Results of oocyte isolation and obtaining IVP embryos from heifers of Istoben breed depending on OPU regimen

Texto integral

Введение.

Репродуктивная биотехнология, направленная на получение эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVP), как и метод in vivo (Бабенков В.Ю. и др., 2023) является эффективным способом разведения и сохранения генетических ресурсов у крупного рогатого скота (КРС), так как позволяет получать большее количество потомства от ценных и уникальных матерей. Данная технология подразумевает извлечение половых клеток (ооцитов) из фолликулов яичников самок, их созревание и оплодотворение in vitro, а также последующее культивирование зигот до стадии, пригодной для трансплантации или заморозки (Ferré LB et al., 2020) При этом основным способом выделения ооцитов является трансвагинальная аспирация фолликулов (ovum pick up, OPU). В силу ряда особенностей, к которым можно отнести отсутствие необходимости в гормональной стимуляции яичников, возможность получать половые клетки от доноров с нарушенным половым циклом и животных, имеющих патологии яйцевода, а также тех, кто не реагирует на гормональную стимуляцию (Чинаров Р.Ю., 2024), использование OPU особенно актуально при работе по получению эмбрионов у пород, имеющих ограниченное число чистопородных доноров.

В настоявшее время наблюдается критическое сокращение популяции истобенской породы – чёрно-пёстрого скота молочного типа, которая характеризуется неприхотливостью к условиям содержания, устойчивостью к инфекциям и долгим сроком жизни (Мокерова Е.В., 2024). Численность популяции, по данным на 2022 год, составляла около 800 голов (Abdelmanova AS et al., 2022), что указывает на возможность утери её ценных биологических и хозяйственных признаков, а также необходимость в разработке мероприятий по сохранению данной популяции, в том числе с использованием OPU/IVP технологии.

Известно, что эффективность OPU/IVP-технологии зависит от ряда технологических и биотехнологических факторов (Baruselli PS et al., 2022), которые зачастую опосредованы индивидуальными особенностями доноров (Monteiro FM et al., 2017; Watanabe YF et al., 2017) и их породной принадлежностью (Pontes JHF et al., 2010). То есть применение OPU/IVP-технологии в программах сохранения отдельных пород, особенно таких, как истобенская, для которых мероприятия по получению in vitro эмбрионов ранее не проводились, требует предварительных исследований, направленных на оптимизацию её отдельных этапов и выявлению факторов, влияющих на эффективность данной репродуктивной биотехнологии.

 

Цель исследования.

Изучить влияние индивидуальных особенностей животных-доноров на эффективность OPU/IVP-технологии у истобенской породы крупного рогатого скота и зависимость такого влияния от режима проведения трансвагинальной аспирации фолликулов (один или два раза в неделю). Оценить действие тестируемых факторов как на количество и качество, выделенных ооцитов, так и на их компетенцию к созреванию и последующему эмбриональному развитию в условиях in vitro.

 

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Половозрелые тёлки-доноры истобенской породы КРС (Bos taurus taurus), полученные от доноров методом OPU ооциты, а также развившиеся из них IVP эмбрионы.

Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями российских нормативных актов, протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009). При проведении исследований были предприняты меры для обеспечения минимума страданий животных и уменьшения количества исследуемых опытных образцов.

Схема эксперимента. Исследования по OPU, получению ооцитов и IVP -эмбрионов проводили в ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста (https://www.vij.ru/) в ноябре-декабре 2023 года и феврале-марте 2024 года. В ноябре-декабре OPU выполняли два раза в неделю (в понедельник и четверг, 2W) с интервалом в 3 или 4 дня. В феврале-марте – один раз в неделю по понедельникам (1W). Всего в эксперименте участвовало 7 тёлок-доноров, на которых в рамках каждого режима было проведено по 8-9 последовательных сеансов OPU. Рационы животных были сбалансированы по энергии, питательным и биологически активным веществам в соответствии с нормами потребностей.

Процедуру OPU проводили в соответствие с разработанным протоколом, используя систему для OPU у крупного рогатого скота (Чинаров Р.Ю. и др., 2023). В рамках одной сессии OPU аспирировали все видимые фолликулы. В качестве аспирационного раствора использовали фосфатно-солевой буфер (ФСБ), с добавлением фетальной бычьей сыворотки (ФБС), гепарина и антибиотика (Сингина Г.Н. и др., 2023). Аспираты от каждого донора (1 сессия OPU) пропускали индивидуально через фильтр, промывали с использованием ФСБ, дополненного 1 % ФБС, после чего осуществляли поиск и морфологическую оценку качества ооцитов как описано ранее (Сингина Г.Н. и др., 2023). Для дальнейшей работы отбирали ооциты с гомогенной или умеренно гетерогенной цитоплазмой, окруженные одним и более слоев кумулюсных клеток (КК) или частично окруженные КК. Ооциты, имеющие неоднородную цитоплазму с признаками грануляции или лизиса, голые клетки, а также созревшие считались непригодными для получения IVP эмбрионов и выбраковывались. Результативность каждой сессии OPU оценивали по количеству аспирированных фолликулов и выделенных ооцитов на одну сессию OPU, доле извлечения ооцитов, а также количеству и проценту ооцитов категорий качества пригодных для культивирования.

Отобранные ооциты культивировали (от каждого донора индивидуально) с целью их созревания in vitro (in vitro maturation, IVM) в среде ТС-199 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (10 %), пирувата натрия (0,5 мМ), фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов (по 10 мкг/мл), эпидермального фактора роста (20 нг/мл) и гентамицина (50 мкг/мл). Затем созревшие ооциты подвергали процедуре экстракорпорального оплодотворения (in vitro fertilization, IVF) (Сингина Г.Н. и др., 2023).

Для IVF использовали размороженную сперму 2 быков истобенской породы, которую предварительно подвергали процедуре swim up, как описано ранее (Сингина Г.Н. и др., 2016). Сперматозоиды вносили в среду оплодотворения BO-IVF от фирмы «IVF Bioscience», с предварительно перенесенными туда ОКК до конечной концентрации 1,5×10⁶ сперматозоидов на 1 мл.

Половые клетки совместно культивировали в течение 10-11 ч, затем ооциты освобождали от клеток кумулюса и налипших сперматозоидов и проводили морфологическую оценку изолированных ооцитов, оценивая количество яйцеклеток с направительными тельцами и, определяя процент созревания. Предполагаемые зиготы переносили в среду эмбрионального развития. Через 3-е суток после оплодотворения ооцитов проводили смену среды и морфологическую оценку раздробившихся зигот, на 7-е сутки культивирования оценивали число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты.

Оборудование и технические средства. В комплект системы OPU входил ультразвуковой сканер Versana 1104 Active с конвекциональным широкополосным зондом (частота 5 МГц) и держателем зонда («GE HealthCare», США), а также вакуумный насос («Minitube», Германия). Культивирование ооцитов с целью их созревания и оплодотворения осуществлялось в инкубаторе MCO-18AIC (Sanyo, Япония), поддерживающем 5 % CO₂ в воздухе, культивирование зигот до стадии бластоцисты в инкубаторе в инкубаторе MCO-50M-PE (Sanyo, Япония) в присутствие 5 % СО₂, 5 % О₂ и 90 % N₂ в атмосфере. Манипуляции с ооцитами и эмбрионами вне инкубаторов проводили под стереомикроскопом (Nikon, Япония), оснащённого нагревательным столиком.

Статистическая обработка. Статистическая обработка данных производилась с использованием программы «SPSS Statistic Version 21» (IBM Corporation, США). Анализ показателей при сравнении режимов OPU (1W/2W) для каждого донора осуществлялся с применением t-критерия Стьюдента для зависимых выборок. Выявление индивидуальных особенностей доноров рассчитывалось с применением однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими попарными сравнениями с применением критерия Тьюки. Статистически значимыми считали различия при уровне Р≤0,05.

 

Результаты исследования.

Результаты трансвагинальной аспирации фолликулов у отдельных доноров представлены на рисунке 1. Выявлена зависимость количества аспирированных фолликулов как от индивидуальных особенностей опытных животных, так и от временных параметров проведения OPU. В случае выполнения этой процедуры в режиме 2 раза в неделю (2W) у тёлки с идентификационным номером 964 среднее количество аспирированных фолликулов на 1 сессию OPU имело наибольшее значение (13,0±0,9 фолликулов) и было выше (от Р≤0,05 до Р≤0,001), чем у других 7 доноров. Минимальное количество фолликулов (5,3±0,4) пунктировано у тёлки № 26, которое было ниже не только по сравнению с тёлкой № 964 (Р≤0,001), но и в сравнении с некоторыми другими донорами (Р≤0,05). Когда OPU проводилось раз в неделю (1W) по данному показателю различия между отдельными животными были менее выражены, его максимальное (8,3±1,2 фолликула) и минимальное (4,8±0,5 фолликула) значение сохранялось за теми же телками (№ 964 и 26 соответственно) что и при 2W, и только между ними установлены достоверные отличия (Р≤0,05). У двух (№ 964 и 971) из 7 доноров при режиме 2W показатель количества аспирированных фолликулов на одну сессию OPU был существенно выше, чем при режиме 1W (Р≤0,05).

 

Примечания: – достоверные различия между донорами для 2W: ^a-f,g – Р≤0,001; ^a-b,c,d,e – Р≤0,05;

^g-b,c,d – Р≤0,05; – достоверные различия между донорами для 1W: # – Р≤0,05; – достоверные различия для индивидуальных доноров при сравнении с режимом проведения OPU 1 раз в неделю (1W):

* – Р≤0,05

Note: – significant differences between donors for 2W: ^a-f,g – Р≤0.001; ^a-b,c,d,e – Р≤0.05; ^g-b,c,d – Р≤0.05; – significant differences for individual donors when compared with the OPU procedure conducted once a week (1W): * – Р≤0.05

Рисунок 1. Результаты аспирации фолликулов у тёлок истобенской породы при проведении OPU в режиме 1 (1W) и 2 раза в неделю (2W)

Figure 1. The results of follicle aspiration in Istoben heifers during OPU procedures conducted once (1W) and twice a week (2W)

 

Результаты выделения ооцитов из фолликулов яичников представлены на рисунке 2. Количество полученных ооцитов на 1 сессию OPU не зависело от режима её проведения (1 раз в неделю или 2 раза в неделю). В то же время между отдельными донорами имелись существенные различия. В случае проведения трансвагинальной аспирации фолликулов 2 раза в неделю наименьшее значение данного показателя наблюдалось у тёлки № 26 (2,2±0,6 ооцита), наибольшее – у тёлки № 964 (7,2±1,2 ооцита), которое в свою очередь было существенно выше чем у всех других доноров (в сравнении с № 971 Р≤0,01, со всеми остальными Р≤0,001). При режиме 1W наименьшее количество выделенных ооцитов на 1 сессию OPU было у того же животного (1,7±0,4 ооцита), равно как и наибольшее (8,4±1,0 ооцита), но в отличие от 2W его максимальное значение было выше только по сравнению с 4 донорами, такими как № 66, 73, 22 и 26 (Р≤0,05).

 

Примечания: – достоверные различия при сравнении с донором № 964 для режима 2W:

*** – Р≤0,001; ** – Р≤0,01; –- достоверные различия в сравнении с донором № 964 при режиме 1W: # – Р≤0,05

Note: – significant differences compared to donor No. 964 for the 2W regimen: *** – P≤0.001;

** – P≤0.01; – significant differences compared to donor No. 964 under the 1W regimen: # – P≤0.05

Рисунок 2. Результаты выделения ооцитов у тёлок-доноров истобенской породы при проведении OPU в режиме 1 (1W) и 2 раза в неделю (2W)

Figure 2. Results of oocyte isolation from donor heifers of the Istoben breed with OPU conducted once a week (1W) and twice a week (2W)

 

Оценка качества выделенных ооцитов представлена на рисунке 3. Когда интервал между сеансами OPU составлял 7 дней, доля отобранных для IVM ооцитов от общего числа выделенных клеток на 1 сессию OPU, достоверно не различалась между отдельными донорами: более низкие значения данного показатели были у тёлок № 66 и 26 (43,5±12,6 и 41,9±10,7 % соответственно), у остальных животных исследуемая доля варьировала от 69,3±15,6 (тёлка № 22) до 78,2±7,1 % (тёлка № 73). С изменением режима на 2W отсутствие значимых различий между опытными животными по данному показателю сохранялось. Кроме того, его значения у 6 из 7 доноров не отличались от таковых при 1W. Влияние режима OPU наблюдалось только у донора № 73, в его случае при более частых сессиях происходило ухудшение качества выделенных ооцитов: снижение доли пригодных для IVM клеток с 78,2±7,1 (1W) до 50,8±12,5 % (2W) (Р≤0,05).

 

Примечание: * – Р<0,05 при сравнении с режимом 2W

Note: * – P<0.05 compared to the 2W regimen

Рисунок 3. Оценка качества выделенных ооцитов у тёлок истобенской породы при проведении OPU в режиме 1 (1W) и 2 раза в неделю (2W)

Figure 3. Assessment of obtained oocyte quality in Istoben heifers under 1W (once a week) and 2W (twice a week) OPU regimens

 

В дальнейшем пригодные для культивирования ооциты были использованы для получения IVP эмбрионов. Компетенцию ооцитов к развитию оценивали по уровню созревания и дробления, а также выходу эмбрионов на стадии бластоцисты (табл. 1).

 

Таблица 1. Созревание и эмбриональное развитие в условиях in vitro ооцитов, полученных от тёлок истобенской породы КРС при различных режимах проведения OPU

Table 1. In vitro maturation and embryonic development of oocytes obtained from heifers of Istoben breed under different OPU frequency regimes

ID тёлки/ Heifer ID numder	Число ооцитов/ Number of oocytes, n	*Доля созревших ооцитов, %/*Maturation rate, %	*Доля раздробившихся ооцитов, %/ *Cleavage rate, %	*Доля ооцитов развившихся до стадии бластоцисты, %/ *Blastocyst rate, %
1	2	3	4	5
Интервал между сессиями OPU в 7 дней (1 раз в неделю) / The interval between OPU sessions is 7 days (1 time per week)
964	65	89,3±4,07	75,9±7,91	28,2±8,56
73	32	94,1±4,07	84,4±6,19a	30,4±11,4
1	2	3	4	5
22	25	93,3±6,70	69,2±15,2	30,8±15,2
26	20	100±0,00	78,6±14,9	14,3±14,3
971	32	80,8±22,6	68,6±7,90	11,9±6,50
57	35	84,4±12,4	57,1±13,1	26,7±8,90
66	27	73,8±14,5	45,2±17,3b	28,6±18,4
Интервал между сессиями OPU в 3-4 дня (2 раза в неделю) / The interval between OPU sessions is 3-4 days (2 times a week) /
964	76	85,3±4,20	65,6±5,70	29,3±5,90a
73	26	87,5±8,5	70,8±16,4	29,2±13,6a
22	22	92,5±4,8	72,5±16,0	24,2±15,8ab
26	15	85,7±14,3	71,4±18,4	33,3±17,8a
971	34	88,8±7,4	61,3±12,7	5,6±3,70b
57	33	91,3±6,4	62,2±12,7	6,3±6,30b
66	28	76,7±14,5	76,7±14,5	32,0±13,3a

Примечания: * – рассчитывалась, исходя из процентов в одной сессии OPU; – значения в столбце с разными индексами достоверно различаются при P≤0.05

Note: * – calculated based on average OPU per session; – values in a column with different indexes are significantly different at P≤0.05

 

Созревание ооцитов in vitro не зависело от индивидуальных особенностей животных. Доля созревших ооцитов, а именно отношение ооцитов с полярными тельцами к исходному количеству отобранных для IVM клеток была высокой и в случае использования режима 1w варьировала от 73 (тёлка № 66) до 100 % (тёлка № 26). Не изменялся данный показатель у отдельных животных и в случае перехода с режима OPU 2 раз в неделю на 1 раз в неделю.

Отсутствие достоверных различий между донорами также наблюдалось и по уровню дробления созревших ооцитов после их экстракорпорального оплодотворения (табл. 1), когда OPU проводилось 2 раза в неделю: минимальное значение данного показателя было у тёлки № 971 (61 %), максимальное – у тёлки № 66 (76 %). При более редком режиме наибольшая доля дробления была на уровне 84 % (тёлка № 73), наименьшая составила 45 % (тёлка № 66), и они значимо отличались друг от друга (Р≤0,05).

Полученные от отдельных доноров ооциты, в основном обладали сходной компетентностью к развитию до стадии бластоцисты: стадии, на которой эмбрионы могут быть пересажены животным-реципиентам или заморожены (табл. 1). Тем не менее, в случае проведения OPU 2 раза в неделю у животных с номерами 971 и 57 доля развития бластоцист была ниже (Р≤0,05), чем у доноров с номерами 964, 73, 26 и 66 (Р≤0,05). Кроме того, у тёлки № 57 данный показатель был меньше, чем при режиме 1W (Р≤0,05).

Итоговую эффективность OPU/IVP технологии оценивали по количествe бластоцист на одну сессию OPU. Результаты представлены на рисунке 4. Наибольшее количество (1,9) бластоцист было получено у тёлки № 964 при режиме 2W, которое было сходно с таковым при 1W (1,7 бластоцисты). Существенно более низкие значения данного показателя по сравнению с этой тёлкой в рамках 2-кратного режима наблюдались у доноров с номерами 971 и 57 (Р≤0,05), в случае однократного – у животных с номерами 971, 57, 66 и 26 (Р≤0,05). Между другими донорами различий выявлено не было, равно как и зависимости для каждого животного эффективности OPU/IVP технологии от режима проведения трансвагинальной аспирации фолликулов.

 

Примечание: – достоверные различия в сравнении с донором № 964 в рамках режимов 1W и 2W:

* – Р≤0,05

Note: – significant differences compared to donor No. 964 within the 1W and 2W regime: * – P≤0.05.

Рисунок 4. Результативность OPU/IVP технологии у телок истобенской породы при проведении OPU в режиме 1 (1W) и 2 раза в неделю (2W)

Figure 4. The efficiency of OPU/IVP technology in Istoben heifers with OPU conducted once per week (1W) and twice per week (2W)

 

Обсуждение полученных результатов.

Получение эмбрионов in vitro c использованием OPU ооцитов является в настоящее время лидирующей технологией производства эмбрионов у крупного рогатого скота (Viana JHM, 2022). В тоже время её эффективность сильно варьирует между породами, а также опосредована физиологическими и биотехнологическими факторами, включая индивидуальные особенности доноров и условия проведения OPU (Sartori R et al., 2016; Ferré LB et al., 2020; Baruselli PS et al., 2022).

Согласно данным литературы, между отдельными донорами наблюдаются существенные различия в паттерне фолликулярного развития, количестве получаемых ооцитов, а также их компетенции к эмбриональному развитию в системе in vitro, что обуславливает различия в числе получаемых IVP-эмбрионов (Monteiro FM et al., 2017; Watanabe YF et al., 2017; Baruselli PS et al., 2022). Истобенская порода в этом контексте не стала исключением. По нашим результатам из 7 тёлок-доноров выделяется одно животное (№ 964) с высоким показателем результативности OPU/IVP технологии и одно (№ 971) – с очень низким.

Популярным графиком OPU у КРС считается сбор ооцитов 2 раза в неделю, который по результатам ряда работ (Baruselli PS et al., 2016) даёт большее количество жизнеспособных ооцитов и развившихся из них in vitro эмбрионов, чем другой распространённый режим – один раз в неделю. Тем не менее, по некоторым данным, часто повторяющиеся пункции, могут приводить к снижению эффективности OPU/IVP-технологии (Choi BH et al., 2018), в том числе c точки зрения соотношения эмбрионы/ооциты (Presicce GA et al., 2020). В данной работе OPU проводили 1 или 2 раза в неделю. Отличие между вариантами наблюдалось в паттерне фолликулярного развития, оценённого по количеству аспирированных фолликулов на одну сессию OPU в пользу 2-кратного режима (тёлки с номерами 964 и 971) и качеству выделенных ооцитов – в пользу режима меньшей интенсивности (тёлка № 73). Существенных различий между сравниваемыми режимами как в рамках отдельных доноров по количеству выделенных ооцитов, так и по их способности развиваться после экстракорпорального оплодотворения до стадии бластоцисты, выявлено не было. Возможно, что обнаруженное в нашем исследовании увеличение УЗИ-видимых фолликулов связано с стимулированием более частым OPU фолликулярного роста, а снижение доли пригодных для IVM ооцитов, с тем, что при этом в некоторых случаях может снижаться качество ооцитов (Baruselli PS et al., 2016; Oliveira CS et al., 2023).

 

Заключение.

У тёлок истобенской породы КРС индивидуальный фактор донора может серьёзно повлиять на результаты выделения OPU-ооцитов и их компетенцию к эмбриональному развитию в условиях in vitro. Кроме того, от выбора режима проведения процедуры OPU (1 или 2 раза в неделю) в отдельных случаях зависит паттерн фолликулярного развития, а также количество и качество выделенных ооцитов.

Sobre autores

Galina Singina

Federal Research Center for Animal Husbandry – VIJ named after Academy Member L.K. Ernst

Autor responsável pela correspondência
Email: g_singina@mail.ru
ORCID ID: 0000-0003-0198-9757

Cand. Sci. (Biology)

Rússia, Moscow region, Dubrovitsy

Roman Chinarov

Federal Research Center for Animal Husbandry – VIJ named after Academy Member L.K. Ernst

Email: roman_chinarov@mail.ru
ORCID ID: 0000-0001-6511-5341

Cand. Sci. (Veterinary), Senior Researcher

Rússia, Moscow region, Dubrovitsy

Ekaterina Shedova

Federal Research Center for Animal Husbandry – VIJ named after Academy Member L.K. Ernst

Email: shedvek@yandex.ru
ORCID ID: 0000-0002-9642-2384

Researcher

Rússia, Moscow region, Dubrovitsy

Victoria Lukanina

Federal Research Center for Animal Husbandry – VIJ named after Academy Member L.K. Ernst

Email: kristybatle@gmail.com
ORCID ID: 0000-0003-4744-7873

Junior Researcher

Rússia, Moscow region, Dubrovitsy

Anastasia Zhukova

Federal Research Center for Animal Husbandry – VIJ named after Academy Member L.K. Ernst

Email: anastasia.s.belyaeva@gmail.com
ORCID ID: 0000-0003-1155-014X

Cand. Sci. (Biology), Researcher

Rússia, Moscow region, Dubrovitsy

Bibliografia

Arquivos suplementares