Adaptation of a protocol for the automated solid-phase phosphoramidite synthesis of oligodeoxyribonucleotides for the preparation of their N-unsubstituted phosphoramidate analogues (P-NH2)

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

A new approach to the automated synthesis of N-unsubstituted phosphoramidate oligodeoxyribonucleotides (P-NH2) based on an optimized solid-phase phosphoramidite protocol using the Staudinger reaction has been proposed. The rapid and efficient oxidation of model P(III)-containing phosphite triethers by the organic azide (9H-fluoren-9-yl)methylcarbonylazide (FmocN3) to the corresponding phosphamides –(OPO(OR)(NFmoc))–, where R is a residue of nucleoside or alkyl nature, has been demonstrated. Removal of the alkaline-labile fluorenyl group from the modified internucleoside linkage allows the production of electroneutral, under physiological conditions of pH ~7, N-unsubstituted phosphoramidate (–(OPO(O)(NH2))– or (P-NH2)) residues in the oligonucleotide chain instead of the classical negatively charged phosphodiester (–(OPO(O)(O)(O¯))–) or (P-O)) residues. In optimizing the synthetic protocol, it has been demonstrated that to improve the efficiency of P-NH2-oligonucleotide synthesis, it is necessary to include an additional Fmoc-group cleavage step in the automatic synthesis protocol after each oxidation step of the growing oligomer chain via the Staudinger reaction. An almost complete absence of dependence of the P-NH2-oligonucleotide yield on both the localization of the P-NH2-strand in the chain and the type of dinucleotide fragment being modified was shown. A set of mono- and bis-modified octadeoxyribonucleotides was obtained, and a detailed study of the thermal stability of complementary DNA/DNA complexes under different buffer conditions was performed. It was shown that under high ionic strength conditions (1 M NaCl, pH 7.2), the introduction of a single P-NH2 strand reduced the thermostability of the DNA complex by an average of 1.3°C. When the ionic strength of the solution decreases, the destabilizing effect of the P-NH2-modification decreases significantly, which further confirms the electroneutral status of the introduced phosphoramidate linkage. Thus, we have developed a protocol for the preparation of partially modified oligonucleotide derivatives bearing uncharged but isostructured to native P-O-strands – phosphoramidate residues P-NH2.

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Основу всех известных на данный момент в биологии систем хранения и передачи генетической информации составляют биополимеры на основе рибофуранозных нуклеиновых кислот (НК) – ДНК и РНК. Функциональные свойства этих биополимеров уникальны, к ним относятся, в частности, химическая стабильность фосфатных эфиров и диэфиров [1] и доминирующее влияние полианионного фосфодиэфирного скелета на физико-химические свойства НК. Полианионный характер остова НК позволяет облегчить считывание информации путем стабилизации линейной протяженной конформации за счет отталкивания заряда, а также снимает ограничения растворимости, которые накладываются объемной структурой азотистых оснований [2].

С развитием химического синтеза фрагментов нуклеиновых кислот – олигонуклеотидов (ON) – обозначилось их фундаментальное и практическое приложение. Так, например, был предложен антисмысловой подход [3], позволяющий воздействовать на биосинтез белка посредством ингибирования трансляции мРНК за счет комплементарных взаимодействий с РНК-мишенями. Одни из основных препятствий к широкому использованию олигонуклеотидов с природными фосфодиэфирными связями in vivo – деградация олигонуклеотидов в присутствии нуклеаз и низкая эффективность внутриклеточного проникновения. Для снятия описанных ограничений проводятся исследования по разработке модифицированных олигонуклеотидов и их аналогов.

Известно много способов и подходов к изменению физико-химических свойств олигонуклеотидов, в том числе синтез аналогов НК с незаряженным остовом, таких как морфолиновые (РМО) и пептидонуклеиновые кислоты (PNA), алкилфосфонаты, фосфорилгуанидиновые (PGO) и другие N-замещенные амидофосфатные аналоги, а также N-незамещенные амидофосфаты (P-NH2) [4−7]. На основе ряда незаряженных аналогов созданы и одобрены терапевтические препараты для лечения мышечной дистрофии Дюшенна (EXONDYS 51®, 2016; VYONDYS 53®, 2019; VILTEPSO®, 2020; AMONDYS 45®, 2021) [8, 9]. Незаряженные аналоги объединены репрезентативными свойствами – их устойчивостью к действию нуклеаз [10−13], способностью образовывать комплементарные комплексы с природными НК-мишенями [14−16], в особенности PGO гибридизуются даже в условиях с крайне низкой ионной силой растворов, что нереализуемо для природных ON [17]. Как правило, незаряженные последовательности ON характеризуются ограниченной растворимостью в водных растворах [18] и сложностью синтеза некоторых из их представителей [19−21]. В частности, синтез РМО и алкилфосфонатов подразумевает использование дорогостоящих специфических мономеров [22]. В случае PNA вовсе требуется наработка абсолютно неспецифических для нуклеотидной химии аминокислотоподобных мономеров [23]. В этой связи следует отметить, что совместить получение незаряженных аналогов ON со стандартным автоматическим твердофазным амидофосфитным подходом к синтезу олигонуклеотидов, внедряя минимальное количество изменений, удается не всегда. Только при синтезе PGO-аналогов удалось создать подход, наиболее приближенный к стандартным условиям получения олигонуклеотидов [7, 24], поскольку этот способ реализован на основе использования классических общедоступных мономеров и базируется на использовании методики альтернативного окисления атома P(III) по реакции Штаудингера, что совмещено с протоколом автоматического синтеза ON. Потенциал применимости PGO в области молекулярной диагностики и биомедицины уже убедительно продемонстрирован [25−32].

В ряду вышеописанных электронейтральных ON стоит обратить особое внимание на N-незамещенные амидофосфатные олигодезоксирибонуклеотиды (или P-NH2-аналоги). В отличие от ранее описанных аналогов, P-NH2 практически изоструктурны природным нуклеиновых кислотам (в первом приближении имея ту же молекулярную массу), но в то же время электронейтральны, благодаря чему сильно отличаются по свойствам от нативных олигонуклеотидов. Впервые их синтез был описан в 1986 г. [33] на примере получения динуклеотида T*T, где звездочкой указано месторасположение модифицированного амидофосфатного звена. В рамках предложенного подхода проводили окислительное амидирование диэфирного H-фосфонатного звена раствором аммиака (10%) в CCl4. После долгого перерыва интерес к их синтезу вновь возник в 1996–1997 гг. [13, 34−39] параллельно у двух независимых групп под руководством Р. Айера и Б. Ренера. В рамках первых работ обозначилась проблема гидролиза при щелочном деблокировании, которую решали, применяя различные стратегии защиты мономеров, пригодные для удаления безводными аммиачными смесями [13, 34]. Кардинальных изменений в способах введения P-NH2-модификации в углеводофосфатный остов не производили, основным подходом по-прежнему оставалось окислительное амидирование. Однако в 1997 г. группой Б. Ренера был представлен иной подход, основанный на окислении OMe-фосфиттриэфирного звена растущей цепи ON по реакции Михаэлиса–Арбузова под действием иода и 2-нитробензиламина с последующим фотолитическим отщеплением 2-нитробензильного остатка [36]. Указанные выше исследовательские группы смогли провести предварительные физико-химические и молекулярно-биологические исследования, в рамках которых показали перспективность N-незамещенных амидофосфатных (P-NH2) аналогов в качестве антисмысловых олигонуклеотидов [35, 37−39]. Позднее, в 2014 г., группа под руководством Д.В. Пышного продемонстрировала подход к синтезу амидофосфатных аналогов с использованием алкил- и арилазидов [40]. На том этапе подход имел ограниченную совместимость этапа окисления выбранными азидами с протоколом стандартного автоматического синтеза ON. Неугасающий интерес к эффективному синтезу P-NH2 продемонстрировала группа М. Карузерса [41], когда в 2015 г. они предложили новый метод постсинтетической модификации боранфосфонатных олигодезоксинуклеотидов посредством иод-зависимого замещения при атоме фосфора с целью получения P-NH2-аналогов. Основное ограничение данного подхода – необходимость использования для синтеза ON неканонических, коммерчески не доступных амидофосфитных мономеров. Таким образом, синтез N-незамещенных амидофосфатных аналогов по представленным схемам неоправданно дорогостоящий для различных групп разработчиков биологически активных соединений на основе ON.

Целью данного исследования было детальное изучение отдельных подходов к разработке унифицированного способа автоматического синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих N-незамещенные амидофосфатные остатки –(OPO(O)(NH2))– (P-NH2) вместо межнуклеозидных фосфатных остатков –(OPO(O)(O¯))– (PO). Создаваемый подход должен позволять вводить модификации в различные положения олигонуклеотидной цепи и должен быть совместим с использованием стандартных, коммерчески доступных амидофосфитных мономеров и твердофазных носителей на основе CPG. В рамках такого подхода предшественником P-NH2-модификации может выступить органический азид, способный эффективно окислять промежуточный продукт олигонуклеотидного синтеза – фосфиттриэфир – и нести группировки, удаляемые при деблокировании целевого олигомера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее в ряде работ [24, 42−44] была неоднократно показана применимость реакции Штаудингера для получения N-замещенных амидофосфатных ON в рамках стандартного амидофосфитного твердофазного синтеза ON. При таком подходе фосфиттриэфир P(III), образующийся на этапе конденсации амидофосфита и 5'-OH-компонента при наращивании ON-цепи, окисляется до иминофосфорана P(V) при обработке органическим азидом. В данной работе мы также постарались оптимизировать использование окисления по классической схеме Штаудингера для осуществления автоматического синтеза N-незамещенных амидофосфатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов. Для окисления P(III) до P(V) в ходе реакции Штаудингера в качестве азидного компонента был выбран (9-флуоренил)-метоксикарбонилазид (FmocN3). Соответствующий азид был получен из коммерчески доступного хлорформата (FmocCl) по методу, аналогичному описанному в работе [45]. Азид получен с высоким выходом и охарактеризован методами 1H-ЯМР- и ИК-спектроскопии (рис. S1 и S2 в дополнительных материалах). Важно отметить, что Fmoc-группа относится к разряду щелочелабильных защитных остатков [45], что дает основание предполагать ее функциональную стабильность в рамках синтетического цикла при автоматическом синтезе ON.

На первом этапе исследования мы доказали (схема 1), что выбранный нами азид (FmocN3) быстро реагирует как с 5′-DMTr-2′-дезокситимидин-3′-[(β-цианэтил)-(N,N-диизопропил)]амидофосфитом (I), так и с 5'-DMTr-2'-дезокситимидин-3'-[(β-цианэтил)-изопропил]фосфиттриэфиром (II). По данным 31P-ЯМР-спектроскопии, соединения (I) и (II) менее чем за 5 мин после добавления FmocN3 превращаются в соответствующие иминофосфораны (III) и (IV), что можно было ожидать из работы М.А. Баженова с соавт. [46]. Следует отметить, что взаимодействие органического азида (FmocN3) с указанными P(III)-содержащими соединениями фосфора протекало, как и ожидалось, с интенсивным выделением газа – молекулярного азота.

 

Схема 1. Стадии превращения тимидинамидофосфита при окислении FmocN3 по реакции Штаудингера с указанием 31P-ЯМР-характеристик, полученных в ходе эксперимента. Соединение (VI) не было зарегистрировано в ходе превращений и указано здесь как ожидаемый продукт с диапазоном химических сдвигов, представленным в литературе [41, 47].

 

Реакции FmocN3 с амидофосфитом и фосфиттриэфиром проводили непосредственно в ампулах ЯМР. Образование соединений (III) и (IV) регистрировали по ядрам [31P] без последующего выделения соответствующих продуктов в индивидуальном состоянии. По данным ЯМР-спектроскопии, переход от P(III)-содержащих соединений, характеризуемых химическими сдвигами ~139–148 м.д., к P(V)-содержащим аддуктам (химический сдвиг ~5.5–15.1 м.д.) регистрируется практически сразу после контакта FmocN3 с источником трехвалентного фосфора. Таким образом, было доказано, что выбранный реагент FmocN3, при используемых избытках (1 : 1.8 экв.) способен количественно окислять P(III)-атом фосфора в составе соединений (I) и (II).

Обработка амидофосфата (IV) сильным основанием 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-еном (DBU) должна была привести к получению изопропильного P-NH2-производного тимидилата (VI) (ожидаемый амидофосфат). К удивлению, химический сдвиг атома [31P]-фосфора, зарегистрированный для хроматографически чистого DMTr-2'-дезокситимидин-3'-изопропиламидофосфата (V) (в форме смеси Rp- и Sp-диастереомеров), составил значения, равные 8.4 и 8.9 м.д. По данным работ [41, 47], для атома фосфора в составе P-NH2-модификации в цепи олигонуклеотида должны были бы регистрироваться значения химических сдвигов в диапазоне 9.5–10.5 м.д. (в зависимости от растворителя), что соответствует, по мнению авторов указанных работ, именно электронейтральной форме амидофосфатного звена. Позднее, получив Т*T5-олигонуклеотид (здесь и далее по тексту звездочкой указано месторасположение амидофосфатного звена, имеющего структуру –(OPO(O)(NH2))– или –(OPO(O–)(NFmoc))–, при необходимости уточнения приводятся сокращенные обозначения, например, T(–P(V) –NH2–)T или T(–P(V)=N-Fmoc–)T), мы зарегистрировали химический сдвиг атома фосфора в составе амидофосфатного остатка, равный 11.8 м.д. (рис. S3 в дополнительных материалах), что соответствует ранее опубликованным данным [41, 47]. Мы считаем, что ожидаемый амидофосфат –(OPO(O)(NH2))– (VI) (схема 1), после хроматографического выделения в присутствии избытка триэтиламина ((С2H5)3N), должен преимущественно находиться в виде стабильной ионизированной имидофосфатной формы –(OPO(N=H)(O–))(Et3NH+)– (V). Этот факт подтверждается тем, что соединение (V) по данным ESI-MS-анализа (рис. 1) таковым и является, т.е. представляет собой солевую форму амидофосфата. Полученные данные хорошо согласуются с результатами работы [48], в которой показано, что амидофосфаты проявляют свойства слабых кислот (pKa ~ 8.2).

 

Рис. 1. ESI-MS-анализ соединения (V) (схема 1) в режиме регистрации положительных ионов.

 

Важно отметить еще раз, что воздействие FmocN3 с P(III)-содержащими соединениями позволяет практически количественно получать соответствующие P(V)-содержащие аддукты. Таким образом, нами показано, что органический азид (в данном случае FmocN3) потенциально пригоден для автоматического синтеза P-NH2-модифицированных олигомеров, т.к. может обеспечить быстрое, в течение нескольких минут, окисление фосфитов до Fmoc-содержащего амидофосфата (IV).

Далее мы апробировали реакцию окисления P(III) до P(V) с помощью FmocN3 в формате автоматического ДНК-синтеза, используя стандартные коммерчески доступные 5'-DMTr-2'-дезокситимидин-3'-[(β-цианэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфитамиды и твердофазный носитель (CPG), содержащий стандартный сукцинатный линкер. Включение P-NH2-модификации в состав растущего ON первоначально проводили, синтезируя модельный гексатимидилат по протоколу, разработанному для синтеза фосфорилгуанидиновых аналогов [32].

На первом этапе провели синтез модельных гексатимидилатов с одной (T*T5) и двумя (T*T*Т4) подряд P-NH2-модификациями вблизи 5'-конца цепи олигонуклеотида. Ожидалось, что на этапе краткосрочного (30 мин, 56°С) финального деблокирования олиготимидилатных производных и отделения от твердофазного носителя концентрированным водным раствором аммиака [49] также должно происходить и удаление Fmoc-защитной группы с P(V)=N-Fmoc-модифицированного иминофосфоранового межнуклеозидного звена, что приводит к формированию N-незамещенного амидофосфатного олигодезоксирибонуклеотида. Однако по данным электрофоретического анализа в денатурирующем ПААГ и ОФ-ВЭЖХ (рис. S3 в дополнительных материалах) целевой продукт удалось получить только для мономодифицированного T*T5 гексатимидилата со степенью превращения не более 35% (рис. S4 в дополнительных материалах, дорожка 2). Такой результат можно было ожидать, опираясь на данные работы относительно стабильности целевого N-незамещенного амидофосфата в условиях аммонолиза [33]. Однако не следует исключать, что P(V)=N-Fmoc-производное может гидролизоваться и до удаления защитной группы [50].

С целью максимального смягчения условий щелочного деблокирования удаление цианэтильных защитных групп проводили в безводных условиях 50%-ным Et3N в CH3CN с последующим отщеплением ON от твердофазного носителя концентрированным водным аммиаком (30 мин, 25°С), финальное удаление DMTr-группы проводили 80%-ной уксусной кислотой после отщепления от полимерного носителя. Поскольку возможной причиной низкой конверсии в целевой продукт могло выступать неполное окисление P(III) на этапе реализации реакции Штаудингера в условиях твердофазного синтеза ON, была проанализирована эффективность получения гексатимидилата T*T5 как в условиях дискретного возрастания концентрации окислителя FmocN3 с 0.1 до 0.25 М, так и варьируя продолжительность этого технологического этапа – 15, 30 и 45 мин. В составе реакционных смесей, отнесенных по совокупности данных масс-спектрометрического (рис. S5 в дополнительных материалах) и хроматографического анализов, идентифицированы нативные пента- и гексатимидилаты (T5 и T6) и целевой N-незамещенный продукт, T*T5 (рис. 2, фракции 1, 2 и 3 соответственно). Кроме того, анализ показал, что при использовании краткосрочной схемы аммонолиза концентрированным водным аммиаком (30 мин, 25°С) исчерпывающего удаления Fmoc-защиты не происходит (рис. 2, фракция 4). Стоит особенно отметить, что данный Fmoc-содержащий амидофосфат, несущий модифицированное фосфодиэфирное звено, аналогичное таковому в соединении (IV) (схема 1), по-видимому, неустойчив в условиях электроспрей-ионизации. По данным MALDITOF-масс-спектрометрического анализа (рис. S6 в дополнительных материалах), хроматографически чистая фракция 4 (рис. 2) имеет в своем составе как гидрофобный защищенный гексатимидилат T(–P(V)=N-Fmoc–)T5, так и значимо более гидрофильный (фракция 3) целевой мономодифицированный продукт, т.е. T(–P(V)–NH2–)T5. Результаты эксперимента четко указывают на то, что увеличение концентрации азида на этапе окисления и увеличение длительности данного этапа значимо повышают выход модифицированного P-NH2-аналога. Важно отметить, что нам удалось, повысив концентрацию окислителя и время обработки FmocN3, достичь более чем 80%-ной суммарной конверсии в олигомер T*T5, по данным офВЭЖХ, даже при использовании классического аммонолиза на финальном этапе синтеза ON.

 

Рис. 2. (а) – офВЭЖХ-анализ реакционных смесей гексатимидилатов (T*T5), полученных в разных условиях окисления по реакции Штаудингера и обработанных концентрированным водным аммиаком в течение 30 мин при 25°С. Градиент концентрации ацетонитрила 0–30% за 15 мин. Соотнесение пиков проводили по совокупности данных масс-спектрометрического анализа (рис. S4 в дополнительных материалах) и сравнения с контрольным олигонуклеотидом T6: пик 1 – Т5, пик 2 – Т6, пик 3 – T(–P(V)–NH2–)T5, пик 4 – T(–P(V)=N–Fmoc–)T5; (б) – условия окисления и степень протекания реакции Штаудингера без учета степени деструкции модифицированного звена, полученные как отношение суммы интегральных площадей пиков 3 и 4 к сумме интегральных площадей всех компонентов реакционной смеси (по данным офВЭЖХ).

 

Таким образом, далее в ходе автоматического синтеза амидофосфатных олигомеров мы использовали следующие режимы для этапа окисления P(III)-триэфира: концентрация окислителя FmocN3 0.25 М в ацетонитриле, длительность реакции Штаудингера при этих условиях – не менее 45 мин.

Поскольку смягчение условий деблокирования не позволило полностью избежать гидролиза модифицированного звена в водно-аммиачной среде, что, несомненно, согласуется с работами [13, 33, 34, 51], было предложено использовать метанольно-аммиачную смесь для финального удаления защитных групп и отщепления от CPG. С целью оценки устойчивости модифицированного звена к условиям деблокирования метанольно-аммиачной смесью часть реакционной смеси T*T5, полученной по протоколу из табл. 1 с увеличением концентрации азида до 0.25 М и увеличенным временем окисления по реакции Штаудингера до 45 мин, дополнительно обработали концентрированным водным аммиаком в течение 24 ч и метанольно-аммиачной смесью в течение 24 ч соответственно (рис. 3, дорожки 6 и 7 соответственно). Электрофоретический анализ показал высокую степень гидролиза модифицированных звеньев в случае обработки реакционной смеси концентрированным водным аммиаком; напротив, обработка метанольно-аммиачной смесью не привела к значительной деструкции амидофосфатных групп.

 

Таблица 1. Стартовый протокол для синтеза модельных гексатимидилат-N-незамещенных амидофосфатных олигонуклеотидов в рамках амидофосфитного твердофазного метода синтеза, разработанный по аналогии с протоколом для синтеза фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов [32]

Стадия

Реагент и условия

Время

Детритилирование

3%-ная трихлоруксусная кислота в CH2Cl2

172 с

Конденсация

0.07 М амидофосфит, 0.25 М 5-этилтио-1Н-тетразол в CH3CN

151 с

Кэпирование

CapA (15% (CH3CH2CO)2O в ТГФ) CapB (13% 1-MeIm, 13% Py в ТГФ)

109 с

Окисление или окисление по Штаудингеру

0.02 М I2, 1% Py, 9% H2O в ТГФ

27 с

0.1 М FmocN3 в CH3CN

1800 с

Деблокирование

Концентрированный NH3·H2O

1–48 ч

 

Рис. 3. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях (8 М мочевина, 89 мМ Tris-боратный буфер, pH 8.3) реакционных смесей олигонуклеотидов T*T5, полученных по протоколу, описанному в табл. 1, с использованием 0.25 М раствора FmocN3 и продолжительностью окисления по реакции Штаудингера 45 мин в зависимости от последовательной постсинтетической обработки: 1, 2 – контрольные T5 и T6 соответственно; 3, 5 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин); 4 – детритилирование на CPG (3%-ная трихлоруксусная кислота в CH2Cl2, 2 мин), удаление Fmoc-группы на CPG (2%-ный раствор DBU в ацетонитриле, 5 мин), аммонолиз (метанольно-аммиачная смесь, 2 ч); 6 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин), дополнительный аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 24 ч); 7 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин), дополнительный аммонолиз (метанольно-аммиачная смесь, 24 ч). Отнесение основных пятен произведено по данным ESI-MS-анализа после выделения офВЭЖХ (рис. S5 в дополнительных материалах).

 

Полученный результат позволяет обоснованно считать, что связь P-NH2 стабильна при обработке метанольно-аммиачной смесью, что подтверждается результатами работы [13]. Однако выбранный подход к удалению защитных групп не позволяет полностью удалить Fmoc-группу за 24 ч, в связи с чем было принято решение использовать предшествующее аммонолизу отщепление Fmoc-защиты обработкой раствором сильного основания (DBU) без отщепления от полимерного носителя согласно работе [34]. На следующем этапе работы мы провели синтез T*T5 с дополнительной обработкой DBU в ацетонитриле перед аммонолизом. В результате электрофоретического разделения реакционной смеси выявлено отсутствие модифицированного олигонуклеотида в ее составе (рис. 3, дорожка 4). Учитывая ранее показанную устойчивость P-NH2-связи к деблокированию в метанольно-аммиачной смеси и к обработке DBU в безводных условиях, причиной отсутствия целевого соединения в реакционной смеси сочли гидролиз (–P(V)=N-Fmoc–)-фрагмента на стадии детритилирования трихлоруксусной кислотой. Предполагаемый механизм включает в себя протонирование сложноэфирной группы Fmoc-фрагмента с последующей локализацией положительного заряда на атоме фосфора и нуклеофильной атакой молекулой воды (схема 2). Присутствие воды на стадии детритилирования полностью исключить невозможно, поскольку в синтетическом цикле присутствует вода в составе иод-содержащего окислителя.

 

Схема 2. Предполагаемый механизм гидролиза Fmoc-содержащего фрагмента на стадии детритилирования трихлоруксусной кислотой во время синтеза P-NH2-олигонуклеотидов.

 

Во избежание гидролиза Fmoc-защищенного олигонуклеотида в кислых условиях в протокол синтеза ввели стадию отщепления защитных групп у амидофосфатного звена обработкой DBU, и, таким образом, в синтетическом цикле стадии детритилирования предшествует стадия отщепления Fmoc- и β-цианэтильной групп с образованием (–P(O)–NH2–)-фрагмента. Внедрение дополнительной стадии в цикл синтеза первоначально проводили вне автоматического синтезатора, для чего извлекали CPG c Fmoc-содержащим олигонуклеотидом из реакционной колонки и обрабатывали в пробирке раствором DBU в ацетонитриле в течение 5 мин при комнатной температуре. Экспериментально показано (рис. 4, дорожка 3), что свободная (–P(V)–NH2–)-связь устойчива к обработке трихлоруксусной кислотой и другими реагентами, используемым в синтетическом цикле.

 

Рис. 4. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях (8 М мочевина, 89 мМ Tris-боратный буфер, pH 8.3) реакционных смесей: 1 и 2 – контрольные олигонуклеотиды T5 и T6 с природными фосфодиэфирными связями; 3 – T2*T4, полученный по способу 1; 4 – T2*T4, полученный по способу 2.

 

Таким образом, внедрение дополнительной стадии отщепления защитных групп у модифицированного фосфата и использование мягкого щелочного деблокирования метанольно-аммиачной смесью позволило разработать протокол синтеза P-NH2-олигонуклеотидов с применением отечественного оборудования, например, ASM-800 (Биоссет, Россия), стандартных коммерчески доступных мономеров и полимерных носителей (табл. 2).

 

Таблица 2. Протокол синтеза N-незамещенных амидофосфатных (P-NH2) олигонуклеотидов в рамках амидофосфитного метода синтеза с использованием стандартных коммерчески доступных мономеров и полимерных носителей для отечественного ДНК/РНК-синтезатора ASM-800 (Биоссет, Россия)

Стадия

Реагент и условия

Время

Детритилирование

3%-ная трихлоруксусная кислота в CH2Cl2

172 с

Конденсация

0.07 М амидофосфит, 0.25 М этилтиотетразол в CH3CN

151 с

Кэпирование

CapA (15% (CH3CH2CO)2O в ТГФ) CapB (13% 1-MeIm, 13% Py в ТГФ)

109 с

Окисление или окисление по Штаудингеру

0.02 М I2, 1% Py, 9% H2O в ТГФ

27 с

0.25 М FmocN3 в CH3CN

2700 с

Удаление Fmoc-группы

2% DBU в CH3CN

300 с

Деблокирование

Метанольно-аммиачная смесь

1–24 ч

 

Следует отметить, что при однократной модификации конверсии в целевой продукт >85% нам добиться не удалось. Так, при синтезе олигомера Т*T5, по данным ВЭЖХ-анализа, наблюдается ~13% продуктов гидролиза после обработки CPG-связанного олигонуклеотида метанольно-аммиачной смесью в течение первых двух часов при комнатной температуре (рис. 5, точка 0; рис. S7 в дополнительных материалах, хроматография 0). Видно, что вплоть до 5 ч дополнительного выдерживания Т*T5 в среде NH3/CH3OH при 56°С значимой деградации амидофосфат-содержащего аналога не происходило. Лишь спустя сутки (56°С) уровень деградации целевого продукта приближался к 50% (рис. 5, точка 23 ч; рис. S7 в дополнительных материалах, хроматография Б4). Напротив, в случае дополнительного выдерживания в среде NH3/H2O при 56°С спустя 1 ч заметна серьезная деградация амидофосфатной группы. Следует отметить, что в случае использования для синтеза олигомеров НК коммерчески доступных мономеров со стандартными защитными группами рекомендованное время деблокирования НК водно-аммиачной смесью не превышает 40 ч при комнатной температуре [52]. В случае использования метанольно-аммиачной смеси достаточно 18 ч при комнатной температуре, что было подтверждено экспериментально (рис. S8 в дополнительных материалах). Поскольку результат эксперимента демонстрирует устойчивость амидофосфатной группы к метанольно-аммиачной смеси на довольно продолжительном промежутке времени, “исходная” степень деструкции (–P(V)–NH2–)-содержащего олигонуклеотида, полученная после первых двух часов деблокирования при комнатной температуре и превышающая 10% по данным офВЭЖХ, не может быть вызвана гидролизом модифицированного звена в ходе деблокирования.

 

Рис. 5. Устойчивость P-NH2-олигонуклеотидов к деблокированию метанольно-аммиачной смесью по сравнению со стандартным удалением защитных групп с использованием концентрированного водного аммиака, определенная по данным офВЭЖХ.

 

Последующие эксперименты были направлены на выяснение других причин, влияющих на выход целевого N-незамещенного амидофосфатного олигонуклеотидного продукта. Для этого мы поставили задачи установить, зависит ли степень гидролиза амидофосфатной связи от следующих факторов:

  1. места расположения одиночной P-NH2-модификации в цепи олигонуклеотида,
  2. типа прилегающих к ней нуклеозидов,
  3. стадии синтетического цикла.

 

  1. Для оценки влияния места расположения модификации были синтезированы гексатимидилаты, содержащие одиночную (–P(V)–NH2–)2-группу в каждом из пяти межнуклеозидных положений (Т5*T, Т4*T2, Т3*T3, Т2*T4, Т*T5). Данный прием должен был показать, является ли увеличение числа циклов синтеза нативных фосфодиэфирных звеньев, последовавших за введением (–P(V)–NH2–)-остатков, фактором, определяющим степень гидролиза амидофосфатного фрагмента цепи ON. Было установлено, что вне зависимости от локализации в цепи одиночной амидофосфатной модификации конверсия в целевой гексатимидилатный продукт, по данным офВЭЖХ, составляет в среднем 72%, т.е. не зависит от положения введения (–P(V)–NH2–)-группы (табл. 3, фактор А).
  2. Для ответа на вопрос, поставленный следующей задачей, мы провели синтез двух серий тетрамерных олигонуклеотидов, содержащих вблизи либо 5'-, либо 3'-конца цепи одиночную модификацию динуклеотидного звена Х(–P(V)–NH2–)Т, где Х = G, C, A или Т (табл. 3, фактор Б). Установлено, что, по данным количественного анализа профилей ВЭЖХ, выход целевых P-NH2-аналогов составляет в среднем ~70%.
  3. Для выявления стадии синтетического цикла, оказывающей превалирующее влияние на устойчивость (–P(V)–NH2–)-связи, был проведен скрининг стадий и условий получения T5*T. После стадии окисления промежуточного фосфиттриэфира олигонуклеотида раствором FmocN3 (0.25 M) мы последовательно исключали все стадии технологического цикла (представлены на рис. S9 в дополнительных материалах), обрабатывая затем твердофазный носитель метанольно-аммиачной смесью и оценивая состав реакционных смесей методом офВЭЖХ. На первом этапе выявить основную стадию, в ходе которой бы наблюдалось значимое уменьшение конверсии, не удалось из-за сравнительно малого количества побочных продуктов. Анализируя состав побочных продуктов, первым делом мы решили исключить гидролиз водой, входящей в состав окислителя, и преднамеренно обработали CPG c T5(–P(V)–NH2–)T раствором, содержащим 9% воды и ТГФ в качестве растворителя. При повторном исключении стадий и анализе реакционных смесей получили прирост к содержанию T5 относительно предыдущего эксперимента, в то время как содержание T6 оставалось на прежнем уровне (рис. S9 в дополнительных материалах). Обнаруженный факт привел к заключению: гомогенность реакционных смесей PNH2-олигонуклеотидов, получаемых по разработанному протоколу, напрямую зависит от полноты протекания реакции Штаудингера и практически не обусловливается используемыми в синтетическом цикле реагентами и деблокирующими смесями. В итоге, повторив синтез T5*T с использованием дополнительного окисления иодом после стадии удаления Fmoc-защитной группы, мы получили прирост к содержанию T6 в сравнении с синтезом без дополнительной стадии окисления (рис. 6).

 

Таблица 3. Степень полноты протекания реакции Штаудингера, оцененная по данным офВЭЖХ, в зависимости от факторов, влияющих на устойчивость связи (–P(V)–NH2–), таких как: 1 – число стандартных циклов амидофосфитного синтеза, следующих после стадии модификации; 2 – химическое строение динуклеотида в составе модифицированного звена

Фактор 1

Фактор 2

Последовательность 5'→3'

Доля целевого ON, %

Последовательность 5'→3'

Доля целевого ON, %

Последовательность 5'→3'

Доля целевого ON, %

TTTTT*T

79

G*TTT

60

TTG*T

70

TTTT*TT

73

C*TTT

64

TTC*T

69

TTT*TTT

73

A*TTT

48

TTA*T

69

TT*TTTT

64

T*TTT

74

TTT*T

75

T*TTTTT

72

–

–

–

–

 

Рис. 6. Схема эксперимента по оценке влияния стадии дополнительного окисления смесью I2/Py/H2O на соотношение побочных продуктов при синтезе P-NH2-олигонуклеотида. Оценку влияния проводили по данным офВЭЖХ.

 

При попытке достигнуть полного протекания реакции Штаудингера мы провели синтез T5*T с использованием насыщенного раствора FmocN3 (~0.63 M). К сожалению, используя повышенную концентрацию, не удалось добиться полной конверсии (содержание побочных продуктов составило ~10%). Особенно остро проблема неполной конверсии в целевой амидофосфатный олигонуклеотид встает при переходе к множественной модификации олигонуклеотидной цепи. Причину частичного окисления с использованием FmocN3 в ходе твердофазного синтеза предстоит выяснить в будущих экспериментах.

Гибридизационные свойства P-NH2-ON. Отметим, что к настоящему времени имеется лишь крайне ограниченный набор данных, описывающих комплексообразующие свойства P-NH2-амидофосфатов [25, 35−37]. Именно поэтому мы исследовали способность серии октамерных ДНК, нативного (N8) и модифицированных олигонуклеотидов (Nx*у*z, где х, у, z – порядковые числа нуклеозидов в составе модифицированного звена) к формированию комплементарных комплексов c матричным октамером M8. Отдельной задачей была попытка определить роль влияния P-NH2-модификации на зависимость температуры плавления (Tпл) от ионной силы раствора (табл. 3, рис. 7). Важно отметить, что именно данный фактор – электронейтральность модификации – это ключевое свойство, определяющее фундаментальный потенциал использования рассматриваемых изоструктурных P-NH2-аналогов нативных олигонуклеотидов.

 

Рис. 7. Вклад P-NH2-модификации в термическую стабильность (DT) комплементарных комплексов бисмодифицированных олигодезоксирибонуклеотидов с матрицей AGCTACCG в зависимости от ионной силы раствора относительно немодифицированного комплекса.

 

В табл. 4 представлены термодинамические параметры комплексообразования нативной ДНКматрицы с набором модельных октануклеотидов (Nx*у*z) в стандартных буферных условиях (1 М NaCl, 10 мМ какодилат натрия, pH 7.3). Данные были получены методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала во многоволновом режиме [17]. Представленные данные – результат анализа как профилей кривых термической денатурации, так и ренатурации анализируемых дуплексов. Следует отметить, что взаимодействие всех модельных олигомеров с ДНК-матрицей демонстрирует строго равновесный характер комплексообразования. С учетом погрешности определения величины температуры плавления исследуемых комплексов (~0.2°С) [53] установлено, что введение амидофосфатных остатков в структуру октануклеотидов лишь незначительно влияет на их сродство к мишени ДНК в условиях высокой ионной силы раствора (1 М NaCl) (табл. 4). Вне зависимости от позиции введения модификации в структуре олигомера и числа модифицированных звеньев в среднем наличие одного (–P(V)–NH2–)-звена приводит к снижению термической стабильности ДНК-комплексов на 1.0–2.0°С. Этот факт согласуется с данными работ французских исследователей [35]. Следует отметить, что термостабильность комплексов, формируемых различными фракциями диастереомеров олигомера N(1*6*1), разделенных с помощью ВЭЖХ, в условиях высокой ионной силы раствора практически не отличается (табл. 4).

 

Таблица 4. Результаты исследования термической стабильности олигонуклеотидных комплексов c разным числом и расположением N-незамещенных амидофосфатных групп в олигонуклеотиде Nx*у*z в условиях высокой ионной силы (1 М NaCl)

Комплементарный комплекс AGCTACCG матрицы с олигонуклеотидом

Выход ON после офВЭЖХ, %

∆S°, кал/(К·моль)

∆H°, ккал/моль

∆G°37, ккал/моль

Tпл, °С

∆T, °С

∆T/mod, °С

N8

CGGTAGCT

–

–142 ± 1

–51.5 ± 3.9

–7.4 ± 0.2

39 ± 1

–

–

N(1*7)

C*GGTAGCT

23

–162 ± 2

–57.3 ± 0.7

–7.0 ± 0.1

36 ± 1

–3

–

N(4*4)

CGGT*AGCT

29

–175 ± 3

–61.4 ± 0.9

–7.2 ± 0.1

38 ± 1

–1

–

N(7*1)

CGGTAGC*T

49

–157 ± 4

–56.0 ± 1.3

–7.3 ± 0.1

38 ± 1

–1

–

(1) N(1*6*1)

C*GGTAGC*T

15

–157 ± 3

–55.9 ± 0.9

–7.1 ± 0.1

37 ± 1

–2

–1

(2) N(1*6*1)

C*GGTAGC*T

23

–132 ± 1

–48.2 ± 0.3

–7.2 ± 0.1

37 ± 1

–2

–1

N(6*1*1)

CGGTAG*C*T

33

–146 ± 4

–52.5 ± 1.3

–7.2 ± 0.1

38 ± 1

–1

–1

N(4*1*3)

CGGT*A*GCT

22

–165 ± 4

–58.1 ± 1.3

–6.9 ± 0.1

36 ± 1

–3

–2

N(1*1*6)

C*G*GTAGCT

28

–142 ± 9

–51.0 ± 2.9

–7.0 ± 0.1

37 ± 1

–3

–1

Примечание: для последовательности N(1*6*1) удалось разделить две смеси диастереомеров (1) и (2).

 

Снижение ионной силы буферного раствора (при дискретном переходе от 1 к 0.1 и до 0.01 М раствора NaCl) показало, что для рассмотренных бисмодифицированных октануклеотидов явно выражен эффект введения электронейтральной P-NH2-модификации (рис. 7; табл. S1 в дополнительных материалах). При исследовании мономодифицированных комплексов не удалось обна-ружить статистически значимую зависимость от ионной силы раствора. Очевидно, что наличие P-NH2-модификации в цепи олигомера приводит к достоверно значимому снижению зарядобусловленной компоненты энергии взаимодействия комплементарных цепей. Заметим, что в ряде случаев при пониженной ионной силе (0.01 М NaCl) (–P(V)–NH2–)-содержащие аналоги демонстрируют даже несколько большую термостабильность комплементарных комплексов с ДНК-матрицей относительно таковых с участием нативных олигонуклеотидов. При этом, по-видимому, наблюдается некоторая зависимость термодинамического эффекта от локализации, нуклеотидной последовательности сайта модификации, а также его диастереомерного состояния.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали азид натрия (NaN3), тетраметилэтилендиамин (TEMED), катионный карбоцианиновый краситель Stains-All, трис(гидроксиметил)аминометан (Трис), какодилат натрия (Sigma-Aldrich, США); (9-флуоренил)-метоксикарбонилхлорид (FmocCl) (Fluka, Швейцария); трихлоруксусную кислоту, пиридин, триэтиламин, хлорид натрия, тетрагидрофуран (ТГФ) (Panreac, США); 5-(этилтио)-1H-тетразол (ETT) (Glen Research, США); 1-метилимидазол (Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия); пропионовый ангидрид, 7 М раствор аммиака в метаноле (Acros Organics, США); кристаллический иод, ледяную уксусную кислоту, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na2EDTA), водный аммиак, спирт изопропиловый (Реахим, Россия); (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (DBU) (Alfa Aesar, Германия); акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, персульфат аммония (PSA) (AppliChem, Германия); бромфеноловый синий, ксиленцианол FF (Helicon, Россия); борную кислоту (Химпром, Россия); мочевину (Союзхимпром, Россия); стандартные мономеры для фосфорамидитного протокола, полимерные носители для твердофазного автоматического синтеза с тимидин-, дезоксиаденозин- и дезоксигуанозин-3'-расщепляемым линкером (ChemGenes Co, США); воду бидистиллированную, ацетонитрил (CH3CN) для ВЭЖХ (Fisher Chemical, Китай); дихлорметан (Вектон, Россия); ацетонитрил-d3, пластинки для ТСХ TLC Silica gel 60 F254 (Merck, США); хлороформ-d (Solvex, Россия).

Реактивы и растворители были квалификации х.ч. и о.с.ч. отечественного и импортного производства. Абсолютизирование растворителей проводили стандартными методами с последующим выдерживанием над молекулярными ситами или гидридом кальция.

Масс-спектрометрический анализ (ESI и MALDI-TOF) исследованных соединений проводили в Центре масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН на оборудовании MALDI-TOF Autoflex Speed (Bruker Daltonics, Германия) и ESI LC/MS/MSD XCT (Agilent Technologies, США); определяемый диапазон масс – 105–1600 m/z.

Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре Magritek Spinsolve (Новая Зеландия) с частотой 80 МГц (1H – 80 МГц, 31P – 32 МГц) в CH3CN (при записи 31P) или дейтерированном хлороформе (при записи 1Н).

Структуру органического азида (FmocN3) устанавливали с использованием ИК-Фурье-спектрометра Tensor 27 (Bruker, Германия) на базе НИОХ СО РАН им. Н.Н. Ворожцова. Спектр регистрировали в кювете диаметром 0.28 мм, растворителем выступал хлороформ, концентрация раствора исследуемого азида составила 1 масс.%. ИК-спектр регистрировали в диапазоне 4000– 400 см‒1. Идентификацию химического состава азида проводили по характеристическим полосам поглощения, представленным в литературе [54].

Электрофоретическую подвижность олигонуклеотидов и их аналогов оценивали, используя 15%-ный ПААГ (акриламид : N,N'-метиленбисакриламид (29 : 1), 8 М мочевина, 89 мМ Трис-борат, pH 8.3, 2 мM Na2EDTA, 0.08% TEMED, 0.1% PSA) при напряжении 12 В/м в диапазоне 30– 40 мин. Пробы наносили из буферного раствора, содержащего 0.1 мг/мл ксиленцианола FF в 8 M мочевине. Подвижность оценивали относительно лидирующего красителя – бромфенолового синего. Результаты электрофоретического разделения визуализировали окрашиванием с помощью 0.05%-ного раствора Stains-all в 50%-ном формамиде.

Аналитическую обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (офВЭЖХ) реакционных смесей образцов проводили на хроматографе Милихром A02 (Эконова, Россия) с использованием колонки (2 × 75 мм) с сорбентом ProntoSIL-120-5-C18 (Эконова, Россия) и градиента концентрации CH3CN (0–30%) в 0.02 М водном растворе триэтиламмония ацетата (pH 7.0) в течение 30 мин (скорость потока 200 мкл/мин, температура термостата 35°С). Детекцию ON осуществляли на длинах волн 260, 280 и 300 нм.

Очистку олигонуклеотидов проводили методом офВЭЖХ на хроматографе Agilent 1100 series (Agilent, США). Использовали колонку (4.6 × 150 мм) с сорбентом Eclipse XDB-C18 (5 мкм) (Agilent, США), элюировали в градиенте концентрации CH3CN от 0 до 50% в 0.02 М растворе триэтиламмония ацетата (pH 7.0) за 40 мин, скорость потока 1.5 мл/мин.

Амидофосфатные аналоги олигодезоксирибонуклеотидов синтезировали на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 (Biosset, Россия) с использованием коммерчески доступных мономеров (0.1 M) для амидофосфитного протокола, в качестве активатора применяли раствор ETT (0.25 М) в CH3CN. В качестве кэпирующих агентов выступали CpA – 15%-ный пропионовый ангидрид в ТГФ, CpB – 16%-ный N-метилимидазол в ТГФ. 5'-Диметокситритильную защитную группу удаляли 3%-ной трихлоруксусной кислотой в CH2Cl2. Триэфирфосфиты окисляли до триэфирфосфатов смесью 0.05 М I2, 1% пиридина, 9% H2O в ТГФ. Для получения межнуклеозидного амидофосфата на стадии окисления в процессе твердофазного автоматического синтеза использовали альтернативную программу, основанную на реакции Штаудингера. В качестве окислителя применяли 0.1 М или 0.25 М раствор FmocN3 в CH3CN. Суммарное время окисления составляло 15–45 мин. Удаление Fmoc-защитной группы проводили обработкой 2%-ным раствором DBU в CH3CN в течение 5 мин либо в ходе синтетического цикла на автоматическом ДНК-синтезаторе, либо отдельно в пробирке объемом 1.5 мл.

Термическую денатурацию олигонуклеотидных комплексов проводили на спектрофотометре Cary 300 Biomelt (Varian, Австралия), оснащенном терморегулируемой 6-кюветной приставкой. Компоненты комплексов в эквимолярном соотношении (суммарная концентрация 10 мкМ) в буферном растворе (10 мМ какодилат натрия, 100 мМ NaCl, pH 7.2) нагревали–охлаждали в диапазоне температур от 5 до 95°С со скоростью изменения температуры 0.5°С/мин. Оптическую плотность регистрировали при 260, 270 и 300 нм. Температуру плавления комплекса определяли как температуру, соответствующую максимуму первой производной кривой (или профиля) зависимости оптической плотности образца от температуры.

(9-Флуоренил)-метоксикарбонилазид (FmocN3). (9-Флуоренил)-метоксикарбонилхлорид (1.88 ммоль) растворяли в 10 мл безводного CH3CN. К раствору добавляли 2.64 ммоль сухого NaN3. Полученную суспензию перемешивали 10 ч при нагревании до 40°C. После окончания реакции супернатант отделяли фильтрованием и проводили экстракцию CH2Cl2. Органический слой промывали 1 раз насыщенным солевым раствором, далее 2 раза водой, затем сушили над Na2SO4 (безв.). Растворитель удаляли упариванием на ротационном испарителе. Очистку проводили перекристаллизацией из гексана. Для удаления следов воды остаток в колбе дважды упаривали из ацетонитрила.

ТСХ в системе 85% гексан + 15% CH2Cl2: Rf (FmocCl) = 0.28, Rf (FmocN3) = 0.08.

1H-ЯМР (80 МГц, CDCl3; J, Гц): 7.79 (d, J 6.7, 2H), 7.55 (d, J 1.7, 2H), 7.42 (t, J 4.3, 2H), 7.27 (t, J 1.7, 2H), 4.50 (d, J 6.3, 2H), 4.31 (t, J 7.0, 1H). ИК (см–1): 3037, 2189, 2135, 1734, 1601, 1448, 1375, 1317, 1240, 1111, 1076, 1030, 982, 922, 864, 621, 563, 482, 424.

5'-Диметокситритил-2'-дезокситимидин-3'-[(β-цианэтил)-изопропил]фосфиттриэфир (II). В пластиковой пробирке с завинчивающейся крышкой к 145 мкл 0.1 M раствора 5′-диметокситритил-2′-дезокситимидин-3′-[(β-цианэтил)-(N,N-диизопропил)]амидофосфита (I) в CH3CN (0.01 ммоль) приливали 250 мкл 0.25 M раствора ETT в CH3CN (0.04 ммоль) и 150 мкл изопропанола (абс.) (2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 5 мин при комнатной температуре. Продукт экстрагировали CH2Cl2, в качестве водной фазы использовали фосфатный буфер (1 М KH2PO4, pH 6.5). Органическую фазу упаривали на ротационном испарителе, сухое вещество растворяли в 500 мкл ацетонитрила. Продукт анализировали методами ТСХ и ЯМР-спектроскопии и использовали в последующих реакциях без дополнительной очистки.

ТСХ в системе 90% CH2Cl2 + 10% C2H5OH: Rf (I) = 0.4, Rf (II) = 0.36.

31P-ЯМР (32 МГц, CH3CN): 139.27, 138.88.

5'-Диметокситритил-2'-дезокситимидин-3'-изопропиламидофосфат (V). К полученному фосфиттриэфиру (II) (0.01 ммоль) приливали 0.1 М раствор FmocN3 (0.02 ммоль). Через 5 мин после перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь анализировали методами ТСХ и ЯМР-спектроскопии.

ТСХ в системе 90% CH2Cl2 + 10% C2H5OH: Rf (II) = 0.36, Rf (IV) = 0.30.

31P-ЯМР (32 МГц, CH3CN): 5.70, 5.46.

К полученной реакционной смеси добавляли 15 мкл DBU с конечным содержанием основания в системе 2%, выдерживали 5 мин при комнатной температуре, затем анализировали методами ТСХ и ЯМР-спектроскопии.

ТСХ в системе 90% CH2Cl2 + 10% C2H5OH: Rf (IV) = 0.30, Rf (V) = 0.15, 0.10 (в виде двух диастереомеров).

31P-ЯМР (32 МГц, CH3CN): 5.70, 5.46.

Далее раствор экстрагировали CH2Cl2, водная фаза – 1 M KH2PO4 (pH 6.5). Органическую фазу упаривали на ротационном испарителе. Продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле, подвижная фаза – раствор CH2Cl2, содержащий 1% C2H5OH и 0.1% (C2H5)3N. Затем проводили масс-спектрометрический анализ ESI (m/z): 767.0, mтеор. = 766.9 г/моль; mэксп. = 767.0 г/моль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе описан новый подход к синтезу олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих одну или несколько N-незамещенных амидофосфатных P-NH2-модификаций, основанный на использовании 9-(флуоренил)-метоксикарбонилазида (FmocN3) в рамках реакции окисления P(III) по классической реакции Штаудингера. Основное преимущество разрабатываемого синтетического подхода – его совместимость с протоколом автоматического твердофазного амидофосфитного синтеза олигонуклеотидов, основанного на использовании стандартных защитных групп и линкеров на поверхности CPG-носителя. Нам, к сожалению, не удалось осуществить высокоэффективный синтез электронейтральных, изоструктурных фосфодиэфирному остатку, производных олигонуклеотидов. При этом предложены условия к получению любых мономодифицированных олигодезоксирибонуклеотидов (с выходами ~80%). Однако это дало возможность детально описать влияние модификации на комплексообразование (–P(V)–NH2–)-содержащих производных с ДНК-матрицей с точки зрения термодинамических свойств. Важным аспектом исследования стал тот факт, что амидофосфатная группа, находясь внутри олигонуклеотидной цепи, по-видимому, имеет возможность формировать неканонические водородные связи, влияя тем самым на распределение структурных форм свободного олигомера и/или его дуплексной формы. При этом такие неканонические взаимодействия с участием H-донорного (–P(V)–NH2–)-остатка не во всех случаях могут содействовать стабилизации комплементарных комплексов ДНК. Кроме того, электронейтральность P-NH2-группы оказывается обоснованно значимым параметром, определяющим перспективность использования соответствующих изоструктурных аналогов нативных олигонуклеотидов в молекулярно-биологических исследованиях, что было уже неоднократно продемонстрированно ранее [25, 32, 40]. Значимость экспериментально наблюдаемых эффектов, достигаемых при использовании N-незамещенных амидофосфатных производных олигонуклеотидов, очевидно, должна возрастать со снижением ионной силы буферной среды, т.е. в условиях роста значимости электростатических взаимодействий биомолекул. В таких условиях P-NH2-модификация даже может способствовать формированию ДНК-дуплексов. Считаем необходимым в дальнейшем совершенствовать подходы к автоматическому синтезу (–P(V)–NH2–)-содержащих олигонуклеотидов – уникальных изоструктурных аналогов природных биополимеров, лишенных в сайте модификации отрицательного заряда фосфодиэфирного звена при сохранении молекулярной массы, поскольку Ar(O) ~ Mr(NH2) = 16 Да, фрагменты –(OPO(O)(O–))– и –(OPO(O)(NH2))– в структуре ДНК практически тождественны. Именно это обстоятельство обусловливает целесообразность разработки эффективных методов синтеза и детального изучения свойств P-NH2-аналогов олигонуклеотидов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность М.А. Баженову за конструктивную критику при планировании экспериментов и обсуждении результатов, а также ОЦКП ИХБФМ СО РАН за масс-спектрометрический анализ олигонуклеотидов и Химическому исследовательскому центру коллективного пользования СО РАН (НИОХ СО РАН) за проведение спектральных и аналитических измерений.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Синтез модифицированных олигонуклеотидов проводили при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-64-00017), а исследование их свойств выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, государственное задание ИХБФМ СО РАН № 121031300042-1.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований, выполненных автором данной работы, с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Автор ЕАМ участвовал в разработке и проведении экспериментов, анализе данных и подготовке текста статьи. Авторы ИАП, МИМ участвовали в анализе данных и подготовке текста статьи. Автор ДВП участвовал в разработке методологии, а также в доработке финального варианта текста статьи.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие выводы настоящего ис-следования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

×

Sobre autores

E. Malova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: malova.ev.an@gmail.com
Rússia, prosp. Acad. Lavrentyeva 8, Novosibirsk, 630090

I. Pyshnaya

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
Rússia, prosp. Acad. Lavrentyeva 8, Novosibirsk, 630090

M. Meschaninova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
Rússia, prosp. Acad. Lavrentyeva 8, Novosibirsk, 630090

D. Pyshnyi

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
Rússia, prosp. Acad. Lavrentyeva 8, Novosibirsk, 630090

Bibliografia

  1. Knouse K., Flood D., Vantourout J., Schmidt M., McDonald I., Eastgate M., Baran P. // ACS Cent. Sci. 2021. V. 7. P. 1473–1485. https://doi.org/10.1021/acscentsci.1c00487
  2. Benner S., Hurter D. // Bioorg. Chem. 2002. V. 30. P. 62–80. https://doi.org/10.1006/bioo.2001.1232
  3. Agrawal S. // Trends Biotechnol. 1996. V. 14. P. 376–387. https://doi.org/10.1016/0167-7799(96)10053-6
  4. Duffy K., Arangundy-Franklin S., Holliger P. // BMC Biol. 2020. V. 18. P. 112. https://doi.org/10.1186/s12915-020-00803-6
  5. Oberemok V., Laikova K., Repetskaya A., Kenyo I., Gorlov M., Kasich I., Krasnodubets A., Gal’chinsky N., Fomochkina I., Zaitsev A., Bekirova V., Seidosmanova E., Dydik K., Meshcheryakova A., Nazarov S., Smagliy N., Chelengerova E., Kulanova A., Deri K., Subbotkin M., Useinov R., Shumskykh M., Kubyshkin A. // Molecules. 2018. V. 23. P. 1302. https://doi.org/10.3390/molecules23061302
  6. Clavé G., Reverte M., Vasseur J.-J., Smietana M. // RSC Chem. Biol. 2021. V. 2. P. 94–150. https://doi.org/10.1039/D0CB00136H
  7. Kandasamy P., Liu Y., Aduda V., Akare S., Alam R., Andreucci A., Boulay D., Bowman K., Byrne M., Cannon M., Chivatakarn O., Shelke J.D., Iwamoto N., Kawamoto T., Kumarasamy J., Lamore S., Lemaitre M., Lin X., Longo K., Looby R., Marappan S., Metterville J., Mohapatra S., Newman B., Paik I.H., Patil S., Purcell-Estabrook E., Shimizu M., Shum P., Standley S., Taborn K., Tripathi S., Yang H., Yin Y., Zhao X., Dale E., Vargeese C. // Nucleic Acids Res. 2022. V. 50. P. 5401–5423. https://doi.org/10.1093/nar/gkac037
  8. Egli M., Manoharan M. // Nucleic Acids Res. 2023. V. 51. P. 2529–2573. https://doi.org/10.1093/nar/gkad067
  9. de la Torre B., Albericio F. // Molecules. 2023. V. 28. P. 1038. https://doi.org/10.3390/molecules28031038
  10. Nielsen P. // Mol. Biotechnol. 2004. V. 26. P. 233–248. https://doi.org/10.1385/MB:26:3:233
  11. Nielsen P. // Chem. Biodivers. 2010. V. 7. P. 786–804. https://doi.org/10.1002/cbdv.201000005
  12. Arangundy-Franklin S., Taylor A., Porebski B., Genna V., Peak-Chew S., Vaisman A., Woodgate R., Orozco M., Holliger P. // Nat. Chem. 2019. V. 11. 533– 542. https://doi.org/10.1038/s41557-019-0255-4
  13. Peyrottes S. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 1841– 1848. https://doi.org/10.1093/nar/24.10.1841
  14. Chubarov A.S., Oscorbin I.P., Novikova L.M., Filipenko M.L., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V. // Diagnostics. 2023. V. 13. P. 250. https://doi.org/10.3390/diagnostics13020250
  15. Dong Z., Chen X., Zhuo R., Li Y., Zhou Z., Sun Y., Liu Y., Liu M. // BMC Biol. 2023. V. 21. P. 95. https://doi.org/10.1186/s12915-023-01599-x
  16. Sarkar S. // Biopolymers. 2023. V. 115. P. e23567. https://doi.org/10.1002/bip.23567
  17. Lomzov A.A., Kupryushkin M.S., Dyudeeva E.S., Pyshnyi D.V. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 461–468. https://doi.org/10.1134/S1068162021020151
  18. Summerton J. // Int. J. Pept. Res. Ther. 2003. V. 10. P. 215–236. https://doi.org/10.1007/s10989-004-4913-y
  19. Bhadra J., Pattanayak S., Sinha S. // Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2015. V. 62. P. 4.65.1–4.65.26. https://doi.org/10.1002/0471142700.nc0465s62
  20. Braasch D., Nulf C., Corey D. // Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2002. V. 9. P. 4.11.1–4.11.18. https://doi.org/10.1002/0471142700.nc0411s09
  21. Kostov O., Páv O., Rosenberg I. // Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2017. V. 70. P. 4.76.1–4.76.22. https://doi.org/10.1002/cpnc.35
  22. Micklefield J. // Curr. Med. Chem. 2001. V. 8. P. 1157– 1179. https://doi.org/10.2174/0929867013372391
  23. Lee H., Jeon J., Lim J., Choi H., Yoon Y., Kim S. // Org. Lett. 2007. V. 9. P. 3291–3293. https://doi.org/10.1021/ol071215h
  24. Купрюшкин М.С., Пышный Д.В., Стеценко Д.А. // Act. Nat. 2014. Т. 6. C. 116–118. https://doi.org/10.32607/20758251-2014-6-4-116-118
  25. Kuznetsov N.A., Kupryushkin M.S., Abramova T.V., Kuznetsova A.A., Miroshnikova A.D., Stetsenko D.A., Pyshnyi D.V., Fedorova O.S. // Mol. Biosyst. 2016. V. 12. P. 67–75. https://doi.org/10.1039/c5mb00692a
  26. Новопашина Д.С., Назаров А.С., Воробьева М.А., Купрюшкин М.С., Давыдова А.С., Ломзов А.А., Пышный Д.В., Altman S., Веньяминова А.Г. // Мол. биология. 2018. T. 52. С. 1045–1054. https://doi.org/10.1134/S0026898418060137
  27. Garafutdinov R.R., Sakhabutdinova A.R., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. // Biochimie. 2020. V. 168. P. 259–267. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.11.013
  28. Markov A.V., Kupryushkin M.S., Goncharova E.P., Amirkhanov R.N., Vasilyeva S.V., Pyshnyi D.V., Zenkova M.A., Logashenko E.B. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 774–782. https://doi.org/10.1134/S1068162019060268
  29. Chubarov A.S., Oscorbin I.P., Filipenko M.L., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V. // Diagnostics. 2020. V. 10. P. 872. https://doi.org/10.3390/diagnostics10110872
  30. Pavlova A.S., Yakovleva K.I., Epanchitseva A.V., Kupryushkin M.S., Pyshnaya I.A., Pyshnyi D.V., Ryabchikova E.I., Dovydenko I.S. // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. P. 9784. https://doi.org/10.3390/ijms22189784
  31. Kupryushkin M.S., Filatov A.V., Mironova N.L., Patutina O.A., Chernikov I.V., Chernolovskaya E.L., Zenkova M.A., Pyshnyi D.V., Stetsenko D.A., Altman S., Vlassov V.V. // Mol. Ther. Nucleic Acids. 2022. V. 27. P. 211–226. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2021.11.025
  32. Stetsenko D., Kupryshkin M., Pyshnyi D. // Int. Application WO2016028187A1, 2016.
  33. Froehler B. // Tetrahedron Lett. 1986. V. 27. P. 5575– 5578. https://doi.org/10.1016/S0040-4039(00)85269-7
  34. Iyer R., Devlin T., Habus I., Yu D., Johnson S., Agrawal S. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 1543–1546. https://doi.org/10.1016/0040-4039(96)00067-6
  35. Peyrottes S., Vasseur J.-J., Imbach J., Rayner B. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 5869–5872. https://doi.org/10.1016/0040-4039(96)01250-6
  36. Laurent A., Debart F., Rayner B. // Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. P. 5285–5288. https://doi.org/10.1016/S0040-4039(97)01153-2
  37. Devlin T., Iyer R., Johnson S., Agrawal S. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. V. 6. P. 2663–2668. https://doi.org/10.1016/S0960-894X(96)00498-2
  38. Peyrottes S., Vasseur J.-J., Imbach J.L., Rayner B. // Nucleosides and Nucleotides. 1997. V. 16. P. 1551– 1554. https://doi.org/10.1080/07328319708006227
  39. Iyer R., Yu D., Devlin T., Ho N.-H., Johnson S., Agrawal S. // Nucleosides and Nucleotides. 1997. V. 16. P. 1491–1495. https://doi.org/10.1080/07328319708006214
  40. Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В. // Заявка RU2014134383A, 2014.
  41. Paul S., Roy S., Monfregola L., Shang S., Shoemaker R., Caruthers M. // J. Am. Chem. Soc. 2015. V. 137. P. 3253–3264. https://doi.org/10.1021/ja511145h
  42. Prokhorova D.V., Chelobanov B.P., Burakova E.A., Fokina A.A., Stetsenko D.A. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2017. V. 43. P. 38–42. https://doi.org/10.1134/S1068162017010071
  43. Chelobanov B.P., Burakova E.A., Prokhorova D.V., Fokina A.A., Stetsenko D.A. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2017. V. 43. P. 664–668. https://doi.org/10.1134/S1068162017060024
  44. Kupryushkin M.S., Zharkov T.D., Ilina E.S., Markov O.V., Kochetkova A.S., Akhmetova M.M., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 719–733. https://doi.org/10.1134/S1068162021030110
  45. Carpino L., Han G. // J. Org. Chem. 1972. V. 37. P. 3404–3409. https://doi.org/10.1021/jo00795a005
  46. Bazhenov M.A., Shernyukov A.V., Kupryushkin M.S., Pyshnyi D.V. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 699–708. https://doi.org/10.1134/S1068162019060074
  47. Jiménez E.I., Gibard C., Krishnamurthy R. // Angew. Chemie Int. Ed. 2021. V. 60. P. 10775–10783. https://doi.org/10.1002/anie.202015910
  48. Preobrazhenskaya N.N. // Russ. Chem. Rev. 1972. V. 41. P. 54–65. https://doi.org/10.1070/RC1972v041n01ABEH002030
  49. Johnsson R., Bogojeski J., Damha M. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014. V. 24. P. 2146–2149. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2014.03.032
  50. Gololobov Y.G., Zhmurova I.N., Kasukhin L.F. // Tetrahedron. 1981. V. 37. P. 437–472. https://doi.org/10.1016/S0040-4020(01)92417-2
  51. Jones A. // Int. J. Biol. Macromol. 1979. V. 1. P. 194–207. https://doi.org/10.1016/0141-8130(79)90013-8
  52. Boal J., Wilk A., Harindranath N., Max E., Kempe T., Beaucage S. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3115– 3117. https://doi.org/10.1093/nar/24.15.3115
  53. Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Pyshnaya I.A., Ivanova E.M. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2006. V. 23. P. 567–579. https://doi.org/10.1080/07391102.2006.10507082
  54. Преч Э., Бюльманн Ф., Аффольтер К. // Определение строения органических соединений. Таблицы спектральных данных. Москва: Мир, 2006. 439 с.

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Supplementary
Baixar (989KB)
Metadados
3. Fig. 1. ESI-MS analysis of compound (V) (Scheme 1) in positive ion recording mode.

Baixar (134KB)
Metadados
4. Fig. 2. (a) – RP-HPLC analysis of reaction mixtures of hexathymidylates (T*T5) obtained under different oxidation conditions according to the Staudinger reaction and treated with concentrated aqueous ammonia for 30 min at 25°C. Acetonitrile concentration gradient 0–30% over 15 min. Peak assignment was performed based on the combined data of mass spectrometric analysis (Fig. S4 in the supplementary materials) and comparison with the control oligonucleotide T6: peak 1 – T5, peak 2 – T6, peak 3 – T(–P(V)–NH2–)T5, peak 4 – T(–P(V)=N–Fmoc–)T5; (b) – oxidation conditions and the degree of the Staudinger reaction without taking into account the degree of destruction of the modified unit, obtained as the ratio of the sum of the integral areas of peaks 3 and 4 to the sum of the integral areas of all components of the reaction mixture (according to rHPLC data).

Baixar (137KB)
Metadados
5. Fig. 3. PAGE electrophoresis under denaturing conditions (8 M urea, 89 mM Tris-borate buffer, pH 8.3) of reaction mixtures of T*T5 oligonucleotides obtained according to the protocol described in Table 1, using 0.25 M FmocN3 solution and a Staudinger oxidation time of 45 min depending on the sequential postsynthetic treatment: 1, 2 – control T5 and T6, respectively; 3, 5 – ammonolysis (concentrated aqueous ammonia, 30 min), detritylation (80% acetic acid, 10 min); 4 – detritylation on CPG (3% trichloroacetic acid in CH2Cl2, 2 min), removal of the Fmoc group on CPG (2% DBU solution in acetonitrile, 5 min), ammonolysis (methanol-ammonia mixture, 2 h); 6 – ammonolysis (concentrated aqueous ammonia, 30 min), detritylation (80% acetic acid, 10 min), additional ammonolysis (concentrated aqueous ammonia, 24 h); 7 – ammonolysis (concentrated aqueous ammonia, 30 min), detritylation (80% acetic acid, 10 min), additional ammonolysis (methanol-ammonia mixture, 24 h). The assignment of the main spots was made according to ESI-MS analysis data after rHPLC extraction (Fig. S5 in the supplementary materials).

Baixar (88KB)
Metadados
6. Fig. 4. PAGE electrophoresis under denaturing conditions (8 M urea, 89 mM Tris-borate buffer, pH 8.3) of reaction mixtures: 1 and 2 – control oligonucleotides T5 and T6 with natural phosphodiester bonds; 3 – T2*T4, obtained by method 1; 4 – T2*T4, obtained by method 2.

Baixar (179KB)
Metadados
7. Fig. 5. Resistance of P-NH2 oligonucleotides to deprotection by a methanol-ammonia mixture compared to standard removal of protecting groups using concentrated aqueous ammonia, determined by rPLC data.

Baixar (60KB)
Metadados
8. Fig. 6. Experimental scheme for assessing the effect of the stage of additional oxidation with a mixture of I2/Py/H2O on the ratio of by-products in the synthesis of P-NH2 oligonucleotide. The effect was assessed using rHPLC data.

Baixar (94KB)
Metadados
9. Fig. 7. Contribution of P-NH2 modification to the thermal stability (DT) of complementary complexes of bimodified oligodeoxyribonucleotides with the AGCTACCG matrix depending on the ionic strength of the solution relative to the unmodified complex.

Baixar (122KB)
Metadados
10. Scheme 1. The steps of transformation of thymidine phosphite amido during oxidation of FmocN3 by the Staudinger reaction with indication of 31P-NMR characteristics obtained during the experiment. Compound (VI) was not registered during the transformations and is indicated here as the expected product with the range of chemical shifts presented in the literature [41, 47].

Baixar (159KB)
Metadados
11. Scheme 2. Proposed mechanism of hydrolysis of the Fmoc-containing fragment at the stage of detritylation with trichloroacetic acid during the synthesis of P-NH2 oligonucleotides.

Baixar (58KB)
Metadados

Declaração de direitos autorais © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».