Разработка микроэлектрода для одновременной кальциевой и электрофизиологической регистрации активности нейронов гиппокампа in vivo

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Визуализация кальция (Ca2+) является широко используемым методом в нейробиологии для прижизненной регистрации нейронной активности. Она представляет собой оптическое измерение концентрации кальция с помощью генетически кодируемых кальциевых индикаторов (ГеККИ) [1]. Однако кинетика изменения флуоресценции ГеККИ относительно медленная и ограничена биофизикой связывания индикатора с кальцием [2]. В ответ на одиночные потенциалы действия (ПД) в пирамидальных нейронах большинство широко используемых ГеККИ имеют период полураспада флуоресценции порядка 100 мс [3]. Следовательно, ГеККИ не могут представить полную информацию о динамике нейронных ансамблей. Частично проблема решается путем создания новых вариантов ГеККИ, таких как jGCaMP7 [3], jGCaMP8 [4] или использованием генетически кодируемых индикаторов напряжения (ГеКИН) таких как JEDI-2P [5]. Однако скорость ГеККИ или ГеКИН все еще уступает скорости регистрации электрофизиологических методов. По этой причине мы разработали микроэлектрод, который можно использовать вместе с градиентной линзой для прижизненной кальциевой визуализации посредством минископа.

Минископ представляет собой однофотонный эпифлуоресцентный миниатюрный микроскоп для кальциевой визуализации. В отличие от традиционно применяемой двухфотонной визуализации, минископ позволяет регистрировать нейронную активность у свободно передвигающихся лабораторных животных. Вместо объектива у минископа используется линзы с градиентным показателем преломления (GRIN линзы), которые имплантируется непосредственно в мозг лабораторного животного. Градиентные линзы представляющую собой прозрачный цилиндр диаметром 1.8 мм и длиной 3.8 мм. Для реализации электрофизиологической записи мы разработали микроэлектрод, который можно совместить в GRIN линзой.

Микроэлектрод представляет собой трехслойную структуру: 1 – полиимидная пленка, 2 – токопроводящие медные дорожки, нанесенных методом термоформовки, 3 – полиимидная пленка с вырезами для контактных площадок. На одной из сторон микроэлектрода расположены 12 позолоченных токопроводящих контактов для регистрации локальных полевых потенциалов, а на другой стороне аналогичное количество токопроводящих дорожек для подключения коннектора, осуществляющего передачу данных на плату обработки. Гибкий микроэлектрод оборачивается вокруг градиентной линзы с фиксацией путем термоформовки и впоследствии имплантируется в головной мозг животного.

С помощью разработанного микроэлектрода мы планируем провести сравнительный анализ кальциевой и электрофизиологической активности нейронов гиппокампа свободно передвигающихся мышей дикого типа и с моделью болезни Альцгеймера. Данное исследование позволит выявить нарушения при болезни Альцгеймера на уровне нейронных ансамблей и как следствие предположить потенциально новые методы лечения или механизмы развития патологии, связанной с прогрессирующей потерей памяти при болезни Альцгеймера. Мы благодарны Большаковой Анастасии Викторовне за административную помощь, а также сотрудникам Лаборатории молекулярной нейродегенерации за помощь и полезные советы.

Полный текст

Визуализация кальция (Ca2+) является широко используемым методом в нейробиологии для прижизненной регистрации нейронной активности. Она представляет собой оптическое измерение концентрации кальция с помощью генетически кодируемых кальциевых индикаторов (ГеККИ) [1]. Однако кинетика изменения флуоресценции ГеККИ относительно медленная и ограничена биофизикой связывания индикатора с кальцием [2]. В ответ на одиночные потенциалы действия (ПД) в пирамидальных нейронах большинство широко используемых ГеККИ имеют период полураспада флуоресценции порядка 100 мс [3]. Следовательно, ГеККИ не могут предоставить полную информацию о динамике нейронных ансамблей. Частично проблема решается путём создания новых вариантов ГеККИ, таких как jGCaMP7 [3], jGCaMP8 [4], или использованием генетически кодируемых индикаторов напряжения (ГеКИН), таких как JEDI-2P [5]. Однако скорость ГеККИ или ГеКИН всё ещё уступает скорости регистрации электрофизиологических методов. По этой причине мы разработали микроэлектрод, который можно использовать вместе с градиентной линзой для прижизненной кальциевой визуализации посредством минископа.

Минископ представляет собой однофотонный эпифлуоресцентный миниатюрный микроскоп для кальциевой визуализации. В отличие от традиционно применяемой двухфотонной визуализации, минископ позволяет регистрировать нейронную активность у свободно передвигающихся лабораторных животных. Вместо объектива у минископа используются линзы с градиентным показателем преломления (GRIN-линзы), которые имплантируются непосредственно в мозг лабораторного животного. Градиентные линзы представляют собой прозрачный цилиндр диаметром 1,8 мм и длиной 3,8 мм. Для реализации электрофизиологической записи мы разработали микроэлектрод, который можно совместить в GRIN-линзой.

Микроэлектрод представляет собой трёхслойную структуру: 1 — полиимидная плёнка; 2 — токопроводящие медные дорожки, нанесённые методом термоформовки; 3 — полиимидная плёнка с вырезами для контактных площадок. На одной из сторон микроэлектрода расположены 12 позолоченных токопроводящих контактов для регистрации локальных полевых потенциалов, а на другой стороне — аналогичное количество токопроводящих дорожек для подключения коннектора, осуществляющего передачу данных на плату обработки. Гибкий микроэлектрод оборачивается вокруг градиентной линзы с фиксацией путём термоформовки и впоследствии имплантируется в головной мозг животного.

С помощью разработанного микроэлектрода мы планируем провести сравнительный анализ кальциевой и электрофизиологической активности нейронов гиппокампа свободно передвигающихся мышей дикого типа и с моделью болезни Альцгеймера. Данное исследование позволит выявить нарушения при болезни Альцгеймера на уровне нейронных ансамблей и, как следствие, предложить потенциально новые методы лечения или механизмы развития патологии, связанной с прогрессирующей потерей памяти при болезни Альцгеймера.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Источник финансирования. Авторы благодарят Большакову Анастасию Викторовну за административную помощь, а также сотрудников лаборатории молекулярной нейродегенерации за помощь и полезные советы. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда «Исследование кальциевой и электрофизиологической активности нейронов гиппокампа in vivo у мышей с моделью болезни Альцгеймера» (№ 22-75-00028).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

×

Об авторах

А. И. Ерофеев

Институт биомедицинских систем и биотехнологий, Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого

Автор, ответственный за переписку.
Email: alexandr.erofeew@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург

Е. К. Винокуров

Институт биомедицинских систем и биотехнологий, Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого

Email: alexandr.erofeew@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург

О. Л. Власова

Институт биомедицинских систем и биотехнологий, Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого

Email: alexandr.erofeew@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург

И. Б. Безпрозванный

Институт биомедицинских систем и биотехнологий, Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого; University of Texas Southwestern Medical Center

Email: alexandr.erofeew@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург; Даллас, США

Список литературы

  1. Grienberger C., Konnerth A. Imaging calcium in neurons // Neuron. 2012. Vol. 73, N 5. P. 862–885. doi: 10.1016/j.neuron.2012.02.011
  2. Tay L.H., Griesbeck O., Yue D.T. Live-cell transforms between Ca2+ transients and FRET responses for a troponin-C-based Ca2+ sensor // Biophys J. 2007. Vol. 93, N 11. P. 4031–4040. doi: 10.1529/biophysj.107.109629
  3. Dana H., Sun Y., Mohar B., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments // Nat Methods. 2019. Vol. 16, N 7. P. 649–657. doi: 10.1038/s41592-019-0435-6
  4. Zhang Y., Looger L.L. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for neuronal imaging // J Physiol. 2023. Vol. P. 10.1113/JP283832P. doi: 10.1113/JP283832
  5. Liu Z., Lu X., Villette V., et al. Sustained deep-tissue voltage recording using a fast indicator evolved for two-photon microscopy // Cell. 2022. Vol. 185, N 18. P. 3408–3425.e29. doi: 10.1016/j.cell.2022.07.013

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор, 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».