Открытый доступ
Доступ предоставлен
Только для подписчиков
Том 19, № 3 (2024)
- Год: 2024
- Статей: 6
- URL: https://bakhtiniada.ru/2313-1829/issue/view/17757
Научные обзоры
Способы синхронизации клеточного цикла кариопластов для повышения результативности соматического клонирования сельскохозяйственных животных
Аннотация
Соматическое клонирование — способ получения генетически идентичного потомства, обладающий по ряду причин крайне низкой результативностью. Способы повышения эффективности данной процедуры направлены на оптимизацию каждого из её этапов, одним из которых является подготовка кариопластов. В большинстве экспериментов по получению клонированного потомства в качестве клеток-реципиентов применяют ооциты на стадии метафазы II мейотического деления без предварительной активации, что обусловливает выбор в качестве кариопластов соматических клеток на стадии G0/G1, наиболее оптимальной для последующего репрограммирования их ядер факторами цитоплазмы ооцитов. Для остановки клеток в данной фазе наиболее часто используют методы сывороточного голодания и/или контактного ингибирования, позволяющие остановить до 90% клеток на стадии G0/G1. Однако, несмотря на эффективность данных способов, они обладают рядом существенных ограничений, в связи с чем приобретает широкое распространение добавление в среду культивирования соматических клеток компонентов, препятствующих продвижению клеток по стадиям клеточного цикла. Преимуществом применения химических ингибиторов является способность некоторых из них оказывать протекторное воздействие на соматические клетки и в результате предотвращать индукцию апоптотических изменений. Таким образом, в настоящее время существует широкий спектр методов эффективной синхронизации клеточного цикла кариопластов, и при выборе оптимального способа следует обращать внимание на тип клеток; видовую принадлежность животных, от которых они получены; допустимую продолжительность культивирования в заданных условиях с целью минимизации негативного воздействия этих условий на жизнеспособность кариопластов.
319-333
Изменения молекулярной сигнализации ключевых нейротрофических факторов в мозге при развитии аффективных нарушений
Аннотация
Пандемия COVID-19, повышение напряжённости политической обстановки, общее состояние неопределённости в современном мире привели к увеличению числа зарегистрированных случаев аффективных расстройств. Развитие аффективных нарушений принято связывать с такими нейротрансмиттерами, как серотонин и дофамин, однако современные тенденции направлены на изучение вовлечённости нейротрофических факторов в механизмы расстройства настроения.
Целью данного обзора являются обобщение и систематизация знаний о ключевых нейротрофических факторах и молекулярных механизмах их взаимосвязей.
Рассмотрены ключевые механизмы метаболизма таких белков, как нейротрофический фактор мозга (BDNF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), основной фактор роста фибробластов (FGF2), фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GDNF). На основе анализа их отдельных молекулярных путей составлена комплексная схема множественного каскада взаимосвязанных реакций, в который включён каждый из этих белков. Выявлены ключевые молекулярные мишени — транскрипционный фактор NF-kB (ядерный фактор «каппа-би») и белок, связывающий элемент транскрипционного фактора cAMP (CREB), также в рамках обзора представлены кандидаты на роль лимитирующих факторов для данных молекулярных мишеней. Для каскада NF-kB в качестве лимитирующего фактора предложен рецептор нейротрофинов p75(NTR), для каскада CREB — внутриклеточная фосфолипаза (α-γ), бинарные молекулярные переключатели семейства родственных белков (RAS-GTP) и протеинкиназа В (AKT).
334-347
Использование атомно-силовой микроскопии для оценки биомеханических свойств 3D-моделей опухолевых клеток
Аннотация
Многоклеточные сфероиды являются уникальным объектом-моделью для токсикологических исследований. Клетки в 3D-кластере имеют микроокружение, межклеточные коммуникации, что позволяет использовать сфероиды в качестве более реалистичной модели по сравнению с традиционными клеточными культурами. Известно, что микрорегионы опухоли состоят из гетерогенных популяций раковых клеток, в которых рост клеток и ответ на противоопухолевые препараты зависят от их 3D-архитектуры, межклеточных контактов и взаимодействия с микроокружением. Кроме того, на рост и прогрессию опухоли оказывают сильное влияние механические сигналы. В настоящее время 3D-модели клеточных культур являются мощным инструментом для изучения токсичности лекарственных соединений и наноматериалов разного состава и морфологии.
В обзоре представлены данные об использовании различных методик, в частности атомно-силовой микроскопии, для исследования изменений механических свойств клеток в сфероидах. В частности, рассматривается использование атомно-силовой микроскопии как инструмента для выявления физико-химических параметров клеток при патофизиологических процессах или воздействии лекарственных препаратов. Актуальность данного обзора связана с возрастающим интересом к роли биомеханических свойств тканей, клеток и субклеточных структур как маркёров патофизиологических состояний.
348-358
Влияние инсулина на фосфопротеом скелетных мышц в норме и при инсулинорезистентности
Аннотация
Скелетная мускулатура является главным местом инсулинозависимого поглощения глюкозы, а появление инсулинорезистентности скелетных мышц — основным фактором развития инсулинорезистентности организма. Это нарушение связывают с дефектами канонического инсулинового каскада, регулирующего захват глюкозы; при этом конкретные молекулярные механизмы до сих пор остаются предметом дискуссии. Панорамный масс-спектрометрический фосфопротеомный анализ представляется оптимальным подходом для исследования сложных сигнальных сетей.
В обзоре обобщены данные фосфопротеомных исследований, в которых изучались изменения внутриклеточной сигнализации в скелетной мышце при стимуляции инсулином в норме и при инсулинорезистентности. Исследования in vitro и in vivo показали, что стимуляция инсулином/приём пищи вызывают масштабные изменения фосфопротеома (сотни фосфосайтов). Эти изменения затрагивают не только канонические инсулиновые каскады, но и другие сигнальные пути и множество белков, выполняющих разные функции (ферменты углеводно-жирового обмена, саркомерные и митохондриальные белки, транскрипционные факторы, шапероны и др.), а также вызывают изменения транскриптома. Инсулинорезистентность нарушает фосфопротеомный ответ на инсулин, однако эти изменения слабо затрагивают канонический инсулиновый каскад, регулирующий захват глюкозы. Обсуждается предположение, что причины нарушений инсулинозависимого захвата глюкозы вызваны главным образом комбинацией множественных нарушений в различных сигнальных молекулах, которые регулируют захват глюкозы напрямую или опосредованно, но не связаны с каноническим инсулиновым каскадом.
359-371
Оригинальные исследования
Оценка хондрогенного потенциала дермальных фибробластов человека после модификации дифференцировочными средами и цитокином TGF-β3
Аннотация
Обоснование. Гиалиновый хрящ представляет собой аваскулярную ткань, покрывающую крупные суставы. Данная ткань с малым количеством клеток и большим содержанием белков внеклеточного матрикса обладает ограниченной способностью к регенерации. Восстановление поверхности суставного хряща на сегодняшний момент является актуальной и не до конца решённой задачей. Перспективным направлением можно считать применение биомедицинских продуктов, содержащих модифицированные клетки.
Цель исследования — выявление влияния различных питательных сред на хондрогенную модификацию клеток и сравнение результатов между собой.
Материалы и методы. Дермальные фибробласты человека и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки кролика модифицировали при помощи среды для хондрогенной дифференцировки StemPro или рекомбинантного белка TGF-β3. Экспрессию генов, ответственных за хондрогенез (Acan, Tgfβ3, Col2α1, Comp), измеряли с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (real-time PCR) методом ΔΔCt.
Результаты. Показано, что дермальные фибробласты человека способны к хондрогенной модификации с помощью белковых сред. Данный тип клеток легко доступен для забора, не требует особых условий при культивировании, легко масштабируется, а также может быть использован для аллогенной трансплантации.
Заключение. Полученные данные можно использовать при конструировании тканеинженерных продуктов для регенерации гиалинового хряща на основе аллогенных дермальных фибробластов.
372-386
Сравнительная характеристика влияния мезенхимальных стромальных клеток, их микровезикул и плазмы, обогащённой растворимыми факторами тромбоцитов, на выживаемость и апоптоз лимфоцитов селезёнки крыс in vitro
Аннотация
Одной из важных, но недостаточно изученных характеристик мезенхимальных стромальных клеток (МСК), их микровезикул (МВ МСК) и плазмы, обогащённой растворимыми факторами тромбоцитов (ПОРФТ/PRP), является их трофическая функция, обеспечивающая жизнеспособность клеток-мишеней.
Цель исследования — провести анализ способности МСК, МВ МСК, ПОРФТ/PRP оказывать влияние на жизнеспособность, спонтанный и активационный апоптоз культивированных in vitro лимфоцитов селезёнки крыс.
Материалы и методы. МСК выделяли из фракции мононуклеарных клеток костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar методом адгезии на пластике. МВ МСК получали из кондиционной среды культуры МСК методом центрифугирования при 14 500 g. ПОРФТ/PRP приготавливали путём замораживания/оттаивания концентрата тромбоцитов периферической крови крыс. Лимфоциты селезёнки крыс выделяли на градиенте плотности 1,077 г/см3. Выживаемость и степень апоптоза лимфоцитов in vitro оценивали методом проточной цитометрии по включению красителя 7-AAD и связыванию с annexin V.
Результаты. Присутствие МСК в концентрациях 10 и 20% вызывало повышение количества живых интактных и ФМА-активированных лимфоцитов (ФМА — форбол-миристат-ацетат) к концу 3-суточного культивирования in vitro. По сравнению с контролем в 8,3–13,5 раза снизилось количество некротических клеток, в 2,3–4,0 раза — количество апоптотических клеток, преимущественно за счёт лимфоцитов, находящихся в стадии позднего апоптоза. МВ МСК в использованных концентрациях не оказывали существенного эффекта на жизнеспособность лимфоцитов, культивированных in vitro, но снижали уровень апоптоза интактных и ФМА-активированных лимфоцитов в 3,6 (р=0,03) и 4,8–5,2 (р=0,048; р=0,03) раза соответственно. Исследования с крысиной ПОРФТ/PRP показали, что в концентрации 1,25% она обладает рост-стимулирующим действием в отношении МСК, но не лимфоцитов, культивированных in vitro. В культуре интактных лимфоцитов ПОРФТ/PRP не оказывала существенного влияния на жизнеспособность клеток при некотором снижении (в 2,7–2,9 раза, p >0,05) количества некротических клеток. В культуре ФМА-активированных лимфоцитов 1,25–2,50% ПОРФТ/PRP обеспечивали повышение количества живых клеток в 1,6–2,2 раза (р=0,002, р=0,01) и снижение числа некротических клеток — в 2,0 раза (р=0,02).
Заключение. МСК, МВ МСК и ПОРФТ/PRP вызывают в убывающем порядке повышение жизнеспособности, подавление позднего апоптоза лимфоцитов селезёнки крыс при культивировании in vitro. Лимфоциты, активированные ФМА, более чувствительны к их витальному действию по сравнению с покоящимися клетками.
387-399