Отправить статью по E-mail 
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ФЕКАЛИЙ ПО ДАННЫМ ПЦР-РВ: ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОММЕРЧЕСКИХ НАБОРОВ И ЛАБОРАТОРНЫХ ПРОТОКОЛОВ
- Авторы: Курносов А.С.1,2, Линде Н.Н.1,3, Молодцова П.А.1, Глазунова Е.В.1, Москаленко А.М.1, Шептулина А.Ф.4, Бодунова Н.А.5, Злобовская О.А.1
-
Учреждения:
- Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства
- Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
- Морозовская детская городская клиническая больница
- Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины Министерства здравоохранения Российской Федерации
- Московский клинический научный центр им. А.С. Логинова
- Выпуск: Том 59, № 6 (2025)
- Страницы: 1002-1021
- Раздел: МЕТОДЫ
- URL: https://bakhtiniada.ru/0026-8984/article/view/358233
- DOI: https://doi.org/10.7868/S3034555325060104
- ID: 358233
Цитировать
Открытый доступ
Доступ предоставлен
Только для подписчиков
Аннотация
Появление новых данных о связи состава кишечной микробиоты с различными заболеваниями человека вызывает все больший интерес к изучению микробиоты. Однако для надежной качественной и количественной оценки ее состава критически важен выбор метода выделения ДНК, существенно влияющий на достоверность и воспроизводимость получаемых результатов. В представленной работе проведен сравнительный анализ 12 методов выделения ДНК из 46 фекальных образцов: девяти коммерческих наборов и трех лабораторных протоколов. Оценена представленность таксонов, включая грамположительные (Lactobacillaceae, Coprococcus spp., Streptococcus sp., Clostridium leptum) и грамотрицательные бактерии (Enterobacteriaceae, Akkermansia muciniphila, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides fragilis). Эффективность выделения оценивали по выходу ДНК, выраженному в ГЭ/мкл (геном-эквивалент в мкл) элюата или ГЭ/г фекалий, а также по частоте потерь низкопредставленных таксонов. Показана кластеризация методов в зависимости от типа лизиса: механический лизис обеспечивает стабильный и высокий выход ДНК, особенно грамположительных бактерий; в то же время химический и энзиматический методы показали меньшую эффективность. Установлено, что тип лизиса и предварительная пробоподготовка цельных фекалий являются ключевыми факторами, влияющими на эффективность выделения ДНК и сохранность нативного таксономического профиля. Наилучшие результаты получены при использовании набора QIAamp® PowerFecal® Pro DNA Kit (“Qiagen”, США) и комбинации наборов AмплиТест УниПроб + AмплиТест РИБО-преп (ФГБУ “ЦСП” ФМБА России), которые превосходят другие методы по выходу ДНК. QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (“Qiagen”) продемонстрировал минимальные потери низкопредставленных видов. Полученные результаты могут быть использованы для стандартизации методик экстракции ДНК микробиоты кишечника и разработки отечественных протоколов выделения ДНК из фекальных образцов.
Об авторах
А. С. Курносов
Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства; Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
Email: ozlobovskaya@cspfmba.ru
Москва, Россия; Москва, Россия
Н. Н. Линде
Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства; Морозовская детская городская клиническая больница
Email: ozlobovskaya@cspfmba.ru
Москва, Россия; Москва, Россия
П. А. Молодцова
Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства
Email: ozlobovskaya@cspfmba.ru
Москва, Россия
Е. В. Глазунова
Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства
Email: ozlobovskaya@cspfmba.ru
Москва, Россия
А. М. Москаленко
Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства
Email: ozlobovskaya@cspfmba.ru
Москва, Россия
А. Ф. Шептулина
Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины Министерства здравоохранения Российской Федерации
Email: ozlobovskaya@cspfmba.ru
Москва, Россия
Н. А. Бодунова
Московский клинический научный центр им. А.С. Логинова
Автор, ответственный за переписку.
Email: ozlobovskaya@cspfmba.ru
Москва, Россия
О. А. Злобовская
Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства
Email: ozlobovskaya@cspfmba.ru
Москва, Россия
Список литературы
- Dore J., Ehrlich S.D., Levenez F., Roume H., Morabito C. and IHMS Consortium (2020) IHMS_SOP 06 V3: Standard operating procedure for fecal samples DNA extraction, Protocol Q. International Human Microbiome Standards.
- Dore J., Ehrlich S.D., Levenez F., Pelletier E., Alberti A., Bertrand L., Bork P., Costea P.I., Sunagawa S., Guarner F., Manichanh C., Santiago A., Zhao L., Shen J., Zhang C., Versalovic J., Luna R.A., Petrosino J., Yang H., Li S., Wang J., Allen-Verece, E. Gloor G., Singh B., IHMS Consortium (2015) IHMS_SOP 07 V2: Standard operating procedure for fecal samples DNA extraction, Protocol H. International Human Microbiome Standards.
- Chen C.C., Wu W.K., Chang C.M., Panyod S., Lu T.P., Liou J.M., Fang Y.J., Chuang E.Y., Wu M.S. (2020) Comparison of DNA stabilizers and storage conditions on preserving fecal microbiota profiles. J. Formos. Med. Assoc. 119, 1791–1798.
- Dore J., Ehrlich S., Levenez F., Pelletier E., Alberti A., Bertrand L., Bork P., Costea P.I., Sunagawa S., Guarner F., Manichanh C., Santiago A., Zhao L., Shen J., Zhang C., Versalovic J., Luna R.A., Petrosino J., Yang H., Li S., Wang J., Allen-Verece, E., Gloor G., Singh B., IHMS Consortium (2015) IHMS_SOP 07 V2: Standard operating procedure for fecal samples DNA extraction, Protocol H. International Human Microbiome Standards.
- Zhang B.W., Li M., Ma L.C., Wei F.W. (2006) A widely applicable protocol for DNA isolation from fecal samples. Biochem. Genet. 44, 494–503.
- Isokafantā H., Tomnikov N., Vanhatalo S., Munukka E., Huovinen P., Hakanea A.J., Kallonen T. (2024) High-throughput DNA extraction strategy for fecal microbiome studies. Microbiol. Spectr. 12, e02932–23.
- Yu Z., Morrison M. (2004) Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques. 36, 808–812.
- Galla G., Praeg N., Rzehak T., Sprecher E., Colla F., Seeber J., Illmer P., Hauffe H.C. (2024) Comparison of DNA extraction methods on different sample matrices within the same terrestrial ecosystem. Sci. Rep. 14, 8715.
- Yang F., Sun J., Luo H., Ren H., Zhou H., Lin Y., Han M., Chen B., Liao H., Brix S., Li J. (2020) Assessment of fecal DNA extraction protocols for metagenomic studies. GigaScience. 9, giaa071.
- Li X., Bosch-Tijhof C.J., Wei X., de Soet J.J., Crieland W., Loveren C.V., Deng D.M. (2020) Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. J. Int. Med. Res. 48, 300060529925594.
- Zhang C., Thakkar P.V., Powell S.E., Sharma P., Vennelaganti S., Betel D., Shah M.A. (2018) A comparison of homogenization vs. enzymatic lysis for microbiome profiling in clinical endoscopic biopsy tissue samples. Front. Microbiol. 9, 3246.
- Chapuis M.P., Benoit L., Galan M. (2023) Evaluation of 96-well high-throughput DNA extraction methods for 16S rRNA gene metalbarcoding. Mol. Ecol. Resour. 23, 1509–1525.
- Elwick K., Zeng X., King J., Budowle B., Hughes-Stamm S. (2018) Comparative tolerance of two massively parallel sequencing systems to common PCR inhibitors. Int. J. Legal. Med. 132, 983–995.
- Li S., Liu X., Li Z., Liu H., Hu D. (2023) Combination of direct boiling and glass beads increases the purity and accuracy of bacterial DNA extraction. Biotechnol. J. 18, e2300135.
- Mateos C., Nieves-Remacha M.J., Rincón J.A. (2019) Automated platforms for reaction self-optimization in flow. React. Chem. Eng. 4, 1536–1544.
- Gandhi H., Jain M., Gupta S., Singh A.K., Kumar A., Sohal J.S. (2023) Comparative evaluation of various in-house protocols on diagnostic performance for paratuberculosis IS900 PCR. Mol. Biol. Rep. 50(1), 943–947.
- Drapkina O.M., Ashniev G.A., Zlobovskaya O.A., Yafarova A.A., Dementeva E.V., Kaburova A.N., Meshkov I.O., Sheptulina A.F., Kiselev A.R., Kontsevaya A.V., Zhamalov L.M. (2022) Diversities in the gut microbial patterns in patients with atherosclerotic cardiovascular diseases and certain heart failure phenotypes. Biomedicines. 10, 2762.
- Ness T.E., Meiwes L., Kay A., Mejia R., Lange C., Farhat M., Mandalakas A., DiNardo A. (2023) Optimizing DNA extraction from pediatric stool for diagnosis of tuberculosis and use in next-generation sequencing applications. Microbiol. Spectr. 11, e02269–22.
- Ma Z.Y., Zhang X.M., Wang R., Wang M., Liu T., Tan Z.L. (2020) Effects of chemical and mechanical lysis on microbial DNA yield, integrity, and downstream amplicon sequencing of rumen bacteria and protozoa. Front. Microbiol. 11, 581227.
- Cozzolino A., Vergalito F., Tremonte P., Iorizzo M., Lombardi S.J., Sorrentino E., Luongo D., Coppola R., Di Marco R., Succi M. (2020) Preliminary evaluation of the safety and probiotic potential of Akkermansia muciniphila DSM 22959 in comparison with Lactobacillus rhamnosus GG. Microorganisms. 8, 189.
- Reunanen J., Kainulainen V., Huuskonen L., Ottman N., Belzer C., Huhtinen H., de Vos W.M., Satokari R. (2015) Akkermansia muciniphila adheres to enterocytes and strengthens the integrity of the epithelial cell layer. Appl. Environ. Microbiol. 81, 3655–3662.
- Fancy N., Kniffen D., Melvin M., Kazemian N., Sadeghi J., Letef C.A., D’Aloisio L., Copp A.G., Inaba R., Hans G., Jafaripour S. (2024) Fecal-adherent mucus is a non-invasive source of primary human MUC2 for structural and functional characterization in health and disease. J. Biol. Chem. 300, 105675.
- Sleytr U.B., Glauert A.M. (1976). Ultrastructure of the cell walls of two closely related clostridia that possess different regular arrays of surface subunits. J. Bacteriol. 126, 869–882.
- Ogata S., Hongo M. (1973). Bacterial lysis of Clostridium species I. Lysis of Clostridium species by univalent cation. J. Gen. Appl. Microbiol. 19, 251–261.
- Shi Z., Chen L., Li B., Zhu B., Lyu N. (2022) Comparative analysis of different fecal DNA extraction methods. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 38 (9), 3542–3550.
Дополнительные файлы
