The first detection of coccidia (Conoidasida: Eimeriidae) DNA in Godlewski’s sculpin  Abyssocottus  ( Limnocottus )  godlewskii  (Dybowski, 1874)

E. V. Dzyuba; Дзюба Е. В.; Yu. S. Bukin; Букин Ю. С.; I. V. Khanaev; Ханаев И. В.; B. E. Bogdanov; Богданов Б. Э.; A. S. Yakhnenko; Яхненко А. С.; Yu. P. Sapozhnikova; Сапожникова Ю. П.; N. N. Denikina; Деникина Н. Н.

doi:10.31951/2658-3518-2024-A-5-1206

Первое обнаружение ДНК кокцидий (Conoidasida: Eimeriidae) у широколобки Годлевского Abyssocottus (Limnocottus) godlewskii (Dybowski, 1874)

Авторы: Дзюба Е.В.¹, Букин Ю.С.¹, Ханаев И.В.¹, Богданов Б.Э.¹, Яхненко А.С.¹, Сапожникова Ю.П.¹, Деникина Н.Н.¹
Учреждения:
1. Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук
Выпуск: № 5 (2024)
Страницы: 1206-1218
Раздел: Статьи
URL: https://bakhtiniada.ru/2658-3518/article/view/282693
DOI: https://doi.org/10.31951/2658-3518-2024-A-5-1206
ID: 282693

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Впервые в пищеварительном тракте широколобки Годлевского Abyssocottus (Limnocottus) godlewskii (Dybowski, 1874) методом высокопроизводительного секвенирования получены фрагменты гена cox1 представителя семейства Eimeriidae. Детектированные нуклеотидные последовательности кокцидий составили <0,01% от общего массива данных и принадлежали единственному генотипу, достоверно отличавшемуся от всех ранее известных. Филогенетическая реконструкция на основании транслированных аминокислотных последовательностей достоверно продемонстрировала базальное расположение ветвей представителей сем. Eimeriidae из рыб. Вопрос о родовой принадлежности детектированного организма остается открытым из-за недостаточного количества нуклеотидных данных представителей родов Eimeria, Calyptospora и Goussia из рыб.

Ключевые слова

Eimeriidae, Abyssocottus (Limnocottus) godlewskii (Dybowski, 1874), ген cox1, озеро Байкал

Полный текст

1. Введение

Анализ фауны паразитов рыб является необходимой частью исследований, посвященных вопросам их экологии. Преимущество молекулярно-генетического подхода с использованием современных технологий высокопроизводительного секвенирования заключается в возможности анализа и идентификации относительно коротких фрагментов чужеродной ДНК из содержимого пищеварительного тракта, органов и тканей рыб. Эти методы эффективны за счет высокого разрешения и возможности идентификации широкого спектра видов (Harms-Tuohy et al., 2016; Jakubavičiūtė et al., 2017; Yoon et al., 2017). Несмотря на ряд недостатков, таких как неточная идентификация видов из-за отсутствия их генетических данных в общедоступных базах (Siddall et al., 2012; Kvist, 2013) и детекция ДНК организмов из пищеварительных трактов кормовых объектов (Sakaguchi et al., 2017), метабаркодирование может дополнять традиционные методы исследования фауны паразитов рыб (Ogedengbe et al., 2011; Villsen et al., 2022; Деникина и др., 2023a; b).

Все представители типа простейших Sporozoa или Apicomplexa из группы Alveolata являются одноклеточными облигатными паразитами многоклеточных животных, а также считаются одними из самых успешных паразитов в мире (Morrison, 2009). Предполагается, что более 6000 описанных видов составляют всего 0,1% от общего их разнообразия (Morrison, 2009). Представители родов Cryptosporidium, Plasmodium, Toxoplasma и Babesia являются возбудителями заболеваний человека и животных. Кокцидии (Conoidasida: Eimeriidae) наносят значительный урон сельскохозяйственному производству. Несмотря на широкое распространение и хозяйственное значение, исследования эволюционных отношений внутри этой группы только начинаются (Arisue and Hashimoto, 2015; Xavier et al., 2018). Таксономия кокцидий к настоящему времени находится в стадии разработки, многие роды являются парафилетическими, что ставит под сомнение ценность строгих морфологических и экологических признаков для их классификации (Ogedengbe et al., 2018; Xavier et al., 2018). При этом представители семейства Eimeriidae у водных животных изучены значительно хуже, чем у наземных. Однако, даже имеющиеся скудные данные о последовательностях малой субъединицы рибосомальной РНК (МСЕ рРНК) позволяют предположить, что именно они являются базовыми группами внутри семейств (Jirků et al., 2009; Xavier et al., 2018; Деникина и др., 2023b). В настоящее время в базе NCBI зарегистрированы последовательности гена cox1 мтДНК Eimeriidae из следующих видов рыб: красногубая морская собачка Ophioblennius macclurei (Silvester, 1915), белый американский лаврак Morone americana (Gmelin, 1789) и обыкновенная верховка Leucaspius delineatus (Heckel, 1843).

Широколобка Годлевского Abyssocottus (Limnocottus) godlewskii (Dybowski, 1874) – эндемичный вид озерных широколобок, обитающий на глубинах от 100 до 900 м (Богданов, 2023). Сложности в исследованиях экологии и фауны паразитов глубоководных видов вызваны малым количеством выборок рыб в связи с трудоемким процессом отлова. В результате исследования пищевого спектра широколобки Годлевского с использованием методов секвенирования нового поколения были получены последовательности кокцидий. Целью работы являлось определение филогенетического положения представителя сем. Eimeriidae из пищеварительного тракта широколобки Годлевского.

2. Материалы и методы

Сбор проб осуществляли с борта научно-исследовательского судна «Г.Ю. Верещагин» в сентябре 2019 г. в районе створа Чивыркуйского залива озера Байкал (53°59.674’N, 109°09.086’E) с глубин от 790 до 820 м. Видовую принадлежность рыб идентифицировали в соответствии с последними ревизиями (Богданов, 2017; 2023). Для анализа использовали пять особей широколобки Годлевского массой от 8,7 до 28,5 г, общей длиной от 95 до 149 мм.

В лабораторных условиях содержимое всего пищеварительного тракта (250-700 мкл) от каждого отдельно взятого экземпляра разводили равным объемом воды mQ, измельчали и тщательно перемешивали. Суммарную ДНК выделяли с помощью набора для экстракции «АмплиСенс ДНК-сорб-АМ» (Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагмент гена cox1 длиной приблизительно 350 пар оснований амплифицировали для каждой пробы 30 циклов с понижением температуры отжига на 0.3°C от начальных 55°C с праймерами MiSeq: COIintF 5´tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC и dgHCO2198 5´gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagTAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA (Leray et al., 2013). Все ампликоны из пищеварительного тракта объединяли и использовали для подготовки пробы к секвенированию.

Библиотеку из очищенного пула ампликонов сконструировали с использованием набора Nextera XT (Illumina, Хейворд, Калифорния, США), нуклеотидные последовательности определяли с помощью Illumina NextSeq. Регистрационный номер полученных данных в международной базе NCBI: PRJNA1086215.

Все исходные данные триммировали по качеству в программе Trimmomatic V 0.39 (Bolger et al., 2014) с опциями: среднее качество прочтения 20, минимальная длина прочтения 140. Сборку исходных прочтений в контиги, соответствующие полноразмерным продуктам амплификации, проводили в программе metaSPAdes (Nurk et al., 2017) длинами k-mer 21, 33, 55, 77, 99 и 121. Выбранные длины k-mer позволили привести агрегацию в единые контиги только прочтений, специфичных первоначальным фрагментам cox1 смеси ДНК различных видов метагеномного образца.

В качестве референсной базы данных для таксономического анализа использовали полный набор последовательностей маркера cox1 из International Barcode of Life Database (iBOL) (https://ibol.org/). Последовательности ДНК сборки ампликонов сопоставляли с референсной базой данных с помощью приложения local BLASTn (Altschul et al., 1990). Результаты BLAST анализа преобразовывали в таблицу представленности таксонов в ДНК содержимого пищевого тракта хозяина. Первичную обработку полученных нуклеотидных последовательностей представителей семейства Eimeriidae и соответствующих данных, представленных в базе NCBI (Таблица 1), проводили в редакторе BioEdit, выравнивали с помощью программы ClustalW. Последовательность зарегистрирована в NCBI № PP552829. Филогенетический анализ, включая выбор моделей для оценки эволюционной дивергенции и реконструкции эволюционной истории, проводили с использованием программы MEGA7 (Kumar et al., 2016). Эволюционную дивергенцию между группами последовательностей оценивали методом максимального правдоподобия по модели Тамуры-Нея (TN DNA evolutionary model) (Tamura and Nei, 1993). Филогенетическую реконструкцию эволюционной истории, основанной на аминокислотных последовательностях, проводили методом максимального правдоподобия по модели Ли-Гаскуэля с гамма коррекцией различий в скоростях накопления замен в различных сайтах (LG + G protein evolutionary model) (Nei and Kumar, 2000; Le and Gascuel, 2008). Тестирование достоверности топологии филогенетических деревьев проводилось непараметрическим бустером (1000 реплик).

Таблица 1. Номера нуклеотидных последовательностей гена cox1 из базы данных NCBI, использованные в анализе.

Хозяин	№№ NCBI; вид
Mammalia: Placentalia	MN260359; MN260361; MN260362; MN260363; MN260364; MN316534; MN316535; Cyclospora cayetanensis Ortega, Gilman & Sterling, 1994
	KP025693; Eimeria flavescens Marotel & Guilhon, 1941
	KT203398; Eimeria mephitidis Andrews 1928
	JQ993698; Eimeria piriformis Kotlan & Pospesch, 1934
	HM771687; KX495130; OL770312; Eimeria zuernii (Rivolta, 1878) Martin, 1909
	MN077082; Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1908)
Mammalia: Marsupialia	MK202809; Eimeria gaimardi Barker, O’Callaghan, and Beveridge, 1988
	MK202808; Eimeria mundayi Barker, O’Callaghan, and Beveridge, 1988
	MK202807; Eimeria potoroi Barker, O’Callaghan, and Beveridge, 1988
	JN192136; Eimeria trichosuri O’Callaghan & O’Donoghue, 2001
	MK202806; Eimeria woyliei Northover et al., 2019
Reptilia	KF859856; Caryospora bigenetica Wacha and Christiensen, 1982
	KR108297; MW720599; Isospora amphiboluri Cannon, 1967
	MW720599; Isospora lunulatae Yang, Brice, Berto & Zahedid, 2021
Aves	EF158855; Eimeria acervulina Tyzzer, 1929
	MH758793; Eimeria anseris (Kotlan, 1932)
	HM771675; Eimeria brunetti Levine, 1942
	JQ659301; KX094945; Eimeria praecox Johnson, 1930
	MF497440; Eimeria tenella (Railliet & Lucet, 1891) Fantham, 1909
	KC346355; Isospora gryphoni Olson, Gissing, Barta & Middleton, 1998
	KT224377; Isospora manorinae Yang, Brice, Jian & Ryan 2016
	NC_065382; Isospora picoflavae Rejman, Hak-Kovacs & Barta, 2021
	ON584773; Isospora serini (Aragao, 1933)
	KX276860; Isospora serinuse Yang, Brice, Elliot & Ryan 2015
Amphibia	KT184381; Lankesterella minima (Chaussat, 1850) Nöller, 1912
Actinopteri	PP590353; PP590354; PP590355; PP590356; Eimeriidae
Actinopteri	MH792860; Goussia bayae Matsche, Adams & Blazer, 2019

3. Результаты и обсуждение

В результате анализа данных метагеномного секвенирования ДНК содержимого пищеварительных трактов широколобки Годлевского были детектированы последовательности представителей сем. Eimeriidae с относительной представленностью <0,01%. Полученные последовательности принадлежали единственному гаплотипу, достоверно отличающемуся от всех известных последовательностей гена cox1 кокцидий, включая G. bayae и Eimeriidae из обыкновенной верховки, и продемонстрировавшему наибольшую степень гомологии (86,71%) с нуклеотидными последовательностями Cyclospora cayetanensis Ortega, Gilman & Sterling, 1994.

Кокцидии рыб сравнительно малоизучены и нуклеотидные данные для них крайне скудны. Кроме последовательностей гена cox1 мтДНК из обыкновенной верховки, полученных нами ранее в аналогичном эксперименте (Деникина и др., 2023b), в базе NCBI представлены только две последовательности представителей сем. Eimeriidae из рыб: G. bayae из желчного пузыря M. americana (Matsche et al., 2019) и последовательность из крови O. macclurei. Однако последняя, заявленная как Coccidia sp. (NCBI: OR822199.1), в действительности принадлежит представителю клады новой широко распространенной группы паразитов рыб типа Apicomplexa, сестринской отряду Corallicolida и названная авторами «ichthyocolids» (Bonacolta et al., 2024). Исходя из вышесказанного, эти данные в филогенетическом анализе не рассматривали. При построении филогенетического древа использованы данные представителей сем. Eimeriidae позвоночных животных, в качестве аут-группы представлена последовательность гена cox1 мтДНК Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1908) (Таблица 1, Рис. 1).

Рис.1. Филогенетическое древо представителей семейства Eimeriidae, построенное методом максимального правдоподобия на основании транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов гена cox1 мтДНК. В качестве аут-группы – T. gondii

Следует отметить, что для всех имеющихся в настоящее время последовательностей сем. Eimeriidae из рыб, ближайшими гомологами являются последовательности паразитов из теплокровных животных и птиц: G. bayae гомологична Choleoeimeria taggarti (Amery-Gale et al., 2018) Kruth, Michel, Amery-Gale & Barta, 2020 (79,33%, NCBI: MK813349) из желтоногой сумчатой мыши Antechinus flavipes flavipes Waterhouse, 1838. Представители сем. Eimeriidae из обыкновенной верховки наиболее близки к Eimeria praecox (Johnson, 1938) (82,95%, NCBI: KX094945) из банкивской джунглевой курицы Gallus gallus (Linnaeus, 1758); Isospora serini (Aragao, 1933) (84,62%, NCBI: ON584773) и Isospora serinuse (Yang, Brice, Elliot & Ryan 2015) (82,37%; NCBI: KX276860) из канарского канареечного вьюрка Serinus canaria (Linnaeus, 1758). Анализ эволюционной дивергенции между группами нуклеотидных последовательностей выявил близость представителей Eimeriidae из широколобки Годлевского к паразитам сумчатых животных (Таблица 2).

Таблица 2. Оценка эволюционной дивергенции между группами последовательностей. Стандартные погрешности показаны над диагональю

	1	2	3	4	5	6	7
1. Eimeriidae (Abyssocottus godlewskii)		0,029	0,062	0,019	0,020	0,022	0,076
2. Eimeriidae (Leucaspius delineatus)	0,119		0,047	0,026	0,024	0,021	0,069
3. Goussia bayae	0,385	0,271		0,053	0,049	0,050	0,065
4. Mammalia: Marsupialia	0,061	0,105	0,315		0,010	0,012	0,077
5. Reptilia+ Amphibia	0,070	0,102	0,293	0,020		0,004	0,068
6. Mammalia: Placentalia + Aves	0,087	0,089	0,303	0,034	0,010		0,069
7. Toxoplasma gondii	0,486	0,450	0,423	0,487	0,433	0,443

Проведенный анализ филогенетических отношений на основании нуклеотидных последовательностей cox1 мтДНК оказался малоинформативным: древо оказалось неразрешенным с низкими поддержками. Однако представители сем. Eimeriidae из рыб сформировали базальные ветви. В полученной филогенетической реконструкции на основании транслированных аминокислотных последовательностей (Рис. 1) представители сем. Eimeriidae из рыб достоверно располагаются в основании древа. Таким образом, ранее сформулированная гипотеза о том, что именно кокцидии рыб дали начало всем известным линиям кокцидий у других позвоночных животных (Rosenthal et al., 2016; Xavier et al., 2018; Matsche et al., 2019; Деникина и др., 2023b), нашла свое косвенное подтверждение.

Ранее было высказано предположение, что фрагмент гена cox1 имеет достаточный филогенетический потенциал, чтобы помочь в разрешении очевидных парафилий внутри кокцидий (Ogedengbe et al., 2011). Полученные результаты не позволяют однозначно подтвердить эту гипотезу, поскольку пока данных о последовательностях cox1 мтДНК представителей родов Eimeria, Calyptospora и Goussia из рыб явно недостаточно. По той же причине преждевременно утверждать, к какому роду относятся детектированный нами представитель сем. Eimeriidae.

Метагеномные исследования (метабаркодирование) эукариот морских и наземных экосистем продемонстрировали высокое разнообразие и доминирование представителей Apicomplexa (Mahé et al., 2017; Lentendu et al., 2018), которые являются паразитами беспозвоночных и позвоночных животных, и имеют сложные жизненные циклы, значительно различающиеся между группами (Votýpka et al., 2016; Rueckert et al., 2019). Семейство Eimeriidae – наиболее разнообразный таксон простейших, основной особенностью представителей которого является образование экологически устойчивых ооцист, которые выделяются с фекалиями хозяина. Общая морфология ооцист, а также количество спороцист и спорозоитов широко используются для определения отдельных родов. Однако, результаты последних филогенетических исследований плохо коррелируют с текущей таксономией. Они также показали, что несколько диагностических признаков, считавшихся до сих пор уникальными, на самом деле присутствуют у представителей нескольких генетически далеких родов (Votýpka et al., 2016). В настоящее время известно, что у различных видов морских и пресноводных рыб наиболее распространены представители родов Eimeria, Goussia и Calyptospora (Xavier et al., 2018).

Ранее у рыб из оз. Байкал было отмечено пять видов кокцидий (Шульман и Заика, 1964; Заика, 1965; Пронина, 1990), из которых только один у представителей семейства Cottidae:

Goussia carpelli (Leger et Stankovitch, 1921) (Syn.: Eimeria carpelli (Leger et Stankovitch, 1921); E. cyprini (Plehn, 1924); Goussia carpelli sensu (Dykova et Lom, 1983). Паразит локализован в стенках кишечника и желчного пузыря большеголовой широколобки Batrachocottus baicalensis (Dybowski, 1874), песчаной широколобки Leocottus kesslerii (Dybowski, 1874), широкорылой широколобки Abyssocottus (Cyphocottus) eurystomus (Taliev, 1955) и сибирского речного гольяна Phoxinus rivularis (Pallas, 1773).
Goussia leucisci (Schulman et Zaika, 1964) Lom, Desser, Dykova, 1989 (Syn.: Eimeria leucisci (Schulman et Zaika, 1964); E. freemani (Molnar et Fernando, 1974); Goussia freemani (Molnar et Fernando, 1974)). Паразит локализован в почках и в стенках желчного пузыря сибирского ельца Leuciscus baicalensis (Dybowski, 1874).
Eimeria esoci Schulman et Zaika, 1964. Паразит локализован в стенках кишечника и желчного пузыря обыкновенной щуки Esox lucius Linnaeus, 1758.
Eimeria percae (Riviere, 1914) (Syn.: Coccidium percae Riviere, 1914; Eimeria percae Reichenow, 1921; E. rivieri Yakimoff, 1929). Паразит локализован в стенках кишечника и почках обыкновенного окуня Perca fluviatilis (Linnaeus, 1758).
Eimeria sp. Паразит локализован в стенках кишечника байкальского омуля Coregonus migratorius (Georgi, 1775).

У представителей семейства Cottidae: прибрежных видов большеголовой широколобки и песчаной широколобки, а также у глубоководного вида – широкорылой широколобки ранее был отмечен один вид – G. carpelli.

Для паразитических простейших Apicomplexa, использующих орально-фекальный путь передачи и распространения, большое значение имеет устойчивость ооцист к действию факторов окружающей среды (Clopton et al., 2016). Эти особенности позволяют детектировать их в различных образцах окружающей среды, включая палеонтологические (Rueckert et al., 2011; Côté and Le Bailly, 2018; Le Bailly et al., 2019; Singer et al., 2020; Beltrame et al., 2022). Ооцисты, в том числе и представителей родов Eimeria и Goussia, могут присутствовать во внешней среде, в том числе и в донных осадках (Siński and Behnke, 2004). У кокцидий водных животных молодые ооцисты обычно выделяются с фекалиями неспорулированными и неинфекционными, так как их развитие прекращается лишь во внешней среде, где происходит образование спороцист со спорозоитами (Votýpka et al., 2016). В жизненном цикле кокцидий рыб зарегистрировано два типа передачи: прямой с фекальным загрязнением и непрямой, который включает в себя беспозвоночных животных (Steinhagen and Korting, 1988; Davis and Ball, 1993). Соответственно, можно предположить, что ДНК представителя сем. Eimeriidae с равной долей вероятности могла поступить в пищеварительный тракт широколобки Годлевского двумя путями: прямым из внешней среды и/или непрямым из ее кормовых объектов.

Последовательности представителей Eimeriidae составляли <0,01% от всех данных метагеномного секвенирования ДНК содержимого пищеварительных трактов рыб. Однако, в настоящее время мы не можем утверждать, является ли детектированный нами паразит специфичным для широколобки Годлевского. G. carpelli, зарегистрированная у представителей семейства Cottidae, считается специфичным паразитом карпа Cyprinus carpio Linnaeus, 1758 (Molnár et al., 2005), а у других видов рыб из списка ее хозяев имеются свои отдельные виды кокцидий (Соколов и Мошу, 2014). В связи с этим, необходимо комплексное морфологическое и молекулярно-генетическое изучение этих паразитов, особенно широко распространенной G. carpelli из различных систематических групп рыб.

4. Заключение

Впервые в результате анализа данных метагеномного секвенирования ДНК содержимого пищеварительных трактов широколобки Годлевского были детектированы последовательности представителей сем. Eimeriidae с относительной представленностью <0,01%. Полученные последовательности принадлежали единственному гаплотипу, достоверно отличающемуся от всех ранее известных. В отличие от анализа нуклеотидных последовательностей cox1 мтДНК, филогенетическая реконструкция на основании транслированных аминокислотных последовательностей достоверно продемонстрировала базальное расположение ветвей представителей сем. Eimeriidae из рыб. Вопрос о родовой принадлежности детектированного организма остается открытым из-за недостаточного количества нуклеотидных данных представителей родов Eimeria, Calyptospora и Goussia из рыб. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения целенаправленных комплексных (включая молекулярно-генетические) исследований фауны паразитических простейших рыб.

Источники финансирования и благодарности

Авторы выражают благодарность команде НИС “Г.Ю. Верещагин” за помощь в сборе материала, а также Кирильчику С.В. за помощь в подготовке рукописи. Работа выполнена в рамках тем государственного задания № 121032300224-8 и 121032300196-8.