чем в 10 раз (Chinen et al., 2015). Вероятно, аномалии морфологии створок связаны главным образом с этим, а так как формирование соединительных шипов у A. islandica происходит на протяжении всего морфогенеза (Bedoshvili et al., 2018), то эти структуры являются наиболее чувствительными к различным воздействиям.

5. Заключение

Специфическое окрашивание позволило локализовать α-тубулин в клетках A. islandica в время морфогенеза створки и в интерфазе. Центр нуклеации микротрубочек был визуализирован рядом с ядром. Ингибирование γ-тубулина с помощью гатастатина вызывало снижение количества клеток, формирующих створки, что предполагает необходимость функционирующего микротрубочкового центра для начала морфогенеза. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что микротрубочковый центр важная структура не только в клеточном делении, но и для инициации морфогенеза створки.

Благодарности

Исследование было поддержано Российским научным фондом, проект № 22-24-00080. Микроскопия проводилась в центре коллективного пользования «Ультрамикроанализ» ЛИН СО РАН, https://www.lin.irk.ru/copp/.

Об авторах

Е. Д. Бедошвили

Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: bedoshvilied@list.ru
Россия, ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

Э. М. Байрамова

Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук

Email: bedoshvilied@list.ru
Россия, ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

Ю. Р. Захарова

Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук

Email: bedoshvilied@list.ru
Россия, ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

Список литературы

Дополнительные файлы