Закономерности паттернов экспрессии генов, мутированных у пациентов с нарушениями развития нервной системы
- Авторы: Кондакова Е.В.1,2, Гавриш М.С.1, Филатьева А.Е.1, Тарабыкин В.С.3
-
Учреждения:
- Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
- Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук
- Институт клеточной биологии и нейробиологии клиники Шарите
- Выпуск: Том 18, № 4 (2023)
- Страницы: 494-497
- Раздел: Материалы конференции
- URL: https://bakhtiniada.ru/2313-1829/article/view/256253
- DOI: https://doi.org/10.17816/gc623462
- ID: 256253
Цитировать
Открытый доступ
Доступ предоставлен
Только для подписчиков
Аннотация
Нарушения развития нервной системы — Neurodevelopmental Disorders (NDD) — гетерогенная группа расстройств с различными проявлениями, включая микроцефалию, структурные аномалии мозга, эпилепсию, задержку развития, умственную отсталость и расстройства аутистического спектра [1]. Каждый тип расстройства развития нервной системы встречается относительно редко, но в совокупности они составляют большую популяцию неврологических пациентов. NDD по распространенности превышают 15% во всем мире [2]. Нарушения развития нервной системы обычно являются результатом нарушения строго регулируемых молекулярных каскадов, вызванных либо генными мутациями, либо факторами окружающей среды. Генетику значительной части этих расстройств трудно определить, так как часть из них не обязательно наследуются по менделевским принципам и предполагают вклад аллельных вариантов в нескольких генах. Однако, по некоторым оценкам, примерно 40% NDD являются моногенными состояниями, преимущественно обусловленными повреждениями одного гена [3].
Для понимания и прогнозирования физиологической роли белка и кодирующего его гена, установления его взаимодействий с другими белками, а также для понимания роли гена в развитии различных органов и тканей важную роль играет установление того, на каком сроке развития и в какой ткани экспрессируется этот ген. Поэтому первым этапом в изучении генов, мутации в которых приводят к нарушениям развития нервной системы, является изучение паттерна экспрессии этих генов в головном мозге мыши на различных эмбриональных стадиях развития.
Для отображения паттерна экспрессии генов на срезах ткани головного мозга мыши использовали технологию гибридизации РНК in situ (ISH). Предварительно зафиксированные в 4% PFA/PBS/DEPC образцы головного мозга мыши на эмбриональных (E12.5, E15.5, E18.5) и постнатальных (Р1, Р21) стадиях развития нарезали на криостате Leica CM1520 с толщиной среза 15 мкм. Далее проводили гибридизацию клеточной мРНК с РНК-зондами, меченными DIG-dUTP (дигоксигенином) и предварительно синтезированными методом ПЦР с кДНК с использованием ген-специфичных праймеров. Для визуализации локализации экспрессии мРНК в тканях использовали 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий (BCIP/NBT), который, вступая в реакцию с щелочной фосфатазой, даёт нерастворимый осадок тёмно-синего или фиолетового цвета, который виден в световой микроскоп.
В результате была изучена экспрессия одного из представителей семейства генов CCDC, кодирующих белки, которые участвуют в межклеточной трансмембранной передаче сигнала. Гибридизация in situ на срезах головного мозга мыши выявила распространённую экспрессию мРНК изучаемого гена в коре больших полушарий. В дальнейшем планируется выполнение частичного нокаута изучаемого гена с последующим выявлением его роли в нарушениях развития нервной системы.
Ключевые слова
Полный текст
Нарушения развития нервной системы — Neurodevelopmental Disorders (NDD) — гетерогенная группа расстройств с различными проявлениями, включая микроцефалию, структурные аномалии мозга, эпилепсию, задержку развития, умственную отсталость и расстройства аутистического спектра [1]. Каждый тип расстройства развития нервной системы встречается относительно редко, но в совокупности они составляют большую популяцию неврологических пациентов. NDD по распространенности превышают 15% во всем мире [2]. Нарушения развития нервной системы обычно являются результатом нарушения строго регулируемых молекулярных каскадов, вызванных либо генными мутациями, либо факторами окружающей среды. Генетику значительной части этих расстройств трудно определить, так как часть из них не обязательно наследуются по менделевским принципам и предполагают вклад аллельных вариантов в нескольких генах. Однако, по некоторым оценкам, примерно 40% NDD являются моногенными состояниями, преимущественно обусловленными повреждениями одного гена [3].
Для понимания и прогнозирования физиологической роли белка и кодирующего его гена, установления его взаимодействий с другими белками, а также для понимания роли гена в развитии различных органов и тканей важную роль играет установление того, на каком сроке развития и в какой ткани экспрессируется этот ген. Поэтому первым этапом в изучении генов, мутации в которых приводят к нарушениям развития нервной системы, является изучение паттерна экспрессии этих генов в головном мозге мыши на различных эмбриональных стадиях развития.
Для отображения паттерна экспрессии генов на срезах ткани головного мозга мыши использовали технологию гибридизации РНК in situ (ISH). Предварительно зафиксированные в 4% PFA/PBS/DEPC образцы головного мозга мыши на эмбриональных (E12.5, E15.5, E18.5) и постнатальных (Р1, Р21) стадиях развития нарезали на криостате Leica CM1520 с толщиной среза 15 мкм. Далее проводили гибридизацию клеточной мРНК с РНК-зондами, меченными DIG-dUTP (дигоксигенином) и предварительно синтезированными методом ПЦР с кДНК с использованием ген-специфичных праймеров. Для визуализации локализации экспрессии мРНК в тканях использовали 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий (BCIP/NBT), который, вступая в реакцию с щелочной фосфатазой, даёт нерастворимый осадок тёмно-синего или фиолетового цвета, который виден в световой микроскоп.
В результате была изучена экспрессия одного из представителей семейства генов CCDC, кодирующих белки, которые участвуют в межклеточной трансмембранной передаче сигнала. Гибридизация in situ на срезах головного мозга мыши выявила распространённую экспрессию мРНК изучаемого гена в коре больших полушарий. В дальнейшем планируется выполнение частичного нокаута изучаемого гена с последующим выявлением его роли в нарушениях развития нервной системы.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке министерства науки и высшего образования РФ (грант № FSWR-2023-0029).
Об авторах
Е. В. Кондакова
Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук
Автор, ответственный за переписку.
Email: elen_kondakova@list.ru
Россия, Нижний Новгород; Томск
М. С. Гавриш
Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
Email: elen_kondakova@list.ru
Россия, Нижний Новгород
А. Е. Филатьева
Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
Email: elen_kondakova@list.ru
Россия, Нижний Новгород
В. С. Тарабыкин
Институт клеточной биологии и нейробиологии клиники Шарите
Email: elen_kondakova@list.ru
Германия, Берлин
Список литературы
- Mitani T., Isikay S., Gezdirici A., et al. High prevalence of multilocus pathogenic variation in neurod velopmental disorders in the Turkish population // American Journal of Human Genetics. 2021 Vol. 108, N 10. P. 1981–2005. doi: 10.1016/j.ajhg.2021.08.009
- Barkovich A.J., Guerrini R., Kuzniecky R.I., et al. A developmental and genetic classification for malformations of cortical development: update 2012 // Brain. 2012. Vol. 135 (Pt 5). P. 1348–1369. doi: 10.1093/brain/aws019
- Mesnil M., Defamie N., Naus C., Sarrouilhe D. Brain Disorders and Chemical Pollutants: A Gap Junction Link? // Biomolecules. 2020. Vol. 11, N 1. P. 51. doi: 10.3390/biom11010051
Дополнительные файлы
