Molecular Binding of Cycloxydim to Acetyl-CoA Carboxylase in Cultivated Soybeans and Weed Plants

P. D. Timkin; Тимкин П. Д.; A. A. Ivaniy; Иваний А. А.; M. P. Mikhaylova; Михайлова М. П.; U. E. Shtabnaya; Штабная У. Е.; A. E. Gretchenko; Гретченко А. Е.; Yu. O. Serebrennikova; Серебренникова Ю. О.; A. A. Penzin; Пензин А. А.

doi:10.31857/S0002188124100065

Molecular Binding of Cycloxydim to Acetyl-CoA Carboxylase in Cultivated Soybeans and Weed Plants

作者: Timkin P.D.¹, Ivaniy A.A.¹, Mikhaylova M.P.¹, Shtabnaya U.E.¹, Gretchenko A.E.¹, Serebrennikova Y.O.¹, Penzin A.A.¹
隶属关系:
1. Federal Scientific Center All-Russian Scientific Research Institute of Soybean
期: 编号 10 (2024)
页面: 50-56
栏目: Пестициды
URL: https://bakhtiniada.ru/0002-1881/article/view/271621
DOI: https://doi.org/10.31857/S0002188124100065
EDN: https://elibrary.ru/ANQIVC
ID: 271621

如何引用文章

全文:

详细
全文:
作者简介
参考
补充文件
统计

详细

Acetyl-CoA carboxylase (ACC) is one of the main enzymes that play a regulatory role in the biosynthesis of fatty acids in plants. Cyclodime is one of the herbicides that is an inhibitor of this enzyme. Some weedy cereal plants, such as common hedgehog (Echinochloa crus-galli L.) and annual bluegrass (Poa annua L.), are resistant to cycloxyme. Other types of grass weeds – blood-red dewdrop (Digitaria sanguinalis (L.) Scop.) and green bristle (Setaria viridis (L.) P. Beauv.), on the contrary, are susceptible to the herbicide. The molecular mechanisms underlying ACC resistance are poorly understood. The explanation of the mechanism of resistance probably lies in the structure of ACC in different species. The use of bioinformatics methods will help to understand the mechanisms of adaptation based on the molecular properties of the enzyme, which will contribute to the creation of new herbicides. The purpose of this work was to study the specifics of the binding of cycloxydime to the ACC enzyme for each of these weed species, including soy (Glycine max (L.) Merr.). For weeds E. crus-galli and P. annua revealed from 6 to 7 possible complexes with different ligand positions relative to the receptor, which could potentially explain the mechanism of resistance. At the same time, a low binding energy was determined for the cycloxydime complex with G. max (up to –7.31 kcal/mol), which demonstrates the presence of other resistance mechanisms in the culture.

关键词

acetyl-CoA carboxylase (ACC), cycloxydime, molecular docking, bioinformatics, soy Glycine max (L.) Merr.

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Ацетил-КоА карбоксилаза (ACC, EC6.4.1.2) представляет собой фермент, который выполняет регуляторную роль в биосинтезе жирных кислот и обнаружен в большинстве организмов, включая бактерии, грибы, растения, а также животных. ACC продуцирует малонил-КоА из бикарбоната, используемого в качестве источника карбоксильной группы, и аденозинтрифосфата (АТФ), который служит источником энергии [1].

Фермент ацетил-КоА карбоксилаза рассматривается как удобная мишень для гербицидов. Как сообщает база данных “The International Survey of Herbicide Resistant Weeds”, в природе встречаются сорные растения, имеющие устойчивость к циклоксидиму, и они также могут быть не чувствительными к другим гербицидам группы 1. Гербициды данной группы блокируют превращение ацетил-КоА в малонил-КоА путем ингибирования активности фермента ACC. Ингибирование синтеза жирных кислот нарушает выработку фосфолипидов, используемых для построения клеточных мембран [2]. При ингибировании ACC растение становится обесцвеченным и в конечном итоге подвергается некрозу и гибели [3].

Циклоксидим является ингибитором ацетил-КоА карбоксилазы и синтеза жирных кислот. Известно, что циклогександионовые гербициды биологически активны в очень низких концентрациях [4].

Согласно литературным источникам, циклоксидим токсичен для таких злаковых сорняков, как S. viridis, E. crus-galli, P. annua, D. sanguinalis [5–9]. Представленные сорные растения эндемичны для Дальнего востока и Амурской обл., в частности на полях с соей, где они наносят экономический ущерб сельскому хозяйству [10].

В предыдущих исследованиях с применением метода молекулярного докинга использовали экспериментальную трехмерную структуру ACC Saccharomyces cerevisiae и циклоксидима в форматах pdb [11]. За неимением структур ACC сои и нативных структур карбоксилазы других растений в предыдущей работе, точность результатов, полученных методом молекулярного докинга могла быть серьезно снижена. Создание и публикация AlphaFold и AlphaFold2 в свободный доступ дала возможность решить эту проблему [12]. Данная программа является самым современным инструментом, осуществляющим фолдинг белка (укладку белка, или процесс спонтанного сворачивания полипептидной цепи в уникальную нативную структуру) по первичной последовательности аминокислот. Использование белков, смоделированных в AlphaFold, сохраняет объективность исследования и повышает точность результатов в поставленном вопросе, поскольку в таком случае задействуются нативные аминокислотные последовательности белков.

Цель работы – изучение особенностей молекулярного взаимодействия циклоксидима с его мишенями у культурной сои и различных сорных растений, произрастающих в Амурской обл.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Для понимания особенностей молекулярного взаимодействия лиганда с его мишенью было проведено моделирование ACC сои и злаковых сорняков. Информация о трехмерной структуре ACC была взята из базы данных UniProt (https://www.uniprot.org/) в pdb-формате (protein data bank). Полученные трехмерные модели представляют собой результат прогноза нейронной сети на платформе Google Collab AlphaFold 2.0 [13]. Информация о структуре циклоксидима была взята из базы данных PubChem в sdf-формате. Прогноз молекулярных полостей ферментов происходил с использованием сервиса PrankWeb [14–16].

Полученные в PrankWeb координаты использовали в дальнейшем для корректного наложения gridbox (пространственной сетки, в которой происходит симуляция). Все мишени проходили стадию подготовки в программном обеспечение AutoDock 4.2 [17]. Молекулярный докинг (вычислительный метод предсказания взаимного положения, ориентации и конформаций 2-х молекул, образующих супрамолекулярный комплекс) проводили по стандартной процедуре. Затем импортировали лиганд (циклоксидим) в pdbqt-формате, полученный с использованием локального конвертера Open Babel из sdf-формата [18]. На лиганд был наложен заряд Гастейгера. Затем происходило центрование gridbox по координатам полостей, полученных в PrankWeb. Размер граней gridbox был равен 40×40×40 и представлял из себя куб. Длина граней составляла 0.375 А. Полученные результаты молекулярного моделирования в дальнейшем визуализировали в Discovery Studio [19].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Во всех белках были определены молекулярные полости и их координаты в трехмерном пространстве (табл. 1).

Таблица 1. Координаты центра лиганд-связывающего сайта

ID UniProtKB, вид сорняка	Координаты центра полости лиганд-связывающего сайта
ID UniProtKB, вид сорняка	x_cent	y_cent	z_cent
ID: A0A835B2W3, D. sanguinalis	–2.5844	1.7126	6.5734
ID: E5LBD5, E. crus-galli	–9.3405	–2.7000	0.6966
ID: P31531, G. max	0.0148	1.5562	–9.0593
ID: Q3V4F2, P. annua	–8.1163	5.1251	–3.8386
ID: A0A4U6SY93, S. viridis	–4.0009	–0.8368	5.2461

Точность спрогнозированных молекулярных карманов составила 0.7 (E. crus-galli), 1.2 (P. annua), 3.0 (S. viridis), 4.1 (D. sanguinalis) и 19.2 (G. max). Количество аминокислотных остатков, участвующих в образовании активного центра, варьировались от 5 (P. annua) до 12 (G. max). Для E. crus-galli число аминокислот, образующих молекулярную полость, равнялось 7, для S. viridis – 8 и D. sanguinalis – 10.

Моделирование молекулярного взаимодействия между ортологами ACC и циклоксидимом показало образование множества успешных комплексов с различной энергией связывания (табл. 2).

Таблица 2. Энергия связывания ACC с циклоксидимом для каждой конформации

ID UniProtKB, вид сорняка	Ранг конформации	Минимальная энергия связывания, ккал/моль)
ID: A0A835B2W3, D. sanguinalis	1	–6.79
	2	–6.59
	3	–6.15
ID: E5LBD5, E. crus-galli	1	–6.08
	2	–6.01
	3	–5.65
	4	–5.62
	5	–5.52
	6	–5.09
ID: P31531, G. max	1	–7.31
	2	–7.00
	3	–6.52
ID: Q3V4F2, P. annua	1	–4.25
	2	–4.17
	3	–3.95
	4	–3.75
	5	–3.60
	6	–3.35
	7	–3.17
ID: A0A4U6SY93, S. viridis	1	–6.89
	2	–6.40
	3	–5.85
	4	–5.74
	5	–5.58

Оценка связывания циклоксидима с ACC позволила провести подсчет всех комбинаций аминокислотных остатков, принимающих участие в связывании белка с лигандом, что важно для понимания особенностей работы фермента и поиска критически важных аминокислот (табл. 3).

Таблица 3. Комбинации аминокислотных остатков, участвующих в связывании фермента с циклоксидимом

D. sanguinalis	E. crus-galli ^*	G. max	P. annua*	S. viridis
Ala108, Tyr109, Arg112, Ile125, Leu127, Leu148, Ile153, Val159	Tyr86, Tyr90, Leu96, Arg112, Leu113, Ile115, Asn157, Ile159, Ile174, Trp243, Thr300, Ala303, Gln304, Leu307	Ala108, Tyr109, Arg112, Leu127, Leu133, Tyr142, Leu148, Ile153, Met154, Val159	Tyr90, Arg112, Leu113, Ile115, Asn157, Ile159, Trp243, Thr300, Ala303, Gln304, Leu307	Ala108, Tyr109, Arg112, Leu113, Ile125, Ile126, Leu127, Leu148, Ile153, Met154, Val159

* Для данных видов был слишком большой разброс в положении лиганд-связывающих аминокислотных остатков.

При визуализации полученных комплексов удалось отследить изменения в положениях лиганда относительно белка-мишени (рис. 1).

Рис. 1. Визуализация комплексов ACC с циклоксидимом для: (а) – D. sanguinalis, (б) – E. crus-galli, (в) – G. max, (г) – P. annua, (д) – S. viridis.

При приближении комплекса в трехмерной проекции, можно заметить лиганд, находящийся в молекулярной полости вместе с водородными связями, принимающих непосредственное участие в связывании (рис. 2).

Рис. 2. Визуализация ACC в комплексе с циклоксидимом для D. sanguinalis: (а) – в полном масштабе, (б) – увеличение.

Также были получены двухмерные изображения с интеракцией водородных и координационных связей между циклоксидимом и аминокислотными остатками, участвующими в связывании лиганда (рис. 3).

Рис. 3. Визуализация ACC с циклоксидимом в двухмерной проекции для: (a) – D. sanguinalis, (б) – E. crus-galli, (в) – G. max, (с) – P. annua, (д) – S. viridis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, найденные молекулярные полости были сопоставимы друг с другом по своей топологии и взаиморасположению, что объясняется высоким уровнем гомологии фермента. Этот феномен позволяет осуществлять объективное сравнение представленных комплексов. Количество конформаций белков у каждого вида значительно разнилось между собой. Значимым для дальнейших исследований является то, что комплексы G. max имели 3 конформации, в том числе с наименьшей минимальной энергией связывания, равной –7.31 ккал/моль, что указывало на образование стабильного комплекса. Несмотря на это культурная соя обладает устойчивостью к циклоксидиму по отношению к злаковым сорнякам в полевых условиях. У P. annua выявлено до 7-ми различных комплексов с самым высоким показателем энергии связывания до –4.25 ккал/моль, большое количество конформаций и разброс в позициях аминокислот демонстрируют нестабильное взаимодействие циклоксидима с ферментом, что, видимо, позволяет P. annua. иметь устойчивость к ингибиторам ацетил-КоА карбоксилазы подобного типа. Касательно остальных форм ACC найдено аналогичное повторение аминокислотных остатков, за исключением E. crus-galli, где также можно было наблюдать большое количество конформаций и разброс по положениям, что компенсировалось низкой энергией связывания: это дает возможность образовывать более стабильные связи с лигандом. Полученные данные молекулярного докинга представляют собой более релевантный результат и отличаются от предыдущих результатов использованием информации о трехмерной структуре нативных белков, а не моделей, основанных на структуре белка других организмов.