Вольтамперометрическое определение антител к вирусу кори с использованием стеклоуглеродного электрода, модифицированного 2-пропаргилтио-6-нитро-7-гидрокси-4н-1,2,4-триазоло-4,7-дигидро[5,1-с]-1,2,4-триазином

М. В. Медведева; Медведева М. В.; А. В. Мазур; Мазур А. В.; Т. С. Свалова; Свалова Т. С.; И. А. Балин; Балин И. А.; В. Л. Русиновa; Русиновa В. Л.; А. И. Матерн; Матерн A. И.; А. Н. Козицина; Козицина А. Н.

doi:10.31857/S0044450224010056

Вольтамперометрическое определение антител к вирусу кори с использованием стеклоуглеродного электрода, модифицированного 2-пропаргилтио-6-нитро-7-гидрокси-4н-1,2,4-триазоло-4,7-дигидро[5,1-с]-1,2,4-триазином

Authors: Медведева М.В.¹, Мазур А.В.¹, Свалова Т.С.², Балин И.А.¹, Русиновa В.Л.¹^,2, Матерн А.И.¹, Козицина А.Н.¹
Affiliations:
1. Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б. Н. Ельцина
2. Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения Российской академии наук
Issue: Vol 79, No 1 (2024)
Pages: 41-49
Section: Articles
Submitted: 30.06.2024
Accepted: 30.06.2024
URL: https://bakhtiniada.ru/0044-4502/article/view/258177
DOI: https://doi.org/10.31857/S0044450224010056
EDN: https://elibrary.ru/lewmtw
ID: 258177

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Предложен способ вольтамперометрического определения антител к вирусу кори с использованием стеклоуглеродного электрода, модифицированного 2-пропаргилтио-6-нитро-7-гидрокси-4Н-1,2,4-триазоло-4,7-дигидро[5,1-с]-1,2,4-триазином. Синтезированное оригинальное соединение, иммобилизованное на поверхности карбоксилированных углеродных нанотрубок с использованием тиолиновой реакции обеспечивало образование аналитического сигнала и одновременно служило в качестве кросс-линкера для иммобилизации биорецептора – антигена вируса кори. Выбраны рабочие условия определения антител к вирусу кори (режим регистрации сигнала, время инкубации, температура, pH проведения измерений, концентрация иммобилизуемого антигена). Получена линейная градуировочная зависимость I*(%) = –(1.5±0.7)lgс(МЕ/мл) + (29±2) (R2 = 0.9653) в диапазоне концентраций антител к вирусу кори 0.1–5.0 МE/мл. Рассчитанный по 3σ-критерию предел обнаружения 0.17 МЕ/мл позволяет использовать предложенный способ для экспресс-анализа биологических жидкостей.

Keywords

вольтамперометрия, азолоазин, электрохимическое определение, антитела вируса кори, иммуноанализ

Full Text

Возбудитель кори относится к числу наиболее контагиозных РНК-вирусов, а также остается одной из основных причин детской заболеваемости и смертности во всем мире [1]. Инфекция быстро распространяется воздушно-капельным путем и вызывает тяжелые осложнения со стороны центральной нервной системы, органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. Помимо этого, большая часть смертей от кори связана с вторичными инфекциями, возникающими в результате вызванного корью подавления иммунных реакций. Для предотвращения распространения кори необходимо определять быстро не только антигены, но и антитела, по наличию и уровню которых можно выявить бессимптомное течение болезни и эффективность вакцинации [2].

В стационарных медицинских лабораториях антитела к вирусу кори определяют методом иммуноферментного анализа со спектрофотометрическим детектированием. Положительными считаются пробы с содержанием антител выше 0.18 МЕ/мл, 0.18–0.12 МЕ/мл – сомнительный результат, рекомендуется повторить тест, до 0.12 МЕ/мл – отрицательный [3].

Несмотря на актуальность проблемы, описаны лишь единичные подходы к созданию биосенсоров для внелабораторной экспресс-диагностики кори [4, 5]. Так, авторами работы [4] предложен импедиметрический иммуносенсор для определения антител к вирусу кори, рецепторный слой которого структурирован посредством модификации поверхности рабочего электрода 4-(2-аминоэтил) бензолдиазонием и иммобилизации биорецептора с использованием глутарового альдегида.

Линейный диапазон определяемых концентраций составил 3×10^–5−0.3 МЕ/мл, предел обнаружения (ПО) – 9.6×10^–6 МЕ/мл. Ранее нами разработан способ определения антител к вирусу кори на модифицированном аминобензойной кислотой углеродсодержащем электроде с последующей иммобилизацией антигена вируса кори по реакции с глутаровым альдегидом [5]. Предложенный сенсор позволяет определять антитела в диапазоне концентраций 10–1 000 нг/мл.

В конструкциях электрохимических биосенсорных систем в качестве распознающего агента, как и в традиционных методах, используют биорецепторы, применение которых сопряжено с такими трудностями, как высокая стоимость, ограниченный срок хранения реагентов и необходимость соблюдения физиологических условий как на стадии анализа, так и при иммобилизации рецептора на сенсорной поверхности.

Применение малых органических молекул в конструкциях портативных электрохимических устройств в качестве полифункциональных материалов – электроактивных меток, кросс-линкеров и элементов молекулярного распознавания – сегодня особенно перспективно, поскольку позволяет расширить аналитические и операционные возможности таких систем.

Как правило, иммобилизация биорецептора обеспечивается за счет взаимодействия карбоксильных, амино- и/или сульфгидрильных функциональных групп с предварительно функционализированной поверхностью рабочего электрода. Наиболее распространенной способом иммобилизации биомолекул является карбодиимдная сшивка.

Так, в работе [6] авторы показали эффективность применения данной реакции при разработке импедиметрического сенсора для определения вируса денге. Планарный электрод, изготовленный методом трафаретной печати, модифицировали антителами, после чего инкубировали в суспензии аналита. Разработанный сенсор успешно апробирован на белке вируса денге с ПО 0.3 нг/мл и линейным диапазоном определяемых концентраций 1–200 нг/мл, что превосходит многие аналоги [7, 8].

Другим подходом к иммобилизации биорецептора на поверхности электрода является применение реакции клик-химии. В частности, ранее мы показали [9, 10] возможность применения реакции катализируемого медью азид-алкинового циклоприсоединения для иммобилизации антител E. coli и S. aureus на предварительно функционализированную электропроводящим полимером поверхность стеклоуглеродного электрода.

Такой подход реализован в импедиметрическом и вольтамперометрическом сенсорах для определения соответствующих бактерий. Иммуносенсоры имеют хорошие аналитические характеристики (ПО 7.2 КОЕ/мл и 15.9 КОЕ/мл соответственно, линейный диапазон 10²–10⁶ КОЕ/мл), просты в изготовлении, стабильны при хранении и превосходят по аналитическим характеристикам разработанные ранее аналоги.

Не менее актуальной задачей является структурирование поверхности биосенсора, например за счет избирательного взаимодействия линкера с биорецептором. В работе [11] показано влияние способа иммобилизации рецепторного слоя на аналитические характеристики иммуносенсора путем сравнения иммобилизации антител на золотых наночастицах, модифицированных L-аспаргином, и на золотом рабочем электроде с нанесенными золотыми наночастицами, активированными карбодиимидами. В случае с иммобилизацией на наночастицах, модифицированных L-аспарагином, сенсор показал больший линейный диапазон, что предположительно обусловлено большей доступностью вариабельных участков антител по сравнению со стандартным методом карбодиимидной сшивки.

Особенно перспективным является использование в качестве кросс-линкеров органических молекул, способных к избирательному взаимодействию с определенными участками биорецептора. Так, соединения класса азолоазинов, к которым относится зарегистрированное лекарственное средство “Триазаририн”, демонстрируют высокую активность в отношении широкого круга РНК-вирусов, таких как возбудители гриппа, коксаки, клещевого энцефалита и др., обусловленную мультитаргетным взаимодействием, в том числе с вирусным белком гемагглютинином [12, 13].

В ходе ранее проведенных исследований с применением комплексного подхода и комбинированных методов анализа нами предложены вероятные механизмы электрохимических превращений нитроазолоазинов с образованием интермедиатов радикальной природы и показана их взаимосвязь с биологической активностью ряда оригинальных противовирусных соединений азолоазинового и азолопиримидинового рядов [14, 15].

С учетом выраженных электрохимических свойств, доказанной биологической активности и эффективности в отношении ряда РНК-вирусов соединения класса триазолотриазинов могут являться перспективными функциональными материалами в конструкциях электрохимических сенсорных устройств и тест-систем. Наибольший интерес для использования в электрохимических сенсорах представляют производные азолоазинов, содержащие в своей структуре электрохимическую метку (в данном случае нитрогруппу) и функциональную группу для иммобилизации молекулы на поверхность рабочего электрода – ацетиленовый фрагмент.

В нашей работе предложен вольтамперометрический способ определения антител к вирусу кори с использованием оригинального соединения азолоазинового ряда – 2-пропаргилтио-6-нитро-7-гидрокси-4Н-1,2,4-триазоло-4,7-дигидро[5,1-с]-1,2,4-триазина (Аза1) (схема 1), обеспечивающего возникновение аналитического сигнала и одновременно являющегося кросс-линкером для иммобилизации биорецепторного слоя.

Схема 1. Структурная формула 2-пропаргилтио-6-нитро-7-гидрокси-4Н-1,2,4-триазоло-4,7-дигидро[5,1-с]-1,2,4-триазина

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы. 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК) (≥97%), N-гидроксисукцинимид (НГС) (≥97%), аминоэтантиол (99%), диметилсульфоксид (ДМСО) (99.5%), азобисизобутиронитрил (АИБН) (99%), карбоксилированные многостенные углеродные нанотрубки (УНТ) (≥98%), хлорид калия (≥99%), гексацианоферрат калия(II) и гексацианоферрат калия (III) (≥99%) приобретали у фирмы Sigma-Aldrich (США). Использовали следующие коммерческие реактивы: фосфорную кислоту (85%) (Prayon, Бельгия), борную кислоту (99.9%) (“Реахим”, Россия), ледяную уксусную кислоту (99.8%) (завод ПКС, Россия), коревой антиген NovO/96 в концентрации 2,33 мг/мл (“Вектор”, Россия) и антитела к кори (“Вектор”, Россия).

Все растворы готовили с использованием деионизованной воды, произведенной на деионизаторе Barnstead Pacific TII (Thermo Scientific, США). Буферный раствор Бриттона–Робинсона (ББР) готовили смешиванием 0.04 М борной кислоты, 0.04 М фосфорной кислоты и 0.04 М уксусной кислоты для получения необходимого значения рН [16]. 2-Пропаргилтио-6-нитро-7-гидрокси-4Н-1,2,4-триазоло-4,7-дигидро [5,1-с]-1,2,4-триазин (Аза1) синтезировали по методике [14].

Электрохимические исследования проводили с использованием потенциостата/гальваностата Autolab PGSTAT 204 (Metrohm-Autolab, Нидерланды). В работе применяли трехэлектродную ячейку, включающую рабочий электрод – стеклоуглеродный электрод (СУЭ) (d = 2 мм) (Metrohm, Швейцария), электрод сравнения – хлоридсеребряный (Ag/AgCl, KCl 3 М) и противоэлектрод – стеклоуглеродный стержень.

Для полировки поверхности стеклоуглеродного электрода применяли набор kit 6.2802.010 (Metrohm, Швейцария), включающий оксид алюминия с дисперсностью частиц 0.3 мкм и тканевую подложку. Перед каждым электрохимическим измерением в течение 10 мин. растворы продували аргоном (чистота 99.9%).

Модифицирование углеродных нанотрубок 2-пропаргилтио-6-нитро-7-гидрокси-4Н-1,2,4-триазоло-4,7-дигидро[5,1-с]-1,2,4-триазином. Синтезированное производное азолоазина иммобилизовали по реакции карбодимодной сшивки с аминоэтантиолом с последующей тиолиновой реакцией (рис. 1).

Рис. 1. Схема получения модифицированных производными азолоазинов углеродных нанотрубок

Карбоксилированные многостенные углеродные нанотрубки (с = 1 мг/мл) диспергировали в 1 мл ББР (pH 5.0) в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Далее карбоксильные группы активировали добавлением НГС и ЭДК в молярном соотношении 1:4 (0.1 М : 0.4 М) и перемешиванием смеси в течение 30 мин. После этого в реакционную смесь добавляли 0.1 М аминоэтантиол.

Реакцию проводили при перемешивании в течение двух часов. На последней стадии добавляли 0.1 М раствор Аза1 в ДМСО и 1×10^–3 М раствор радикального инициатора АИБН. Реакцию проводили в течение двух часов при 60°С. Во избежание агрегации УНТ-пробирку с реакционной массой помещали ультразвуковую ванну. Непрореагировавшие компоненты удаляли путем центрифугирования и многократной промывки ББР (pH 5.0).

ИК-спектроскопия. Исследования проводили после каждого этапа модификации углеродных наноматериалов в диапазоне волновых чисел от 4 000 до 400 см^–1. Полученные нанокомпозитные материалы измельчали в ступке и смешивали с KBr для формирования таблетки под прессом. Для проведения измерений, преобразований и оценки полученных спектральных данных использовали программное обеспечение Opus.

В ИК-спектрах, зарегистрированных для УНТ-Аза1, присутствуют характерные полосы поглощения в области 1 290–1 280 см^–1, соответствующие валентным колебаниям нитрогруппы, что свидетельствует об успешной модификации поверхности нанотрубок.

Вольтамперометрическое определение антител вируса кори с использованием УНТ-Аза1. Предлагаемый алгоритм вольтамперометрического определения антител к вирусу кори включает ряд последовательных стадий (рис. 2). На первом этапе на поверхность стеклоуглеродного рабочего электрода наносили модифицированные Аза1 наноматериалы и высушивали при комнатной температуре. После этого рабочий электрод в течение 20 мин. инкубировали в суспензии антигена. Полученный таким образом модифицированный электрод далее инкубировали в анализируемой суспензии, после чего регистрировали вольтамперометрический отклик – ток пика электровосстановления иммобилизованного на электроде Аза1, величина которого обратно пропорциональна содержанию аналита (антител к вирусу кори) в пробе. Аналитическим сигналом служила разность токов пика до и после инкубирования I^*:

Рис. 2. Предлагаемый алгоритм вольтамперометрического определения антител к вирусу кори

$I^{*} = \frac{I^{0} - I}{I^{0}} \cdot 100 %$ , (1)

где I⁰ – ток пика электровосстановления Аза1, зарегистрированный на электроде до инкубации в анализируемой пробе; I – ток пика электровосстановления Аза1, зарегистрированный на модифицированном электроде после инкубации в анализируемой пробе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика модифицированного стеклоуглеродного электрода, оптимизация условий анализа. Электрохимическое поведение ряда производных азолоазинов, и, в частности, 2-пропаргилтио-6-нитро-7-гидрокси-4Н-1,2,4-триазоло-4,7-дигидро[5,1-с]-1,2,4-триазина (Аза1), подробно изучено нами ранее [17]. Электрохимическая активность данных соединений обусловлена электровосстановлением нитрогруппы в диапазоне от –0.4 до –0.6 В. Электрохимическое восстановление протекает с участием трех электронов и трех протонов с образованием соответствующего димера. Выраженный электрохимический отклик линеен в широком диапазоне концентраций и потому может быть использован в качестве аналитического сигнала при разработке электрохимических способов анализа и сенсоров на их основе табл. 1.

Таблица 1. Данные для исследования

Параметр	Начальный потенциал	Конечный потенциал	Шаг потенциала	Амплитуда модуляции	Частота
Значение	0 В	–1 В	–0.005 В	0.1 В	20 Гц

В выбранных условиях величина тока пика восстановления при переходе от ЛВА к ДИВ увеличивается в 1.15 раза, при переходе от ЛВА к КВВ – в 3.3 раза. Для дальнейшей регистрации электрохимического отклика Аза1 выбрали режим КВВ (рис. 3).

Рис. 3. Вольтамперограммы, зарегистрированные в различных режимах регистрации сигнала (линейная, квадратно-волновая, дифференциально-импульсная вольтамперометрия) на стеклоуглеродном электроде в присутствии 1 мМ Аза1 в водно-органическом растворе буферный раствор Бриттона–Робинсона–диметилсульфоксид (9:1), рН 5

В рамках нашего исследования получили гибридный наноразмерный модификатор состава – многостенные углеродные нанотрубки-Аза1 для последующей иммобилизации на его поверхности антигена вируса кори. На КВВ, зарегистрированных с использованием модифицированного полученным гибридным наноматериалом СУЭ (рис. 4), присутствует выраженный катодный пик в области потенциалов электровосстановления нитрогруппы, что указывает на эффективность проведенной иммобилизации.

Рис. 4. Квадратно-волновые вольтамперограммы, зарегистрированные на стеклоуглеродном электроде после модификации электрода УНТ-Аза1, фоновый электролит – буферный раствор Бриттона–Робинсона, pH 5

Поверхность модифицированных электродов характеризовали методом циклической вольтамперометрии (ЦВА) (рис. 5). Критерий Семерано, рассчитанный из логарифмической зависимости величины тока, зарегистрированного в системе ферри/ферроцианид-ионов, от скорости наложения потенциала (tgα = lgI / lgν) для СУЭ, СУЭ-УНТ, СУЭ-УНТ-Аза1 составил соответственно 0.47, 0.49, 0.47, что свидетельствует о диффузионной природе тока [12].

Рис. 5. Зависимости lg(I) = f(lgν) (а), I = f(ν^1/2) (б), циклические вольтамперограммы (в), зарегистрированные на стеклоуглеродном электроде, модифицированном УНТ и УНТ-Аза1, в растворе 10 мМ K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆], 0.1М KCl

Линейная зависимость тока пика от квадратного корня из скорости изменения потенциала (рис. 5б) типична для электрохимических процессов с диффузионным контролем переноса электрона [18], поэтому эффективную площадь поверхности модифицированного СУЭ оценивали с использованием K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆] в качестве окислительно-восстановительного индикатора и уравнение Рендлса–Шевчика для процессов, контролируемых диффузией [19]:

$I_{p} = π^{\frac{1}{2}} χ_{p} n^{\frac{3}{2}} F^{\frac{3}{2}} A c D^{\frac{1}{2}} {(R T)}^{- \frac{1}{2}} ν^{\frac{1}{2}}$ , (2)

где I_p – ток пика окисления, A; R – универсальная газовая постоянная, Дж/моль·K; T – температура, K; v – скорость сканирования потенциала, В/с; n – число электронов; F – константа Фарадея 96485 Кл/моль; A – эффективная площадь поверхности электрода, см²; с – концентрация, мМ; D – коэффициент диффузии, см²/с с учетом того, что для 1.0 мМ K₄[Fe(CN)]₆ в 0.1 M KCl n = 1 и D = 7.6×10^–6 см²/с при T = 298 K.

Модифицирование СУЭ УНТ приводит к увеличению эффективной площади электрода на 16.5% (5.33 и 6.39 мм²), что обусловлено высокой удельной поверхностью наноматериала. После иммобилизации Аза1 эффективная площадь поверхности уменьшилась на 25% (5.11 мм²), что свидетельствует о частичном блокировании поверхности электрода азолоазином.

Полученные модифицированные наноматериалы характеризуются стабильностью в течение 30 дней с изменением величины электрохимического отклика в период хранения не более чем на 10% (рис. 6).

Рис. 6. Диаграммы стабильности стеклоуглеродного электрода, модифицированного УНТ-Аза1 в течение 30 дней. Квадратно-волновой режим, фоновый электролит – буферный раствор Бриттона–Робинсона, pH 5

На рис. 7 приведены КВВ, зарегистрированные до и после инкубации модифицированного электрода в модельной суспензии антигена и антител вируса кори. Закономерное снижение токов катодных пиков указывает на эффективную иммобилизацию биорецептора, которая, вероятно, обусловлена формированием супрамолекулярного комплекса между иммобилизованным на электроде азолоазином и поверхностным белком антигена вируса кори гемагглютинином [17].

Рис. 7. Квадратно-волновые вольтамперограммы, зарегистрированные на СУЭ-УНТ-Аза1 до (1) и после инкубации в модельной суспензии антигена (10^–3 г/л) (2); антигена и антител к вирусу кори (5 МЕ/мл) (3), фоновый электролит буферный раствор Бриттона–Робинсона, pH 5

При выборе рабочих условий варьировали время инкубации модифицированного электрода в суспензии, температуру и pH рабочего раствора. Эффективность оценивали по степени связывания 0.1 мг/л антигена вируса кори.

Установили, что насыщение поверхности происходит при 15-минутном выдерживании модифицированного электрода в суспензии; при увеличении продолжительности контакта значительных изменений сигнала не наблюдали (рис. 8а), поэтому это время выбрали для дальнейших исследований. Варьирование температуры и рН среды показало, что наиболее эффективно реакция протекает при 36°C и pH 5 (рис. 8б, в).

Рис. 8. Выбор рабочих условий: времени инкубации СУЭ-УНТ-Аза1 в суспензии Аг_кори (а), температуры (б), рН буферного раствора (в), концентрации Аг_кори (г)

При выборе концентрации антигена (рис. 8г) установили, что I^* линейно зависит от концентрации в диапазоне 1×10^–7–5×10^–4 г/л, после чего происходит значительное увеличение степени блокирования поверхности. Для дальнейших исследований выбрали концентрацию 5×10^–4г/л.

Вольтамперометрическое определение антител вируса кори в модельных суспензиях. В выбранных условиях получили градуировочные зависимости I^* = f(–lgc_Aт кори) с использованием модифицированного УНТ-Аза1 электрода и тока пика электровосстановления нитрогруппы в качестве аналитического сигнала, а также модифицированного УНТ электрода с капельно нанесенным рецепторным слоем и детектированием аналитического сигнала по величине тока пика внешнего (диффузионно свободного) окислительно-восстановительного индикатора K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆].

В первом случае градуировочная зависимость линейна в диапазоне концентраций антител к вирусу кори 0.1–5.0 МE/мл (I^* (%) = =(17.4±0.7)lgс (МЕ/мл) + (29±2), R² = 0.9653, n = 5, P = 0.95), ПО = 0.17 МЕ/мл. Во втором случае линейный диапазон составляет 1.0–5.0 МЕ/мл, (I^*(%) = (50±4)lgс (МЕ/мл) + (16±7), R² = 0.951, n = 5, P = 0.95), ПО = 0.30 МЕ/мл.

^***

Таким образом, предложенный способ вольтамперометрического определения антител к вирусу кори с использованием оригинального производного азола позволяет расширить диапазон определяемых концентраций и снизить предел обнаружения по отношению к безметочному иммуносенсору с внешним редокс-индикатором.

Аналитические характеристики предложенного способа не уступают возможностям иммуноферментного анализа и позволяют определять антитела к вирусу кори в клинически значимом диапазоне 0.15–5.0 МЕ/мл.