Adaptation of a protocol for the automated solid-phase phosphoramidite synthesis of oligodeoxyribonucleotides for the preparation of their N-unsubstituted phosphoramidate analogues (P-NH₂)

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Основу всех известных на данный момент в биологии систем хранения и передачи генетической информации составляют биополимеры на основе рибофуранозных нуклеиновых кислот (НК) – ДНК и РНК. Функциональные свойства этих биополимеров уникальны, к ним относятся, в частности, химическая стабильность фосфатных эфиров и диэфиров [1] и доминирующее влияние полианионного фосфодиэфирного скелета на физико-химические свойства НК. Полианионный характер остова НК позволяет облегчить считывание информации путем стабилизации линейной протяженной конформации за счет отталкивания заряда, а также снимает ограничения растворимости, которые накладываются объемной структурой азотистых оснований [2].

С развитием химического синтеза фрагментов нуклеиновых кислот – олигонуклеотидов (ON) – обозначилось их фундаментальное и практическое приложение. Так, например, был предложен антисмысловой подход [3], позволяющий воздействовать на биосинтез белка посредством ингибирования трансляции мРНК за счет комплементарных взаимодействий с РНК-мишенями. Одни из основных препятствий к широкому использованию олигонуклеотидов с природными фосфодиэфирными связями in vivo – деградация олигонуклеотидов в присутствии нуклеаз и низкая эффективность внутриклеточного проникновения. Для снятия описанных ограничений проводятся исследования по разработке модифицированных олигонуклеотидов и их аналогов.

Известно много способов и подходов к изменению физико-химических свойств олигонуклеотидов, в том числе синтез аналогов НК с незаряженным остовом, таких как морфолиновые (РМО) и пептидонуклеиновые кислоты (PNA), алкилфосфонаты, фосфорилгуанидиновые (PGO) и другие N-замещенные амидофосфатные аналоги, а также N-незамещенные амидофосфаты (P-NH₂) [4−7]. На основе ряда незаряженных аналогов созданы и одобрены терапевтические препараты для лечения мышечной дистрофии Дюшенна (EXONDYS 51®, 2016; VYONDYS 53®, 2019; VILTEPSO®, 2020; AMONDYS 45®, 2021) [8, 9]. Незаряженные аналоги объединены репрезентативными свойствами – их устойчивостью к действию нуклеаз [10−13], способностью образовывать комплементарные комплексы с природными НК-мишенями [14−16], в особенности PGO гибридизуются даже в условиях с крайне низкой ионной силой растворов, что нереализуемо для природных ON [17]. Как правило, незаряженные последовательности ON характеризуются ограниченной растворимостью в водных растворах [18] и сложностью синтеза некоторых из их представителей [19−21]. В частности, синтез РМО и алкилфосфонатов подразумевает использование дорогостоящих специфических мономеров [22]. В случае PNA вовсе требуется наработка абсолютно неспецифических для нуклеотидной химии аминокислотоподобных мономеров [23]. В этой связи следует отметить, что совместить получение незаряженных аналогов ON со стандартным автоматическим твердофазным амидофосфитным подходом к синтезу олигонуклеотидов, внедряя минимальное количество изменений, удается не всегда. Только при синтезе PGO-аналогов удалось создать подход, наиболее приближенный к стандартным условиям получения олигонуклеотидов [7, 24], поскольку этот способ реализован на основе использования классических общедоступных мономеров и базируется на использовании методики альтернативного окисления атома P^(III) по реакции Штаудингера, что совмещено с протоколом автоматического синтеза ON. Потенциал применимости PGO в области молекулярной диагностики и биомедицины уже убедительно продемонстрирован [25−32].

В ряду вышеописанных электронейтральных ON стоит обратить особое внимание на N-незамещенные амидофосфатные олигодезоксирибонуклеотиды (или P-NH₂-аналоги). В отличие от ранее описанных аналогов, P-NH₂ практически изоструктурны природным нуклеиновых кислотам (в первом приближении имея ту же молекулярную массу), но в то же время электронейтральны, благодаря чему сильно отличаются по свойствам от нативных олигонуклеотидов. Впервые их синтез был описан в 1986 г. [33] на примере получения динуклеотида T*T, где звездочкой указано месторасположение модифицированного амидофосфатного звена. В рамках предложенного подхода проводили окислительное амидирование диэфирного H-фосфонатного звена раствором аммиака (10%) в CCl₄. После долгого перерыва интерес к их синтезу вновь возник в 1996–1997 гг. [13, 34−39] параллельно у двух независимых групп под руководством Р. Айера и Б. Ренера. В рамках первых работ обозначилась проблема гидролиза при щелочном деблокировании, которую решали, применяя различные стратегии защиты мономеров, пригодные для удаления безводными аммиачными смесями [13, 34]. Кардинальных изменений в способах введения P-NH₂-модификации в углеводофосфатный остов не производили, основным подходом по-прежнему оставалось окислительное амидирование. Однако в 1997 г. группой Б. Ренера был представлен иной подход, основанный на окислении OMe-фосфиттриэфирного звена растущей цепи ON по реакции Михаэлиса–Арбузова под действием иода и 2-нитробензиламина с последующим фотолитическим отщеплением 2-нитробензильного остатка [36]. Указанные выше исследовательские группы смогли провести предварительные физико-химические и молекулярно-биологические исследования, в рамках которых показали перспективность N-незамещенных амидофосфатных (P-NH₂) аналогов в качестве антисмысловых олигонуклеотидов [35, 37−39]. Позднее, в 2014 г., группа под руководством Д.В. Пышного продемонстрировала подход к синтезу амидофосфатных аналогов с использованием алкил- и арилазидов [40]. На том этапе подход имел ограниченную совместимость этапа окисления выбранными азидами с протоколом стандартного автоматического синтеза ON. Неугасающий интерес к эффективному синтезу P-NH₂ продемонстрировала группа М. Карузерса [41], когда в 2015 г. они предложили новый метод постсинтетической модификации боранфосфонатных олигодезоксинуклеотидов посредством иод-зависимого замещения при атоме фосфора с целью получения P-NH₂-аналогов. Основное ограничение данного подхода – необходимость использования для синтеза ON неканонических, коммерчески не доступных амидофосфитных мономеров. Таким образом, синтез N-незамещенных амидофосфатных аналогов по представленным схемам неоправданно дорогостоящий для различных групп разработчиков биологически активных соединений на основе ON.

Целью данного исследования было детальное изучение отдельных подходов к разработке унифицированного способа автоматического синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих N-незамещенные амидофосфатные остатки –(OPO(O)(NH₂))– (P-NH₂) вместо межнуклеозидных фосфатных остатков –(OPO(O)(O¯))– (PO). Создаваемый подход должен позволять вводить модификации в различные положения олигонуклеотидной цепи и должен быть совместим с использованием стандартных, коммерчески доступных амидофосфитных мономеров и твердофазных носителей на основе CPG. В рамках такого подхода предшественником P-NH₂-модификации может выступить органический азид, способный эффективно окислять промежуточный продукт олигонуклеотидного синтеза – фосфиттриэфир – и нести группировки, удаляемые при деблокировании целевого олигомера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее в ряде работ [24, 42−44] была неоднократно показана применимость реакции Штаудингера для получения N-замещенных амидофосфатных ON в рамках стандартного амидофосфитного твердофазного синтеза ON. При таком подходе фосфиттриэфир P^(III), образующийся на этапе конденсации амидофосфита и 5'-OH-компонента при наращивании ON-цепи, окисляется до иминофосфорана P^(V) при обработке органическим азидом. В данной работе мы также постарались оптимизировать использование окисления по классической схеме Штаудингера для осуществления автоматического синтеза N-незамещенных амидофосфатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов. Для окисления P^(III) до P^(V) в ходе реакции Штаудингера в качестве азидного компонента был выбран (9-флуоренил)-метоксикарбонилазид (FmocN₃). Соответствующий азид был получен из коммерчески доступного хлорформата (FmocCl) по методу, аналогичному описанному в работе [45]. Азид получен с высоким выходом и охарактеризован методами ¹H-ЯМР- и ИК-спектроскопии (рис. S1 и S2 в дополнительных материалах). Важно отметить, что Fmoc-группа относится к разряду щелочелабильных защитных остатков [45], что дает основание предполагать ее функциональную стабильность в рамках синтетического цикла при автоматическом синтезе ON.

На первом этапе исследования мы доказали (схема 1), что выбранный нами азид (FmocN₃) быстро реагирует как с 5′-DMTr-2′-дезокситимидин-3′-[(β-цианэтил)-(N,N-диизопропил)]амидофосфитом (I), так и с 5'-DMTr-2'-дезокситимидин-3'-[(β-цианэтил)-изопропил]фосфиттриэфиром (II). По данным ³¹P-ЯМР-спектроскопии, соединения (I) и (II) менее чем за 5 мин после добавления FmocN₃ превращаются в соответствующие иминофосфораны (III) и (IV), что можно было ожидать из работы М.А. Баженова с соавт. [46]. Следует отметить, что взаимодействие органического азида (FmocN₃) с указанными P^(III)-содержащими соединениями фосфора протекало, как и ожидалось, с интенсивным выделением газа – молекулярного азота.

 

Схема 1. Стадии превращения тимидинамидофосфита при окислении FmocN₃ по реакции Штаудингера с указанием ³¹P-ЯМР-характеристик, полученных в ходе эксперимента. Соединение (VI) не было зарегистрировано в ходе превращений и указано здесь как ожидаемый продукт с диапазоном химических сдвигов, представленным в литературе [41, 47].

 

Реакции FmocN₃ с амидофосфитом и фосфиттриэфиром проводили непосредственно в ампулах ЯМР. Образование соединений (III) и (IV) регистрировали по ядрам [³¹P] без последующего выделения соответствующих продуктов в индивидуальном состоянии. По данным ЯМР-спектроскопии, переход от P^(III)-содержащих соединений, характеризуемых химическими сдвигами ~139–148 м.д., к P^(V)-содержащим аддуктам (химический сдвиг ~5.5–15.1 м.д.) регистрируется практически сразу после контакта FmocN₃ с источником трехвалентного фосфора. Таким образом, было доказано, что выбранный реагент FmocN₃, при используемых избытках (1 : 1.8 экв.) способен количественно окислять P^(III)-атом фосфора в составе соединений (I) и (II).

Обработка амидофосфата (IV) сильным основанием 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-еном (DBU) должна была привести к получению изопропильного P-NH₂-производного тимидилата (VI) (ожидаемый амидофосфат). К удивлению, химический сдвиг атома [³¹P]-фосфора, зарегистрированный для хроматографически чистого DMTr-2'-дезокситимидин-3'-изопропиламидофосфата (V) (в форме смеси R_p- и S_p-диастереомеров), составил значения, равные 8.4 и 8.9 м.д. По данным работ [41, 47], для атома фосфора в составе P-NH₂-модификации в цепи олигонуклеотида должны были бы регистрироваться значения химических сдвигов в диапазоне 9.5–10.5 м.д. (в зависимости от растворителя), что соответствует, по мнению авторов указанных работ, именно электронейтральной форме амидофосфатного звена. Позднее, получив Т*T₅-олигонуклеотид (здесь и далее по тексту звездочкой указано месторасположение амидофосфатного звена, имеющего структуру –(OPO(O)(NH₂))– или –(OPO(O–)(NFmoc))–, при необходимости уточнения приводятся сокращенные обозначения, например, T(–P^(V) –NH₂–)T или T(–P^(V)=N-Fmoc–)T), мы зарегистрировали химический сдвиг атома фосфора в составе амидофосфатного остатка, равный 11.8 м.д. (рис. S3 в дополнительных материалах), что соответствует ранее опубликованным данным [41, 47]. Мы считаем, что ожидаемый амидофосфат –(OPO(O)(NH₂))– (VI) (схема 1), после хроматографического выделения в присутствии избытка триэтиламина ((С₂H₅)₃N), должен преимущественно находиться в виде стабильной ионизированной имидофосфатной формы –(OPO(N=H)(O^–))(Et₃NH⁺)– (V). Этот факт подтверждается тем, что соединение (V) по данным ESI-MS-анализа (рис. 1) таковым и является, т.е. представляет собой солевую форму амидофосфата. Полученные данные хорошо согласуются с результатами работы [48], в которой показано, что амидофосфаты проявляют свойства слабых кислот (pK_a ~ 8.2).

 

Рис. 1. ESI-MS-анализ соединения (V) (схема 1) в режиме регистрации положительных ионов.

 

Важно отметить еще раз, что воздействие FmocN₃ с P^(III)-содержащими соединениями позволяет практически количественно получать соответствующие P^(V)-содержащие аддукты. Таким образом, нами показано, что органический азид (в данном случае FmocN₃) потенциально пригоден для автоматического синтеза P-NH₂-модифицированных олигомеров, т.к. может обеспечить быстрое, в течение нескольких минут, окисление фосфитов до Fmoc-содержащего амидофосфата (IV).

Далее мы апробировали реакцию окисления P^(III) до P^(V) с помощью FmocN₃ в формате автоматического ДНК-синтеза, используя стандартные коммерчески доступные 5'-DMTr-2'-дезокситимидин-3'-[(β-цианэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфитамиды и твердофазный носитель (CPG), содержащий стандартный сукцинатный линкер. Включение P-NH₂-модификации в состав растущего ON первоначально проводили, синтезируя модельный гексатимидилат по протоколу, разработанному для синтеза фосфорилгуанидиновых аналогов [32].

На первом этапе провели синтез модельных гексатимидилатов с одной (T*T₅) и двумя (T*T*Т₄) подряд P-NH₂-модификациями вблизи 5'-конца цепи олигонуклеотида. Ожидалось, что на этапе краткосрочного (30 мин, 56°С) финального деблокирования олиготимидилатных производных и отделения от твердофазного носителя концентрированным водным раствором аммиака [49] также должно происходить и удаление Fmoc-защитной группы с P^(V)=N-Fmoc-модифицированного иминофосфоранового межнуклеозидного звена, что приводит к формированию N-незамещенного амидофосфатного олигодезоксирибонуклеотида. Однако по данным электрофоретического анализа в денатурирующем ПААГ и ОФ-ВЭЖХ (рис. S3 в дополнительных материалах) целевой продукт удалось получить только для мономодифицированного T*T₅ гексатимидилата со степенью превращения не более 35% (рис. S4 в дополнительных материалах, дорожка 2). Такой результат можно было ожидать, опираясь на данные работы относительно стабильности целевого N-незамещенного амидофосфата в условиях аммонолиза [33]. Однако не следует исключать, что P^(V)=N-Fmoc-производное может гидролизоваться и до удаления защитной группы [50].

С целью максимального смягчения условий щелочного деблокирования удаление цианэтильных защитных групп проводили в безводных условиях 50%-ным Et₃N в CH₃CN с последующим отщеплением ON от твердофазного носителя концентрированным водным аммиаком (30 мин, 25°С), финальное удаление DMTr-группы проводили 80%-ной уксусной кислотой после отщепления от полимерного носителя. Поскольку возможной причиной низкой конверсии в целевой продукт могло выступать неполное окисление P^(III) на этапе реализации реакции Штаудингера в условиях твердофазного синтеза ON, была проанализирована эффективность получения гексатимидилата T^*T₅ как в условиях дискретного возрастания концентрации окислителя FmocN₃ с 0.1 до 0.25 М, так и варьируя продолжительность этого технологического этапа – 15, 30 и 45 мин. В составе реакционных смесей, отнесенных по совокупности данных масс-спектрометрического (рис. S5 в дополнительных материалах) и хроматографического анализов, идентифицированы нативные пента- и гексатимидилаты (T₅ и T₆) и целевой N-незамещенный продукт, T_*T₅ (рис. 2, фракции 1, 2 и 3 соответственно). Кроме того, анализ показал, что при использовании краткосрочной схемы аммонолиза концентрированным водным аммиаком (30 мин, 25°С) исчерпывающего удаления Fmoc-защиты не происходит (рис. 2, фракция 4). Стоит особенно отметить, что данный Fmoc-содержащий амидофосфат, несущий модифицированное фосфодиэфирное звено, аналогичное таковому в соединении (IV) (схема 1), по-видимому, неустойчив в условиях электроспрей-ионизации. По данным MALDITOF-масс-спектрометрического анализа (рис. S6 в дополнительных материалах), хроматографически чистая фракция 4 (рис. 2) имеет в своем составе как гидрофобный защищенный гексатимидилат T(–P^(V)=N-Fmoc–)T₅, так и значимо более гидрофильный (фракция 3) целевой мономодифицированный продукт, т.е. T(–P^(V)–NH₂–)T₅. Результаты эксперимента четко указывают на то, что увеличение концентрации азида на этапе окисления и увеличение длительности данного этапа значимо повышают выход модифицированного P-NH₂-аналога. Важно отметить, что нам удалось, повысив концентрацию окислителя и время обработки FmocN₃, достичь более чем 80%-ной суммарной конверсии в олигомер T*T₅, по данным офВЭЖХ, даже при использовании классического аммонолиза на финальном этапе синтеза ON.

 

Рис. 2. (а) – офВЭЖХ-анализ реакционных смесей гексатимидилатов (T*T₅), полученных в разных условиях окисления по реакции Штаудингера и обработанных концентрированным водным аммиаком в течение 30 мин при 25°С. Градиент концентрации ацетонитрила 0–30% за 15 мин. Соотнесение пиков проводили по совокупности данных масс-спектрометрического анализа (рис. S4 в дополнительных материалах) и сравнения с контрольным олигонуклеотидом T₆: пик 1 – Т₅, пик 2 – Т₆, пик 3 – T(–P^(V)–NH₂–)T5, пик 4 – T(–P^(V)=N–Fmoc–)T₅; (б) – условия окисления и степень протекания реакции Штаудингера без учета степени деструкции модифицированного звена, полученные как отношение суммы интегральных площадей пиков 3 и 4 к сумме интегральных площадей всех компонентов реакционной смеси (по данным офВЭЖХ).

 

Таким образом, далее в ходе автоматического синтеза амидофосфатных олигомеров мы использовали следующие режимы для этапа окисления P^(III)-триэфира: концентрация окислителя FmocN₃ 0.25 М в ацетонитриле, длительность реакции Штаудингера при этих условиях – не менее 45 мин.

Поскольку смягчение условий деблокирования не позволило полностью избежать гидролиза модифицированного звена в водно-аммиачной среде, что, несомненно, согласуется с работами [13, 33, 34, 51], было предложено использовать метанольно-аммиачную смесь для финального удаления защитных групп и отщепления от CPG. С целью оценки устойчивости модифицированного звена к условиям деблокирования метанольно-аммиачной смесью часть реакционной смеси T*T₅, полученной по протоколу из табл. 1 с увеличением концентрации азида до 0.25 М и увеличенным временем окисления по реакции Штаудингера до 45 мин, дополнительно обработали концентрированным водным аммиаком в течение 24 ч и метанольно-аммиачной смесью в течение 24 ч соответственно (рис. 3, дорожки 6 и 7 соответственно). Электрофоретический анализ показал высокую степень гидролиза модифицированных звеньев в случае обработки реакционной смеси концентрированным водным аммиаком; напротив, обработка метанольно-аммиачной смесью не привела к значительной деструкции амидофосфатных групп.

 

Таблица 1. Стартовый протокол для синтеза модельных гексатимидилат-N-незамещенных амидофосфатных олигонуклеотидов в рамках амидофосфитного твердофазного метода синтеза, разработанный по аналогии с протоколом для синтеза фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов [32]

Стадия	Реагент и условия	Время
Детритилирование	3%-ная трихлоруксусная кислота в CH2Cl2	172 с
Конденсация	0.07 М амидофосфит, 0.25 М 5-этилтио-1Н-тетразол в CH3CN	151 с
Кэпирование	CapA (15% (CH3CH2CO)2O в ТГФ) CapB (13% 1-MeIm, 13% Py в ТГФ)	109 с
Окисление или окисление по Штаудингеру	0.02 М I2, 1% Py, 9% H2O в ТГФ	27 с
	0.1 М FmocN3 в CH3CN	1800 с
Деблокирование	Концентрированный NH3·H2O	1–48 ч

 

Рис. 3. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях (8 М мочевина, 89 мМ Tris-боратный буфер, pH 8.3) реакционных смесей олигонуклеотидов T*T₅, полученных по протоколу, описанному в табл. 1, с использованием 0.25 М раствора FmocN₃ и продолжительностью окисления по реакции Штаудингера 45 мин в зависимости от последовательной постсинтетической обработки: 1, 2 – контрольные T₅ и T₆ соответственно; 3, 5 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин); 4 – детритилирование на CPG (3%-ная трихлоруксусная кислота в CH₂Cl₂, 2 мин), удаление Fmoc-группы на CPG (2%-ный раствор DBU в ацетонитриле, 5 мин), аммонолиз (метанольно-аммиачная смесь, 2 ч); 6 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин), дополнительный аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 24 ч); 7 – аммонолиз (концентрированный водный аммиак, 30 мин), детритилирование (80%-ная уксусная кислота, 10 мин), дополнительный аммонолиз (метанольно-аммиачная смесь, 24 ч). Отнесение основных пятен произведено по данным ESI-MS-анализа после выделения офВЭЖХ (рис. S5 в дополнительных материалах).

 

Полученный результат позволяет обоснованно считать, что связь P-NH₂ стабильна при обработке метанольно-аммиачной смесью, что подтверждается результатами работы [13]. Однако выбранный подход к удалению защитных групп не позволяет полностью удалить Fmoc-группу за 24 ч, в связи с чем было принято решение использовать предшествующее аммонолизу отщепление Fmoc-защиты обработкой раствором сильного основания (DBU) без отщепления от полимерного носителя согласно работе [34]. На следующем этапе работы мы провели синтез T*T₅ с дополнительной обработкой DBU в ацетонитриле перед аммонолизом. В результате электрофоретического разделения реакционной смеси выявлено отсутствие модифицированного олигонуклеотида в ее составе (рис. 3, дорожка 4). Учитывая ранее показанную устойчивость P-NH₂-связи к деблокированию в метанольно-аммиачной смеси и к обработке DBU в безводных условиях, причиной отсутствия целевого соединения в реакционной смеси сочли гидролиз (–P^(V)=N-Fmoc–)-фрагмента на стадии детритилирования трихлоруксусной кислотой. Предполагаемый механизм включает в себя протонирование сложноэфирной группы Fmoc-фрагмента с последующей локализацией положительного заряда на атоме фосфора и нуклеофильной атакой молекулой воды (схема 2). Присутствие воды на стадии детритилирования полностью исключить невозможно, поскольку в синтетическом цикле присутствует вода в составе иод-содержащего окислителя.

 

Схема 2. Предполагаемый механизм гидролиза Fmoc-содержащего фрагмента на стадии детритилирования трихлоруксусной кислотой во время синтеза P-NH₂-олигонуклеотидов.

 

Во избежание гидролиза Fmoc-защищенного олигонуклеотида в кислых условиях в протокол синтеза ввели стадию отщепления защитных групп у амидофосфатного звена обработкой DBU, и, таким образом, в синтетическом цикле стадии детритилирования предшествует стадия отщепления Fmoc- и β-цианэтильной групп с образованием (–P(O)–NH₂–)-фрагмента. Внедрение дополнительной стадии в цикл синтеза первоначально проводили вне автоматического синтезатора, для чего извлекали CPG c Fmoc-содержащим олигонуклеотидом из реакционной колонки и обрабатывали в пробирке раствором DBU в ацетонитриле в течение 5 мин при комнатной температуре. Экспериментально показано (рис. 4, дорожка 3), что свободная (–P^(V)–NH₂–)-связь устойчива к обработке трихлоруксусной кислотой и другими реагентами, используемым в синтетическом цикле.

 

Рис. 4. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях (8 М мочевина, 89 мМ Tris-боратный буфер, pH 8.3) реакционных смесей: 1 и 2 – контрольные олигонуклеотиды T₅ и T₆ с природными фосфодиэфирными связями; 3 – T₂*T₄, полученный по способу 1; 4 – T₂*T₄, полученный по способу 2.

 

Таким образом, внедрение дополнительной стадии отщепления защитных групп у модифицированного фосфата и использование мягкого щелочного деблокирования метанольно-аммиачной смесью позволило разработать протокол синтеза P-NH₂-олигонуклеотидов с применением отечественного оборудования, например, ASM-800 (Биоссет, Россия), стандартных коммерчески доступных мономеров и полимерных носителей (табл. 2).

 

Таблица 2. Протокол синтеза N-незамещенных амидофосфатных (P-NH₂) олигонуклеотидов в рамках амидофосфитного метода синтеза с использованием стандартных коммерчески доступных мономеров и полимерных носителей для отечественного ДНК/РНК-синтезатора ASM-800 (Биоссет, Россия)

Стадия	Реагент и условия	Время
Детритилирование	3%-ная трихлоруксусная кислота в CH2Cl2	172 с
Конденсация	0.07 М амидофосфит, 0.25 М этилтиотетразол в CH3CN	151 с
Кэпирование	CapA (15% (CH3CH2CO)2O в ТГФ) CapB (13% 1-MeIm, 13% Py в ТГФ)	109 с
Окисление или окисление по Штаудингеру	0.02 М I2, 1% Py, 9% H2O в ТГФ	27 с
	0.25 М FmocN3 в CH3CN	2700 с
Удаление Fmoc-группы	2% DBU в CH3CN	300 с
Деблокирование	Метанольно-аммиачная смесь	1–24 ч

 

Следует отметить, что при однократной модификации конверсии в целевой продукт >85% нам добиться не удалось. Так, при синтезе олигомера Т*T₅, по данным ВЭЖХ-анализа, наблюдается ~13% продуктов гидролиза после обработки CPG-связанного олигонуклеотида метанольно-аммиачной смесью в течение первых двух часов при комнатной температуре (рис. 5, точка 0; рис. S7 в дополнительных материалах, хроматография 0). Видно, что вплоть до 5 ч дополнительного выдерживания Т*T₅ в среде NH₃/CH₃OH при 56°С значимой деградации амидофосфат-содержащего аналога не происходило. Лишь спустя сутки (56°С) уровень деградации целевого продукта приближался к 50% (рис. 5, точка 23 ч; рис. S7 в дополнительных материалах, хроматография Б4). Напротив, в случае дополнительного выдерживания в среде NH₃/H₂O при 56°С спустя 1 ч заметна серьезная деградация амидофосфатной группы. Следует отметить, что в случае использования для синтеза олигомеров НК коммерчески доступных мономеров со стандартными защитными группами рекомендованное время деблокирования НК водно-аммиачной смесью не превышает 40 ч при комнатной температуре [52]. В случае использования метанольно-аммиачной смеси достаточно 18 ч при комнатной температуре, что было подтверждено экспериментально (рис. S8 в дополнительных материалах). Поскольку результат эксперимента демонстрирует устойчивость амидофосфатной группы к метанольно-аммиачной смеси на довольно продолжительном промежутке времени, “исходная” степень деструкции (–P^(V)–NH₂–)-содержащего олигонуклеотида, полученная после первых двух часов деблокирования при комнатной температуре и превышающая 10% по данным офВЭЖХ, не может быть вызвана гидролизом модифицированного звена в ходе деблокирования.

 

Рис. 5. Устойчивость P-NH₂-олигонуклеотидов к деблокированию метанольно-аммиачной смесью по сравнению со стандартным удалением защитных групп с использованием концентрированного водного аммиака, определенная по данным офВЭЖХ.

 

Последующие эксперименты были направлены на выяснение других причин, влияющих на выход целевого N-незамещенного амидофосфатного олигонуклеотидного продукта. Для этого мы поставили задачи установить, зависит ли степень гидролиза амидофосфатной связи от следующих факторов:

1. места расположения одиночной P-NH₂-модификации в цепи олигонуклеотида,
2. типа прилегающих к ней нуклеозидов,
3. стадии синтетического цикла.

 

1. Для оценки влияния места расположения модификации были синтезированы гексатимидилаты, содержащие одиночную (–P^(V)–NH₂–)₂-группу в каждом из пяти межнуклеозидных положений (Т₅*T, Т₄*T₂, Т₃*T₃, Т₂*T₄, Т*T₅). Данный прием должен был показать, является ли увеличение числа циклов синтеза нативных фосфодиэфирных звеньев, последовавших за введением (–P^(V)–NH₂–)-остатков, фактором, определяющим степень гидролиза амидофосфатного фрагмента цепи ON. Было установлено, что вне зависимости от локализации в цепи одиночной амидофосфатной модификации конверсия в целевой гексатимидилатный продукт, по данным офВЭЖХ, составляет в среднем 72%, т.е. не зависит от положения введения (–P^(V)–NH₂–)-группы (табл. 3, фактор А).
2. Для ответа на вопрос, поставленный следующей задачей, мы провели синтез двух серий тетрамерных олигонуклеотидов, содержащих вблизи либо 5'-, либо 3'-конца цепи одиночную модификацию динуклеотидного звена Х(–P^(V)–NH₂–)Т, где Х = G, C, A или Т (табл. 3, фактор Б). Установлено, что, по данным количественного анализа профилей ВЭЖХ, выход целевых P-NH₂-аналогов составляет в среднем ~70%.
3. Для выявления стадии синтетического цикла, оказывающей превалирующее влияние на устойчивость (–P^(V)–NH₂–)-связи, был проведен скрининг стадий и условий получения T₅*T. После стадии окисления промежуточного фосфиттриэфира олигонуклеотида раствором FmocN₃ (0.25 M) мы последовательно исключали все стадии технологического цикла (представлены на рис. S9 в дополнительных материалах), обрабатывая затем твердофазный носитель метанольно-аммиачной смесью и оценивая состав реакционных смесей методом офВЭЖХ. На первом этапе выявить основную стадию, в ходе которой бы наблюдалось значимое уменьшение конверсии, не удалось из-за сравнительно малого количества побочных продуктов. Анализируя состав побочных продуктов, первым делом мы решили исключить гидролиз водой, входящей в состав окислителя, и преднамеренно обработали CPG c T₅(–P^(V)–NH₂–)T раствором, содержащим 9% воды и ТГФ в качестве растворителя. При повторном исключении стадий и анализе реакционных смесей получили прирост к содержанию T₅ относительно предыдущего эксперимента, в то время как содержание T₆ оставалось на прежнем уровне (рис. S9 в дополнительных материалах). Обнаруженный факт привел к заключению: гомогенность реакционных смесей PNH₂-олигонуклеотидов, получаемых по разработанному протоколу, напрямую зависит от полноты протекания реакции Штаудингера и практически не обусловливается используемыми в синтетическом цикле реагентами и деблокирующими смесями. В итоге, повторив синтез T₅*T с использованием дополнительного окисления иодом после стадии удаления Fmoc-защитной группы, мы получили прирост к содержанию T₆ в сравнении с синтезом без дополнительной стадии окисления (рис. 6).

 

Таблица 3. Степень полноты протекания реакции Штаудингера, оцененная по данным офВЭЖХ, в зависимости от факторов, влияющих на устойчивость связи (–P^(V)–NH₂–), таких как: 1 – число стандартных циклов амидофосфитного синтеза, следующих после стадии модификации; 2 – химическое строение динуклеотида в составе модифицированного звена

Фактор 1		Фактор 2
Последовательность 5'→3'	Доля целевого ON, %	Последовательность 5'→3'	Доля целевого ON, %	Последовательность 5'→3'	Доля целевого ON, %
TTTTT*T	79	G*TTT	60	TTG*T	70
TTTT*TT	73	C*TTT	64	TTC*T	69
TTT*TTT	73	A*TTT	48	TTA*T	69
TT*TTTT	64	T*TTT	74	TTT*T	75
T*TTTTT	72	–	–	–	–

 

Рис. 6. Схема эксперимента по оценке влияния стадии дополнительного окисления смесью I₂/Py/H₂O на соотношение побочных продуктов при синтезе P-NH₂-олигонуклеотида. Оценку влияния проводили по данным офВЭЖХ.

 

При попытке достигнуть полного протекания реакции Штаудингера мы провели синтез T₅*T с использованием насыщенного раствора FmocN₃ (~0.63 M). К сожалению, используя повышенную концентрацию, не удалось добиться полной конверсии (содержание побочных продуктов составило ~10%). Особенно остро проблема неполной конверсии в целевой амидофосфатный олигонуклеотид встает при переходе к множественной модификации олигонуклеотидной цепи. Причину частичного окисления с использованием FmocN₃ в ходе твердофазного синтеза предстоит выяснить в будущих экспериментах.

Гибридизационные свойства P-NH₂-ON. Отметим, что к настоящему времени имеется лишь крайне ограниченный набор данных, описывающих комплексообразующие свойства P-NH₂-амидофосфатов [25, 35−37]. Именно поэтому мы исследовали способность серии октамерных ДНК, нативного (N₈) и модифицированных олигонуклеотидов (N_x*у*z, где х, у, z – порядковые числа нуклеозидов в составе модифицированного звена) к формированию комплементарных комплексов c матричным октамером M₈. Отдельной задачей была попытка определить роль влияния P-NH₂-модификации на зависимость температуры плавления (T_пл) от ионной силы раствора (табл. 3, рис. 7). Важно отметить, что именно данный фактор – электронейтральность модификации – это ключевое свойство, определяющее фундаментальный потенциал использования рассматриваемых изоструктурных P-NH₂-аналогов нативных олигонуклеотидов.

 

Рис. 7. Вклад P-NH₂-модификации в термическую стабильность (DT) комплементарных комплексов бисмодифицированных олигодезоксирибонуклеотидов с матрицей AGCTACCG в зависимости от ионной силы раствора относительно немодифицированного комплекса.

 

В табл. 4 представлены термодинамические параметры комплексообразования нативной ДНКматрицы с набором модельных октануклеотидов (N_x*у*z) в стандартных буферных условиях (1 М NaCl, 10 мМ какодилат натрия, pH 7.3). Данные были получены методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала во многоволновом режиме [17]. Представленные данные – результат анализа как профилей кривых термической денатурации, так и ренатурации анализируемых дуплексов. Следует отметить, что взаимодействие всех модельных олигомеров с ДНК-матрицей демонстрирует строго равновесный характер комплексообразования. С учетом погрешности определения величины температуры плавления исследуемых комплексов (~0.2°С) [53] установлено, что введение амидофосфатных остатков в структуру октануклеотидов лишь незначительно влияет на их сродство к мишени ДНК в условиях высокой ионной силы раствора (1 М NaCl) (табл. 4). Вне зависимости от позиции введения модификации в структуре олигомера и числа модифицированных звеньев в среднем наличие одного (–P^(V)–NH₂–)-звена приводит к снижению термической стабильности ДНК-комплексов на 1.0–2.0°С. Этот факт согласуется с данными работ французских исследователей [35]. Следует отметить, что термостабильность комплексов, формируемых различными фракциями диастереомеров олигомера N_(1*6*1), разделенных с помощью ВЭЖХ, в условиях высокой ионной силы раствора практически не отличается (табл. 4).

 

Таблица 4. Результаты исследования термической стабильности олигонуклеотидных комплексов c разным числом и расположением N-незамещенных амидофосфатных групп в олигонуклеотиде N_x*у*z в условиях высокой ионной силы (1 М NaCl)

Комплементарный комплекс AGCTACCG матрицы с олигонуклеотидом		Выход ON после офВЭЖХ, %	∆S°, кал/(К·моль)	∆H°, ккал/моль	∆G°37, ккал/моль	Tпл, °С	∆T, °С	∆T/mod, °С
N8	CGGTAGCT	–	–142 ± 1	–51.5 ± 3.9	–7.4 ± 0.2	39 ± 1	–	–
N(1*7)	C*GGTAGCT	23	–162 ± 2	–57.3 ± 0.7	–7.0 ± 0.1	36 ± 1	–3	–
N(4*4)	CGGT*AGCT	29	–175 ± 3	–61.4 ± 0.9	–7.2 ± 0.1	38 ± 1	–1	–
N(7*1)	CGGTAGC*T	49	–157 ± 4	–56.0 ± 1.3	–7.3 ± 0.1	38 ± 1	–1	–
(1) N(1*6*1)	C*GGTAGC*T	15	–157 ± 3	–55.9 ± 0.9	–7.1 ± 0.1	37 ± 1	–2	–1
(2) N(1*6*1)	C*GGTAGC*T	23	–132 ± 1	–48.2 ± 0.3	–7.2 ± 0.1	37 ± 1	–2	–1
N(6*1*1)	CGGTAG*C*T	33	–146 ± 4	–52.5 ± 1.3	–7.2 ± 0.1	38 ± 1	–1	–1
N(4*1*3)	CGGT*A*GCT	22	–165 ± 4	–58.1 ± 1.3	–6.9 ± 0.1	36 ± 1	–3	–2
N(1*1*6)	C*G*GTAGCT	28	–142 ± 9	–51.0 ± 2.9	–7.0 ± 0.1	37 ± 1	–3	–1

Примечание: для последовательности N_(1*6*1) удалось разделить две смеси диастереомеров (1) и (2).

 

Снижение ионной силы буферного раствора (при дискретном переходе от 1 к 0.1 и до 0.01 М раствора NaCl) показало, что для рассмотренных бисмодифицированных октануклеотидов явно выражен эффект введения электронейтральной P-NH₂-модификации (рис. 7; табл. S1 в дополнительных материалах). При исследовании мономодифицированных комплексов не удалось обна-ружить статистически значимую зависимость от ионной силы раствора. Очевидно, что наличие P-NH₂-модификации в цепи олигомера приводит к достоверно значимому снижению зарядобусловленной компоненты энергии взаимодействия комплементарных цепей. Заметим, что в ряде случаев при пониженной ионной силе (0.01 М NaCl) (–P^(V)–NH₂–)-содержащие аналоги демонстрируют даже несколько большую термостабильность комплементарных комплексов с ДНК-матрицей относительно таковых с участием нативных олигонуклеотидов. При этом, по-видимому, наблюдается некоторая зависимость термодинамического эффекта от локализации, нуклеотидной последовательности сайта модификации, а также его диастереомерного состояния.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали азид натрия (NaN₃), тетраметилэтилендиамин (TEMED), катионный карбоцианиновый краситель Stains-All, трис(гидроксиметил)аминометан (Трис), какодилат натрия (Sigma-Aldrich, США); (9-флуоренил)-метоксикарбонилхлорид (FmocCl) (Fluka, Швейцария); трихлоруксусную кислоту, пиридин, триэтиламин, хлорид натрия, тетрагидрофуран (ТГФ) (Panreac, США); 5-(этилтио)-1H-тетразол (ETT) (Glen Research, США); 1-метилимидазол (Carl Roth GmbH + Co. KG, Германия); пропионовый ангидрид, 7 М раствор аммиака в метаноле (Acros Organics, США); кристаллический иод, ледяную уксусную кислоту, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na₂EDTA), водный аммиак, спирт изопропиловый (Реахим, Россия); (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (DBU) (Alfa Aesar, Германия); акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, персульфат аммония (PSA) (AppliChem, Германия); бромфеноловый синий, ксиленцианол FF (Helicon, Россия); борную кислоту (Химпром, Россия); мочевину (Союзхимпром, Россия); стандартные мономеры для фосфорамидитного протокола, полимерные носители для твердофазного автоматического синтеза с тимидин-, дезоксиаденозин- и дезоксигуанозин-3'-расщепляемым линкером (ChemGenes Co, США); воду бидистиллированную, ацетонитрил (CH₃CN) для ВЭЖХ (Fisher Chemical, Китай); дихлорметан (Вектон, Россия); ацетонитрил-d₃, пластинки для ТСХ TLC Silica gel 60 F₂₅₄ (Merck, США); хлороформ-d (Solvex, Россия).

Реактивы и растворители были квалификации х.ч. и о.с.ч. отечественного и импортного производства. Абсолютизирование растворителей проводили стандартными методами с последующим выдерживанием над молекулярными ситами или гидридом кальция.

Масс-спектрометрический анализ (ESI и MALDI-TOF) исследованных соединений проводили в Центре масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН на оборудовании MALDI-TOF Autoflex Speed (Bruker Daltonics, Германия) и ESI LC/MS/MSD XCT (Agilent Technologies, США); определяемый диапазон масс – 105–1600 m/z.

Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре Magritek Spinsolve (Новая Зеландия) с частотой 80 МГц (¹H – 80 МГц, ³¹P – 32 МГц) в CH₃CN (при записи ³¹P) или дейтерированном хлороформе (при записи ¹Н).

Структуру органического азида (FmocN₃) устанавливали с использованием ИК-Фурье-спектрометра Tensor 27 (Bruker, Германия) на базе НИОХ СО РАН им. Н.Н. Ворожцова. Спектр регистрировали в кювете диаметром 0.28 мм, растворителем выступал хлороформ, концентрация раствора исследуемого азида составила 1 масс.%. ИК-спектр регистрировали в диапазоне 4000– 400 см^‒1. Идентификацию химического состава азида проводили по характеристическим полосам поглощения, представленным в литературе [54].

Электрофоретическую подвижность олигонуклеотидов и их аналогов оценивали, используя 15%-ный ПААГ (акриламид : N,N'-метиленбисакриламид (29 : 1), 8 М мочевина, 89 мМ Трис-борат, pH 8.3, 2 мM Na₂EDTA, 0.08% TEMED, 0.1% PSA) при напряжении 12 В/м в диапазоне 30– 40 мин. Пробы наносили из буферного раствора, содержащего 0.1 мг/мл ксиленцианола FF в 8 M мочевине. Подвижность оценивали относительно лидирующего красителя – бромфенолового синего. Результаты электрофоретического разделения визуализировали окрашиванием с помощью 0.05%-ного раствора Stains-all в 50%-ном формамиде.

Аналитическую обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (офВЭЖХ) реакционных смесей образцов проводили на хроматографе Милихром A02 (Эконова, Россия) с использованием колонки (2 × 75 мм) с сорбентом ProntoSIL-120-5-C18 (Эконова, Россия) и градиента концентрации CH₃CN (0–30%) в 0.02 М водном растворе триэтиламмония ацетата (pH 7.0) в течение 30 мин (скорость потока 200 мкл/мин, температура термостата 35°С). Детекцию ON осуществляли на длинах волн 260, 280 и 300 нм.

Очистку олигонуклеотидов проводили методом офВЭЖХ на хроматографе Agilent 1100 series (Agilent, США). Использовали колонку (4.6 × 150 мм) с сорбентом Eclipse XDB-C18 (5 мкм) (Agilent, США), элюировали в градиенте концентрации CH₃CN от 0 до 50% в 0.02 М растворе триэтиламмония ацетата (pH 7.0) за 40 мин, скорость потока 1.5 мл/мин.

Амидофосфатные аналоги олигодезоксирибонуклеотидов синтезировали на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 (Biosset, Россия) с использованием коммерчески доступных мономеров (0.1 M) для амидофосфитного протокола, в качестве активатора применяли раствор ETT (0.25 М) в CH₃CN. В качестве кэпирующих агентов выступали CpA – 15%-ный пропионовый ангидрид в ТГФ, CpB – 16%-ный N-метилимидазол в ТГФ. 5'-Диметокситритильную защитную группу удаляли 3%-ной трихлоруксусной кислотой в CH₂Cl₂. Триэфирфосфиты окисляли до триэфирфосфатов смесью 0.05 М I₂, 1% пиридина, 9% H₂O в ТГФ. Для получения межнуклеозидного амидофосфата на стадии окисления в процессе твердофазного автоматического синтеза использовали альтернативную программу, основанную на реакции Штаудингера. В качестве окислителя применяли 0.1 М или 0.25 М раствор FmocN₃ в CH₃CN. Суммарное время окисления составляло 15–45 мин. Удаление Fmoc-защитной группы проводили обработкой 2%-ным раствором DBU в CH₃CN в течение 5 мин либо в ходе синтетического цикла на автоматическом ДНК-синтезаторе, либо отдельно в пробирке объемом 1.5 мл.

Термическую денатурацию олигонуклеотидных комплексов проводили на спектрофотометре Cary 300 Biomelt (Varian, Австралия), оснащенном терморегулируемой 6-кюветной приставкой. Компоненты комплексов в эквимолярном соотношении (суммарная концентрация 10 мкМ) в буферном растворе (10 мМ какодилат натрия, 100 мМ NaCl, pH 7.2) нагревали–охлаждали в диапазоне температур от 5 до 95°С со скоростью изменения температуры 0.5°С/мин. Оптическую плотность регистрировали при 260, 270 и 300 нм. Температуру плавления комплекса определяли как температуру, соответствующую максимуму первой производной кривой (или профиля) зависимости оптической плотности образца от температуры.

(9-Флуоренил)-метоксикарбонилазид (FmocN₃). (9-Флуоренил)-метоксикарбонилхлорид (1.88 ммоль) растворяли в 10 мл безводного CH₃CN. К раствору добавляли 2.64 ммоль сухого NaN₃. Полученную суспензию перемешивали 10 ч при нагревании до 40°C. После окончания реакции супернатант отделяли фильтрованием и проводили экстракцию CH₂Cl₂. Органический слой промывали 1 раз насыщенным солевым раствором, далее 2 раза водой, затем сушили над Na₂SO₄ (безв.). Растворитель удаляли упариванием на ротационном испарителе. Очистку проводили перекристаллизацией из гексана. Для удаления следов воды остаток в колбе дважды упаривали из ацетонитрила.

ТСХ в системе 85% гексан + 15% CH₂Cl₂: R_f (FmocCl) = 0.28, R_f (FmocN₃) = 0.08.

¹H-ЯМР (80 МГц, CDCl₃; J, Гц): 7.79 (d, J 6.7, 2H), 7.55 (d, J 1.7, 2H), 7.42 (t, J 4.3, 2H), 7.27 (t, J 1.7, 2H), 4.50 (d, J 6.3, 2H), 4.31 (t, J 7.0, 1H). ИК (см^–1): 3037, 2189, 2135, 1734, 1601, 1448, 1375, 1317, 1240, 1111, 1076, 1030, 982, 922, 864, 621, 563, 482, 424.

5'-Диметокситритил-2'-дезокситимидин-3'-[(β-цианэтил)-изопропил]фосфиттриэфир (II). В пластиковой пробирке с завинчивающейся крышкой к 145 мкл 0.1 M раствора 5′-диметокситритил-2′-дезокситимидин-3′-[(β-цианэтил)-(N,N-диизопропил)]амидофосфита (I) в CH₃CN (0.01 ммоль) приливали 250 мкл 0.25 M раствора ETT в CH₃CN (0.04 ммоль) и 150 мкл изопропанола (абс.) (2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 5 мин при комнатной температуре. Продукт экстрагировали CH₂Cl₂, в качестве водной фазы использовали фосфатный буфер (1 М KH₂PO₄, pH 6.5). Органическую фазу упаривали на ротационном испарителе, сухое вещество растворяли в 500 мкл ацетонитрила. Продукт анализировали методами ТСХ и ЯМР-спектроскопии и использовали в последующих реакциях без дополнительной очистки.

ТСХ в системе 90% CH₂Cl₂ + 10% C₂H₅OH: R_f (I) = 0.4, R_f (II) = 0.36.

³¹P-ЯМР (32 МГц, CH₃CN): 139.27, 138.88.

5'-Диметокситритил-2'-дезокситимидин-3'-изопропиламидофосфат (V). К полученному фосфиттриэфиру (II) (0.01 ммоль) приливали 0.1 М раствор FmocN₃ (0.02 ммоль). Через 5 мин после перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь анализировали методами ТСХ и ЯМР-спектроскопии.

ТСХ в системе 90% CH₂Cl₂ + 10% C₂H₅OH: R_f (II) = 0.36, R_f (IV) = 0.30.

³¹P-ЯМР (32 МГц, CH₃CN): 5.70, 5.46.

К полученной реакционной смеси добавляли 15 мкл DBU с конечным содержанием основания в системе 2%, выдерживали 5 мин при комнатной температуре, затем анализировали методами ТСХ и ЯМР-спектроскопии.

ТСХ в системе 90% CH₂Cl₂ + 10% C₂H₅OH: R_f (IV) = 0.30, R_f (V) = 0.15, 0.10 (в виде двух диастереомеров).

³¹P-ЯМР (32 МГц, CH₃CN): 5.70, 5.46.

Далее раствор экстрагировали CH₂Cl₂, водная фаза – 1 M KH₂PO₄ (pH 6.5). Органическую фазу упаривали на ротационном испарителе. Продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле, подвижная фаза – раствор CH₂Cl₂, содержащий 1% C₂H₅OH и 0.1% (C₂H₅)₃N. Затем проводили масс-спектрометрический анализ ESI (m/z): 767.0, m_теор. = 766.9 г/моль; m_эксп. = 767.0 г/моль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе описан новый подход к синтезу олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих одну или несколько N-незамещенных амидофосфатных P-NH₂-модификаций, основанный на использовании 9-(флуоренил)-метоксикарбонилазида (FmocN₃) в рамках реакции окисления P^(III) по классической реакции Штаудингера. Основное преимущество разрабатываемого синтетического подхода – его совместимость с протоколом автоматического твердофазного амидофосфитного синтеза олигонуклеотидов, основанного на использовании стандартных защитных групп и линкеров на поверхности CPG-носителя. Нам, к сожалению, не удалось осуществить высокоэффективный синтез электронейтральных, изоструктурных фосфодиэфирному остатку, производных олигонуклеотидов. При этом предложены условия к получению любых мономодифицированных олигодезоксирибонуклеотидов (с выходами ~80%). Однако это дало возможность детально описать влияние модификации на комплексообразование (–P^(V)–NH₂–)-содержащих производных с ДНК-матрицей с точки зрения термодинамических свойств. Важным аспектом исследования стал тот факт, что амидофосфатная группа, находясь внутри олигонуклеотидной цепи, по-видимому, имеет возможность формировать неканонические водородные связи, влияя тем самым на распределение структурных форм свободного олигомера и/или его дуплексной формы. При этом такие неканонические взаимодействия с участием H-донорного (–P^(V)–NH₂–)-остатка не во всех случаях могут содействовать стабилизации комплементарных комплексов ДНК. Кроме того, электронейтральность P-NH₂-группы оказывается обоснованно значимым параметром, определяющим перспективность использования соответствующих изоструктурных аналогов нативных олигонуклеотидов в молекулярно-биологических исследованиях, что было уже неоднократно продемонстрированно ранее [25, 32, 40]. Значимость экспериментально наблюдаемых эффектов, достигаемых при использовании N-незамещенных амидофосфатных производных олигонуклеотидов, очевидно, должна возрастать со снижением ионной силы буферной среды, т.е. в условиях роста значимости электростатических взаимодействий биомолекул. В таких условиях P-NH₂-модификация даже может способствовать формированию ДНК-дуплексов. Считаем необходимым в дальнейшем совершенствовать подходы к автоматическому синтезу (–P^(V)–NH₂–)-содержащих олигонуклеотидов – уникальных изоструктурных аналогов природных биополимеров, лишенных в сайте модификации отрицательного заряда фосфодиэфирного звена при сохранении молекулярной массы, поскольку Ar(O) ~ Mr(NH₂) = 16 Да, фрагменты –(OPO(O)(O–))– и –(OPO(O)(NH₂))– в структуре ДНК практически тождественны. Именно это обстоятельство обусловливает целесообразность разработки эффективных методов синтеза и детального изучения свойств P-NH₂-аналогов олигонуклеотидов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность М.А. Баженову за конструктивную критику при планировании экспериментов и обсуждении результатов, а также ОЦКП ИХБФМ СО РАН за масс-спектрометрический анализ олигонуклеотидов и Химическому исследовательскому центру коллективного пользования СО РАН (НИОХ СО РАН) за проведение спектральных и аналитических измерений.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Синтез модифицированных олигонуклеотидов проводили при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-64-00017), а исследование их свойств выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, государственное задание ИХБФМ СО РАН № 121031300042-1.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований, выполненных автором данной работы, с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Автор ЕАМ участвовал в разработке и проведении экспериментов, анализе данных и подготовке текста статьи. Авторы ИАП, МИМ участвовали в анализе данных и подготовке текста статьи. Автор ДВП участвовал в разработке методологии, а также в доработке финального варианта текста статьи.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие выводы настоящего ис-следования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

作者简介

E. Malova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: malova.ev.an@gmail.com
俄罗斯联邦, prosp. Acad. Lavrentyeva 8, Novosibirsk, 630090

I. Pyshnaya

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
俄罗斯联邦, prosp. Acad. Lavrentyeva 8, Novosibirsk, 630090

M. Meschaninova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
俄罗斯联邦, prosp. Acad. Lavrentyeva 8, Novosibirsk, 630090

D. Pyshnyi

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: pyshnaya@niboch.nsc.ru
俄罗斯联邦, prosp. Acad. Lavrentyeva 8, Novosibirsk, 630090

参考

补充文件