Physically adsorbed coatings based on chitosan for electrophoretic separation of biologically active substances

Full Text

Эволюция метода капиллярного электрофореза (КЭ) в значительной степени обусловлена поиском и применением эффективных модификаторов электрофоретических систем, обеспечивающих реализацию различных режимов КЭ и позволяющих регулировать эффективность и селективность разделения аналитов различной природы [1–3].

Основное ограничение метода КЭ, связанное с сорбцией на стенках кварцевого капилляра оснóвных аналитов (катехоламинов, аминокислот, аминоспиртов, белков), устраняется формированием различных типов покрытий кварцевого капилляра: ковалентных [4, 5], динамических и физически (статически) адсорбированных [6]. Последние представляют особый интерес [7], поскольку их формирование отличается простотой и осуществляется непосредственно перед проведением электрофоретических анализов, при этом в ряде случаев не требуется присутствие модификатора в составе фонового электролита (ФЭ) для обеспечения стабильности покрытия. Востребованными материалами для формирования подобных покрытий в настоящее время являются катионные полимеры [8–13], способствующие формированию стабильных покрытий, обращению электроосмотического потока (ЭОП) и значительному сокращению времени миграции анионных аналитов. Такие покрытия совместимы с масс-спектрометрическим детектированием [14–16].

Хитозан представляет собой деацетилированную форму хитина (схема 1), одного из наиболее распространенных природных биополимеров, обладает высокой адсорбционной способностью и адгезией к стенкам кварцевого капилляра [17, 18]. Его физико-химические свойства существенно зависят от степени деацетилирования [19], от распределения ацетильных групп и молекулярной массы. Хитозан применяли в качестве покрытия капилляров при анализе белков [20], однако отмечен узкий рабочий диапазон pH, в котором данные капилляры можно эффективно использовать. Немодифицированный хитозан растворим только в кислых водных растворах за счет протонирования аминогрупп (pK_b ~ 6.3) [21], поэтому для разделения биологически активных соединений, в первую очередь в качестве модификаторов поверхности капилляров, используют производные хитозана [22–24], в том числе и в составе полислойных покрытий [25, 26].

 

Схема 1. Структура хитина/хитозана. n – количество повторяющихся единиц глюкозамина, m – количество повторяющихся единиц ацетилглюкозамина, n + m – степень полимеризации, n / (m + n) – степень деацетилирования. Когда n превышает 50% от общего количества звеньев, полимер называется хитозаном [17].

 

Несмотря на некоторые обнаруженные ограничения применения хитозана в КЭ при создании покрытий, его аналитические возможности изучены недостаточно, учитывая, что наличие многочисленных хиральных центров может обеспечить ему функции хирального селектора аналогично другим углеводам [27, 28] при разделении энантиомеров биологически активных соединений. Так, низкомолекулярный водорастворимый хитозан использован в составе ФЭ совместно с (2-гидроксипропил)-β-циклодекстрином [29] и эремомицином [30] для электрофоретического энантиоразделения ряда ароматических кислот и профенов.

Цель настоящего исследования – получение физически адсорбированного покрытия на основе высокомолекулярного хитозана со степенью деацетилирования 95 %, выявление его аналитических возможностей при определении аналитов различной природы, а также сопоставление полученных электрофоретических параметров разделения с покрытием на основе широко используемого катионного полиэлектролита поли(диаллилдиметиламмоний хлорида) (ПДАДМАХ) [31–34], активно применяемого при создании многослойных покрытий в КЭ [34–41].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Оборудование. Измерения проводили на приборе для капиллярного электрофореза КАПЕЛЬ®-105M (Люмэкс®, Россия) со спектрофотометрическим детектированием (дейтериевая лампа; спектральный диапазон от 190 до 380 нм) с возможностью гидродинамического и электрокинетического ввода пробы. Использовали кварцевые капилляры общей длиной 60 см и эффективной длиной 50 см, внутренним диаметром 50 мкм, с внешним полиимидным покрытием. Результаты электрофоретических экспериментов обрабатывали с использованием программного обеспечения Эльфоран (Люмэкс, Россия).

Снимки внутренней поверхности кварцевых капилляров получали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с помощью системы Zeiss Merlin (Германия).

Средства измерения и дополнительное оборудование: аналитические весы Shimadzu AUW (Shimadzu, Япония), деионизатор АКВИЛОН Д 301 (Аквилон, Россия), рН-метр HI 2210-2216 (Hanna, Италия), ультразвуковая ванна Сапфир ТТЦ (РМД) (Россия), центрифуга Eppendorf 5430 (Германия), мульти-вортекс V32 (Biosan, Латвия), механические микродозаторы переменного объема емк. 1–20, 20–100 и 100–1000, 500–5000 мкл (Sartorius, Германия)

Реагенты. Гидроксид натрия ч. д. а. (Реахим, Россия), соляная кислота ос. ч. (Реахим, Россия), борная кислота ос. ч. (Реахим, Россия), цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) (Sigma-Aldrich, США), метанол для градиентной ВЭЖХ (Химмед, Россия), ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ (Химмед, Россия), диметилсульфоксид (Sigma-Aldrich, США), бензойная кислота (БК) ч. д. а. (Sigma-Aldrich, Германия), двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na₂ЭДТА) (Sigma-Aldrich, США), дигидрофосфат натрия двуводный х. ч. (Реахим, Россия), диэтаноламин (ДЭА) (Biochem, Франция), хлорид натрия (Sigma-Aldrich, США), трис(гидроксиметил)аминометан (ТРИС) (Sigma-Aldrich, США), фосфорная кислота х. ч. (Реахим, Россия), уксусная кислота х. ч. (Реахим, Россия), (2-гидроксипропил)-β-циклодекстрин (ГП-β-ЦД) с M_r = 1396 (TCI, Япония), β-циклодекстрин (β-ЦД) (Sigma-Aldrich, США), ванкомицина гидрохлорид (Sigma-Aldrich, США).

Модификацию внутренней поверхности кварцевых капилляров осуществляли с использованием ПДАДМАХ с M_w 200 000–350 000, 20 мас. % в воде (Sigma, США); высокомолекулярного хитозана со степенью деацетилирования 95% (кат. № BD120608) (BLD pharm, Германия).

Стандарты, использованные для приготовления модельных смесей. Карбоновые кислоты: щавелевая, муравьиная, винная, яблочная, лимонная, янтарная, молочная, уксусная, пропионовая, масляная х. ч. (Реахим, Россия).

Аминокислоты (Sigma-Aldrich, США): L-фенилаланин (Phe), > 98% ВЭЖХ; D,L-тирозин (Tyr), > 98% ВЭЖХ; D,L-триптофан (Trp), > 98% ВЭЖХ; 3,4-дигидроксифенилаланин (DOPA), > 98% ТСХ.

Катехоламины (Sigma-Aldrich, США): дофамина гидрохлорид (DA), > 97% ВЭЖХ; эпинефрина гидрохлорид (Е), > 98%; норэпинефрина гидрохлорид (NE), > 97% ВЭЖХ; норметанефрина гидрохлорид (NMN), > 98%; 3-метокситирамин (3-MT), > 97%.

Лекарственные вещества (Sigma-Aldrich, США): (±)-пропранолола гидрохлорид, > 99%; (±)-соталола гидрохлорид, > 98%; (±)-карведилол, > 98% ВЭЖХ; (±)-ибупрофен, > 99%; (±)-кетопрофен, > 98%; S-кетопрофен, > 98%; (±)-кеторолак, > 98%.

Приготовление растворов. Концентрированные растворы карбоновых кислот (10 мг/мл щавелевой, муравьиной, винной, яблочной, лимонной, янтарной, молочной, уксусной, пропионовой, масляной) готовили путем растворения точных навесок в деионизованной воде в пластиковых пробирках типа Эппендорф емк. 1.5 мл, затем тщательно перемешивали до полного растворения.

Концентрированные растворы аминокислот (10 мг/мл Phe, Tyr, Trp. DOPA), катехоламинов (2 мг/мл DA, E, NE, NMN, 3-MT) и β-блокаторов (2 мг/мл карведилола, пропранолола, соталола) готовили следующим образом: точные навески вносили в пластиковые пробирки типа Эппендорф емк. 1.5 мл, растворяли в 0.1 М соляной кислоте, перемешивали до полного растворения.

Концентрированные растворы нестероидных противовоспалительных средств (2 мг/мл ибупрофена, кетопрофена, кеторолака) готовили путем растворения точных навесок в метаноле.

Подготовленные растворы хранили в морозильной камере при –20 °С.

Рабочие растворы смесей аналитов заданной концентрации готовили путем разбавления концентрированных растворов в требуемое количество раз деионизованной водой. Их хранили в холодильнике при +4 °С в течение недели.

Приготовление растворов модификаторов. Рабочий раствор хитозана с концентрацией 0.1 мас. % готовили в пластиковой пробирке типа Эппендорф емк. 1.5 мл путем растворения точной навески хитозана в требуемом объеме 1 %-ной уксусной кислоты. Выдерживали в УЗ-бане в течение 5 мин и перемешивали с помощью системы вортекс 3 мин до полного растворения полимера. Приготовленный раствор хитозана оказался достаточно вязким, поэтому его разбавляли в два раза 1 %-ной уксусной кислотой и использовали далее для модификации внутренних стенок кварцевого капилляра.

Рабочий раствор ПДАДМАХ с массовой долей 0.2 мас. % готовили в мерной колбе емк. 5 мл путем разбавления точных навесок следующих компонентов: 0.0500 г 20 %-ного (по массе) раствора ПДАДМАХ, 0.0121 г ТРИС, 0.0434 г NaCl в 0.5 мл 0.1 М HCl. Полученный раствор доводили до метки деионизованной водой.

Приготовление растворов фоновых электролитов. Для исследования зависимости скорости ЭОП на хитозановом покрытии в диапазоне рН 2.0–7.0 ФЭ готовили фосфатные растворы следующим образом: в мерных колбах емк. 50 мл растворяли точные навески дигидрофосфата натрия в 35 мл деионизованой воды и доводили рН до требуемого значения 1 M H₃PO₄ или 1 М раствором NaOH. Таким образом готовили концентрированные фосфатные растворы следующих концентраций: 0.2 М с рН 2.0; 0.6 М с рН 4.1; 0.5 М с рН 5.6; 0.1 М с рН 7.0. Фоновые электролиты получали путем разбавления концентрированных растворов с заданным значением рН деионизованной водой в требуемое количество раз так, чтобы значение тока было сопоставимо (32–34 мкА). Маркер ЭОП – 0.05% (по объему) диметилсульфоксида (ДМСО).

Электрофоретические подвижности ЭОП (µ_ЭОП) рассчитывали по формуле:

$\mu \iota =\frac{l_{эфф}\cdot l_{общ}}{t_{ЭОП}\cdot U}$, (1)

где l_эфф – длина капилляра до ячейки детектирования, см; l_общ – общая длина капилляра, см; t_ЭОП – время миграции ЭОП, с; U – напряжение, В.

Для разделения карбоновых кислот на непокрытом капилляре использовали ФЭ следующего состава: 10 мМ БК, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДЭА, 0.5 мМ ЦТАБ и 0.2 об. % метанола. На модифицированных капиллярах разделение проводили в ФЭ, содержащем 10 мМ БК, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДЭА и 0.2 об. % метанола [39].

Для разделения аминокислот и катехоламинов использовали 10 мМ фосфатный буферный раствор с рН 2 (доведенный 1 M H₃PO₄).

Для разделения энантиомеров лекарственных веществ применяли фосфатные буферные растворы с концентрациями 10–50 мМ с рН 2.0, 4.2, 6.4, 7.0, 7.4. или ацетатно-аммиачный буферный раствор с рН 4.3. В состав ФЭ вводили хитозан в концентрации 0.01 мас. %, а также второй хиральный селектор (ГП-β-ЦД, β-ЦД, ванкомицин) в диапазоне концентраций 0.25–5 мМ. Для изменения гидрофобно-гидрофильного баланса в состав ФЭ вводили метанол и ацетонитрил в концентрации 5–20 об. %.

Условия формирования физически адсорбированных покрытий стенок кварцевого капилляра. Подготовка капилляра к работе. Новый кварцевый капилляр последовательно промывали ацетонитрилом (10 мин, 1000 мбар), деионизованной водой (10 мин, 1000 мбар), 0.1 М HCl (10 мин, 1000 мбар), деионизованной водой (5 мин, 1000 мбар), 0.5 М раствором NaOH (30 мин, 2000 мбар) и снова деионизованной водой (10 мин, 1000 мбар). Контролировали скорость ЭОП с использованием в качестве ФЭ 10 мМ боратный буферный раствор с рН 9.3 и промывали капилляр в течение 10 мин деионизованной водой.

Покрытие на основе хитозана. Капилляр модифицировали по схеме, описанной в работах [20, 22], с некоторыми изменениями: капилляр промывали раствором хитозана в течение 15 мин и оставляли в контакте с ним на 10 мин. Затем промывали деионизованной водой в течение 10 мин. Покрытие стабилизировали в 10 мМ фосфатном растворе (рН 2.0) при напряжении +10 кВ в течение 10 мин. Затем измеряли µ_ЭОП в фоновом электролите того же состава при – 20 кВ.

Покрытие на основе ПДАДМАХ. Капилляр модифицировали согласно разработанной ранее схеме [38]: перед модификацией раствор ПДАДМАХ выдерживали в УЗ-бане в течение 5 мин и перемешивали с помощью системы вортекс 5 мин. Далее подготовленным раствором промывали капилляр в течение 60 мин, затем промывали 10 мин деионизованной водой для удаления излишков полимера. Стабилизацию покрытия и измерение ЭОП проводили в условиях, аналогичных приведенным для хитозана.

Оценка стабильности покрытий при воздействии различных растворов и органических растворителей. Модифицированные капилляры последовательно промывали в течение 15 мин различными растворителями в следующей последовательности: ацетонитрил – метанол – ДМСО – 0.1 М раствор NaOH – 0.1 M HCl. Фиксировали время миграции ЭОП до промывки растворителями и после.

Степень изменения ЭОП (%) рассчитывали по формуле:

${\%}_{изменения}= \frac{t_{ЭОП после}-t_{ЭОП до}}{t_{ЭОП до}}\times 100\%$, (2)

где t_{ЭОП до} – время миграции ЭОП до обработки, мин; а t_{ЭОП после} – время миграции ЭОП после обработки соответствующим растворителем, мин.

Условия проведения электрофоретических экспериментов. Модельные смеси аминокислот, катехоламинов и лекарственных веществ на непокрытом капилляре разделяли при напряжении +20 кВ; на модифицированных капиллярах – при напряжении –20 кВ; разделение смеси карбоновых кислот также при напряжении –20 кВ. Температура термостатирования – 20°C; длина волны детектирования для всех аналитов – 230 нм; время гидродинамического ввода пробы варьировали в диапазоне 2–50 с; давление ввода пробы – 30–100 мбар.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исходя из структуры хитозана, модификация поверхности капилляра при разделении аналитов в условиях КЭ могла бы обеспечить следующие эффекты:

• за счет протонирования аминогрупп в кислой среде и высокой молекулярной массы молекулы хитозана сформированное покрытие на поверхности капилляра должно генерировать обращенный (анодный) ЭОП, что, в свою очередь, предотвращает сорбцию основных аналитов и способствует росту эффективности разделения;
• наличие множества функциональных групп (амино- и гидрокси-) в составе хитозана может способствовать увеличению селективности разделения определяемых соединений посредством различных взаимодействий с аналитами;
• хитозан, в составе молекулы которого имеется много хиральных центров, может выступить в качестве хирального селектора при разделении энантиомеров лекарственных веществ.

На основании перечисленных выше ожидаемых эффектов исследование аналитических характеристик монослойного хитозанового покрытия и сопоставление с покрытием на основе ПДАДМАХ включало несколько этапов:

• построение зависимости ЭОП от рН фонового электролита и контроль стабильности сформированных покрытий при обработке различными растворами и органическими растворителями;
• сопоставление эффективности и селективности разделения оснóвных и кислотных аналитов на сформированных покрытиях;
• выявление возможностей хитозана в качестве хирального селектора, в том числе и в составе двойных хиральных систем (расширение хирального окна) при разделении энантиомеров лекарственных веществ.

Зависимости ЭОП от рН на сформированных покрытиях на основе хитозана и контроль их стабильности. Формирование покрытия на основе катионного полиэлектролита должно сопровождаться изменением поверхностного заряда кварцевого капилляра и, следовательно, величины и направления электроосмотического потока (на немодифицированном капилляре регистрируется катодный ЭОП). На величину ЭОП влияют плотность покрытия и pH фонового электролита, а воспроизводимость ЭОП от анализа к анализу в ФЭ, не содержащим модификатор, является показателем стабильности покрытия. На капиллярах, модифицированных хитозаном, выявили зависимость скорости ЭОП от pH фонового электролита (рис. 1): при увеличении рН скорость ЭОП уменьшается. Поскольку хитозан при рН > 6 (рK_b ~ 6.3) не может обеспечить отрицательный заряд, то наличие нормального (катодного) ЭОП при рН 7 достигается благодаря диссоциации остаточных силанольных групп на поверхности капилляра. А на покрытии на основе ПДАДМАХ изменение заряда поверхности капилляра в диапазоне рН от 2 до 10 не наблюдается вовсе, что указывает на формирование плотного слоя модификатора, максимально экранирующего силанольные группы поверхности капилляра [39].

 

Рис. 1. Зависимости электрофоретической подвижности ЭОП (µ_ЭОП) от рН фонового электролита: 1 – непокрытый капилляр; 2 – капилляр, модифицированный ПДАДМАХ [39]; 3 – капилляр с покрытием на основе хитозана.

 

Наличие слоя хитозана после модификации независимо подтвердили методом сканирующей электронной микроскопии (рис. 2). Установили, что толщина покрытия составляет 45–70 нм (рис. 2б), а покрытия на основе ПДАДМАХ – 15–20 нм (рис. 2в).

 

Рис. 2. СЭМ-снимки поперечного среза капилляра с покрытием (а), (б) на основе хитозана и (в) ПДАДМАХ, полученные при различном увеличении с масштабной риской: (а) 2 мкм; (б), (в) 200 нм. Прибор: Zeiss Merlin, изображение во вторичных электронах.

 

Оценили стабильность покрытий в течение дня (n = 10), при длительном использовании и при воздействии различных органических растворителей. В качестве критерия использовали относительное стандартное отклонение (s_r) времени миграции и степень изменения ЭОП. Ниже приведены значения s_r (%) времен миграций ЭОП на покрытиях на основе хитозана и ПДАДМАХ (P = 0.95):

В табл. 1 приведены значения степени изменения ЭОП на покрытиях на основе хитозана и ПДАДМАХ. Изменение скорости ЭОП может свидетельствовать как о разрушении покрытия, так и в случае полимерных модификаторов об изменении конформации или толщины слоя полимера на стенках капилляра. Следует отметить, что оба покрытия являются достаточно стабильными, поскольку времена миграции ЭОП практически не меняются при длительном использовании (табл. 1). Установили, что покрытие на основе хитозана является более устойчивым по отношению к действию различных растворителей и позволяет проводить анализы в фоновых электролитах с их высоким содержанием, что важно при контроле гидрофильно-гидрофобного баланса в системе.

 

Таблица 1. Значения степени изменения электроосмотического потока на покрытиях на основе хитозана и ПДАДМАХ

Растворитель	Хитозан			ПДАДМАХ
	tЭОП до, мин	tЭОП после, мин	изменение, %	tЭОП до, мин	tЭОП после, мин	изменение, %
Ацетонитрил	6.78	6.77	–0.2	7.00	7.05	0.7
Метанол	6.77	6.80	0.4	7.05	6.99	–0.9
ДМСО	6.80	6.86	0.9	6.99	6.39	–8.6
1 M раствор NaOH	6.86	6.89	0.5	6.39	6.65	4.1
0.1 M HCl	6.89	7.03	2.1	6.65	6.63	–0.4

 

Применение сформированных монослойных покрытий для разделения органических кислот, аминокислот и катехоламинов. Ранее [39] испытаны физически адсорбированные покрытия на основе ПДАДМАХ при разделении органических кислот, поэтому на примере этих аналитов в первую очередь исследовали аналитические возможности покрытия на основе хитозана.

При разделении органических кислот эффективность на двух разных покрытиях сопоставима (рис. 3, табл. 2), в то время как разрешение R_s аналитов на хитозановом покрытии примерно в два раза выше, чем на ПДАДМАХ. Такой эффект может наблюдаться из-за того, что при одинаковом значении рН генерируемый хитозаном ЭОП слабее: времена миграции органических кислот увеличиваются и селективность разделения растет. По значениям пределов обнаружения (ПО) кислот покрытие на основе хитозана незначительно уступает ПДАДМАХ (табл. 2).

 

Рис. 3. Электрофореграммы модельной смеси органических кислот: (а) капилляр, модифицированный ПДАДМАХ; (б) капилляр, модифицированный хитозаном. Фоновый электролит: 10 мМ бензойная кислота, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДЭА. Модельная смесь карбоновых кислот 25 мкг/мл: 1 – щавелевая, 2 – муравьиная, 3 – винная, 4 – лимонная, 5 – яблочная, 6 – молочная, 7 – янтарная, 8 – уксусная, 9 – пропионовая, 10 – масляная.

 

Таблица 2. Значения эффективности (N), разрешения (R_s) и пределов обнаружения карбоновых кислот, достигнутых на исследуемых покрытиях

Аналит	N, тыс. т. т.		Rs		ПО, мкг/мл
	ПДАДМАХ	хитозан	ПДАДМАХ	хитозан	ПДАДМАХ	хитозан
Щавелевая	117	42	2.5	6.1	0.74	0.96
Муравьиная	163	236	1.9	4.4	1.27	1.50
Винная	205	97	–	–	0.82	0.63
Молочная	450	477	2.6	6.8	0.79	1.02
Янтарная	492	427	7.8	16.0	0.43	0.60
Уксусная	231	325	7.2	13.4	0.61	0.77
Пропионовая	193	218	0.9	1.9	0.72	0.88
Масляная	182	225	–	–	0.74	0.91

 

Определение яблочной (малат) и лимонной (цитрат) кислот на сформированных покрытиях затруднено наложением системного пика.

Эффективность экранирования остаточных силанольных групп на поверхности капилляра можно оценить при разделении основных аналитов в кислой среде. Так, при рН 2 фонового электролита на немодифицированном капилляре для катехоламинов и аминокислот значения эффективности и селективности разделения существенно ниже, чем полученные на обоих сформированных покрытиях (рис. 4, табл. 3).

 

Рис. 4. Электрофореграммы модельной смеси аминокислот и катехоламинов (50 мкг/мл): (а) немодифицированный капилляр; (б) капилляр, модифицированный хитозаном; (в) капилляр, модифицированный ПДАДМАХ. Фоновый электролит: 10 мМ фосфатный буферный раствор с рН 2.0. Аналиты: 1 – DOPA, 2 – Tyr, 3 – Phe, 4 – Trp, 5 – E, 6 – NMN, 7 – NE, 8 – 3-MT, 9 – DA.

 

Таблица 3. Значения эффективности (N) и разрешения (R_s) аминокислот и катехоламинов, достигнутые на различных капиллярах

Аналит	N, тыс. т. т.			Rs
	немодифицированный	ПДАДМАХ	хитозан	немодифицированный	ПДАДМАХ	хитозан
DOPA	63	228	193	1.7	0.8	0.9
Tyr + Phe	53	140	162	4.0	1.3	2.1
Trp	68	183	187	33.2	22.4	30.2
E	64	138	95	1.4	2.1	2.0
NMN	96	126	98	1.2	2.1	1.8
NE	115	134	113	2.1	3.9	3.5
3-MT	80	148	84	1.2	2.7	2.5
DA	85	114	85	–	–	–

 

Как и следовало ожидать, покрытие на основе ПДАДМАХ (рис. 4в), содержащее в структуре аммонийные катионы, обеспечило эффективность примерно в 1.5 раза выше, чем хитозановое покрытие с протонированными аминогруппами (рис. 4б).

Таким образом, покрытие на основе хитозана при разделении аминокислот, катехоламинов и органических кислот незначительно уступает в эффективности, при этом разрешение, как правило, выше по сравнению с покрытием на основе ПДАДМАХ. Это указывает на дополнительные взаимодействия между аналитами и поверхностью модифицированного хитозаном капилляра, которые приводят к увеличению селективности разделения.

Возможности хитозана в качестве хирального селектора. В отличие от ПДАДМАХ, хитозан обладает множеством хиральных центров и может выступать в качестве хирального селектора. Серия экспериментов включала выявление возможностей энантиомерного разделения:

• на модифицированных хитозаном капиллярах;
• с использованием хитозана в составе ФЭ;
• применение физически адсорбированных покрытий на основе хитозана в сочетании с другим хиральным селектором в фоновом электролите (двойные хиральные системы).

В качестве аналитов выбрали рацематы лекарственных веществ: β-блокаторы (пропранолол, соталол и карведилол) и нестероидные противовоспалительные средства (кетопрофен и кеторолак, ибупрофен).

Выбор рН ФЭ является важнейшей задачей при разделении энантиомеров биологически активных веществ. При рН < 6 покрытие на основе хитозана заряжено положительно, β-блокаторы также находятся в катионной форме, следовательно, взаимодействие с хиральными центрами ограничено электростатическим отталкиванием. В случае кислотных аналитов – профенов, наоборот, может наблюдаться сильная сорбция на поверхности модифицированного капилляра. По этой причине поиск условий хирального разделения проводили в ФЭ со значением рН, близким к нейтральному. В этом случае, как показано выше, наблюдается слабый катодный ЭОП и аналиты мигрируют практически за счет собственных электрофоретических подвижностей.

На капиллярах, модифицированных хитозаном, в указанных условиях не достигнуто разделение энантимеров β-блокаторов и профенов, поэтому для увеличения количества активных центров хитозан независимо вводили в состав фонового электролита с различным рН (0.01 мас. %). При этом селективность разделения кеторолака и ибупрофена (рН 6.4) возросла, однако наличие хитозана в ФЭ не привело к разделению энантиомеров этих соединений (рис. 5б, 6б).

 

Рис. 5. Электрофореграммы модельной смеси β-блокаторов на различных капиллярах: (а)–(в) капилляр, модифицированный хитозаном; (г), (д) немодифицированный капилляр; (е) капилляр с покрытием на основе ПДАДМАХ. Фоновый электролит: (а), (г) 25 мМ фосфатный буферный раствор (ФБР) с рН 2.0; (б) 25 мМ ФБР с рН 2.0, 0.01 мас. % хитозана; (в), (д), (е) 25 мМ ФБР с рН 2.0, 5 мМ ГП-β-ЦД. Аналиты: 1 – соталол, 2 – пропранолол, 3 – карведилол.

 

Рис. 6. Электрофореграммы модельной смеси нестероидных противовоспалительных средств (25 мкг/мл). Капель-105М; капилляр, модифицированный хитозаном. Фоновый электролит: (а) 25 мМ фосфатный буферный раствор (ФБР) с рН 6.4; (б) 25 мМ ФБР с рН 6.4, 0.01 мас. % хитозана; (в) 25 мМ ФБР с рН 6.4, 0.5 мМ ГП-β-ЦД; (г) 25 мМ ФБР с рН 6.4, 0.5 мМ β-ЦД; (д) 25 мМ ФБР с рН 4.2, 2.5 мМ ванкомицин, 10 об. % метанола; (е) немодифицированный капилляр, 25 мМ ФБР с рН 4.2, 2.5 мМ ванкомицин, 10 об. % метанола. Аналиты: 1 – кеторолак, 2 – кетопрофен, 3 – ибупрофен.

 

Последний этап исследования включал изучение покрытий на основе хитозана в двойных хиральных системах с участием ГП-β-ЦД, β-ЦД и ванкомицина в составе ФЭ. При разделении β-блокаторов в качестве второго хирального селектора использовали ГП-β-ЦД [42–44], который вводили в состав ФЭ. На немодифицированном капилляре с ГП-β-ЦД в ФЭ наблюдается частичное разделение энантиомеров пропранолола и карведилола, и полностью отсутствует разделение энантиомеров соталола (рис. 5д). Поскольку ПДАДМАХ и хитозан генерируют обращенный ЭОП, происходит изменение порядка миграции энантиомеров, что является большим преимуществом при определении примесей менее активных R-изомеров на фоне высоких концентраций S-изомера. Установили, что хитозан в составе двойной хиральной системы обеспечивает наибольшие значения селективности разделения энантиомеров пропранолола (α = 1.04) и карведилола (α = 1.05). При этом наблюдалось также частичное разделение энантиомеров соталола (α = 1.02), которое не достигалось в других вариантах: на немодифицированном капилляре и на капилляре, покрытом ПДАДМАХ (рис. 5). Энантиомеры идентифицировали методом стандартной добавки.

При разделении энантиомеров нестероидных противовоспалительных средств в качестве второго хирального селектора ранее [45] выявлены возможности β-ЦД, ГП-β-ЦД и ванкомицина, наиболее часто используемых для данной цели. Нами установлено, что при рН 6.4 фонового электролита наблюдается разделение энантиомеров кетопрофена в присутствии β-ЦД (рис. 6). β-ЦД из выбранных хиральных селекторов наиболее гидрофобен, поэтому с его участием образуются более прочные комплексы – аналит-хиральный селектор, что приводит к разделению энантиомеров кетопрофена.

Ванкомицин благодаря наличию в его структуре как амино-, так и карбоксильных групп может использоваться в виде незаряженного или заряженного хирального селектора в зависимости от значения рН фонового электролита. По этой причине разделение энантиомеров профенов независимо проводили также при рН ~ 4. Когда покрытие на основе хитозана заряжено положительно, ванкомицин также имеет положительный заряд, в результате возможны конкурентные взаимодействия с отрицательно заряженными аналитами (рК_а ~ 3.5–3.8). В эксперименте варьировали природу ФЭ (ацетатно-аммиачный буферный раствор с рН 4.3; фосфатный буферный раствор с рН 4.2), его концентрацию (10–50 мМ), а также добавку в ФЭ органических растворителей (ацетонитрил, метанол; 5–20 об. %).

Проведенные электрофоретические эксперименты показали, что в фосфатном буферном растворе происходит частичное разделение энантиомеров кеторолака, в то время как в ацетатно-аммиачном буферном растворе они мигрируют совместно. Построили графические зависимости разрешения энантиомеров профенов от состава фонового электролита (рис. 7). Селективность разделения энантиомеров аналитов увеличивается при повышении концентрации буферного раствора и содержания ванкомицина в ФЭ. Такая зависимость обусловлена снижением скорости ЭОПа в первом случае и увеличением количества хиральных центров для дискриминации энантиомеров – во втором. Среди испытанных органических растворителей в составе ФЭ метанол в большей степени влияет на электрофоретические параметры миграции энантиомеров, а максимальные значения эффективности и селективности разделения достигнуты при его концентрации в ФЭ 10 об. %. Наибольшее разрешение энантиомеров кетопрофена (R_s = 3.0) и кеторолака (R_s = 3.0) наблюдалось в следующих условиях: 25 мМ фосфатный буферный раствор с рН 4.2, 2.5 мМ ванкомицин, 10 об. % метанола (рис. 6д).

 

Рис. 7. Зависимости разрешения (R_s) энантиомеров (1) кеторолака и (2) кетопрофена от состава фонового электролита. Условия: капилляр, модифицированный хитозаном; фоновый электролит: (а) 10–25 мМ ФБР с рН 4.2, 1 мМ ванкомицин; (б) 25 мМ ФБР с рН 4.2, 1 мМ ванкомицин, 0–20 об. % метанола; (в) 25 мМ ФБР с рН 4.2, 0–5 мМ ванкомицин, 10 об. % метанола. Аналиты: 1 – кеторолак, 2 – кетопрофен.

 

Для выявления роли покрытия на основе хитозана при хиральном разделении энантиомеров нестероидных противовоспалительных средств сопоставили миграционные характеристики аналитов, полученные на покрытом хитозаном капилляре и немодифицированном капилляре, с использованием ванкомицина в составе ФЭ. Установили, что ванкомицин в последнем случае обеспечивает в аналогичных условиях разделение энантиомеров кеторолака и кетопрофена с разрешением 1.3 и 1.4 соответственно (рис. 6д).

* * *

Таким образом, хитозан образует равномерное стабильное покрытие на поверхности кварцевого капилляра. При разделении аминокислот, катехоламинов и органических кислот сформированные покрытия на основе хитозана незначительно уступают в эффективности покрытиям из ПДАДМАХ, но обеспечивают более высокое разрешение исследуемых биологически активных аналитов. Хитозан вносит значительный вклад в разделение энантиомеров лекарственных веществ (профенов и β-блокаторов) в присутствии в составе фонового электролита второго хирального селектора (ванкомицина и ГП-β-ЦД соответственно).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 24-13-00378 (электрофоретические эксперименты), и Санкт-Петербургского государственного университета, НИР № 122040800256-8 (формирование и характеризация физически адсорбированных покрытий внутренних стенок кварцевого капилляра). Эксперименты проведены с использованием инфраструктуры Санкт-Петербургского государственного университета (кафедра органической химии, лаборатория плазмонно-усиленной спектроскопии и биоимиджинга, ресурсный центр по направлению “Нанотехнологии”). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

E. A. Kolobova

Institute of Chemistry of the Saint Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: ekatderyabina@mail.ru
Russian Federation, 26, Universitetsky Ave., Peterhof, Saint Petersburg, 198504

E. R. Ziangirova

Institute of Chemistry of the Saint Petersburg State University

Email: ekatderyabina@mail.ru
Russian Federation, 26, Universitetsky Ave., Peterhof, Saint Petersburg, 198504

E. V. Solovyova

Institute of Chemistry of the Saint Petersburg State University

Email: ekatderyabina@mail.ru
Russian Federation, 26, Universitetsky Ave., Peterhof, Saint Petersburg, 198504

L. A. Kartsova

Institute of Chemistry of the Saint Petersburg State University

Email: ekatderyabina@mail.ru
Russian Federation, 26, Universitetsky Ave., Peterhof, Saint Petersburg, 198504

References

Supplementary files