Culture Method and Regulation Mechanisms of Stages of C2C12 Cell Line Myogenesis

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

INTRODUCTION: C2C12 is an immortalized mouse myoblast cell line actively used as in vitro experimental models to study skeletal muscle metabolism in biomedical research. C2C12 cells can differentiate into myocytes under appropriate culture conditions. It is important to understand the specifics of each stage of myogenesis and its regulatory mechanisms for the targeted exposure and development of medical drugs, taking into account the mechanisms of pathogenesis of various diseases.

AIM: To describe the method of culturing С2С12 cell line and to study regulatory mechanisms of С2С12 cell line myogenesis.

MATERIALS AND METHODS: The study was conducted on C2C12 cell line. Differentiation of myoblasts was induced in the nutrient medium containing 2% horse serum. The differentiation stages were evaluated by studying the cells on the 1st, 4th and 7th days. Cells before differentiation were used as a comparison group. At each differentiation stage, the myoblast fusion index (IM) was evaluated with preliminary staining of the cells by Romanowsky–Giemsa method. The cell differentiation mechanism was evaluated by the level of myosin, a-actin, myogenic differentiation protein (MyoD), myogenin (MyoG) using Western blot method.

RESULTS: On the 1st day of C2C12 cells culturing, formation of myotubes was observed (IM = 0.15 ± 0.05), on the 4th day — fusion of myoblasts with the formation of binucleated cells accompanied by an increase in the amount of MyoD and α-actin protein (IM = 0.44 ± 0.14). By the 7th day of differentiation, the fusion of cells increased with the formation of myotubes containing more than two nuclei; the content of MyoD and α-actin did not differ from the control, and the amount of MyoG and myosin increased (IM = 0.77 ± 0.04).

CONCLUSION: The described method of culturing C2C12 cell line in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with a high glucose content (4500 mg/l), containing 2% horse serum, L-glutamine (4 mМ), 100 Un/ml and 100 µg/ml of penicillin and streptomycin, is suitable for the formation of muscle cells, where MyoD and MyoG participate in the regulation of the increase in the amount of specific muscle proteins — α-actin and myosin. 

About the authors

Mariya O. Isayeva

Ryazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: mia.poroshina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7237-1789
SPIN-code: 7833-7030

Assistant of the Department of Biological Chemistry

Russian Federation, Ryazan

Fidan Т. Gadzhiyeva

Ryazan State Medical University

Email: fidagadzhiieva2003@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-0676-0487
SPIN-code: 9074-2340

Student

Russian Federation, Ryazan

Yuliya V. Abalenikhina

Ryazan State Medical University

Email: abalenihina88@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0427-0967
SPIN-code: 4496-9027

MD, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor

Russian Federation, Ryazan

Aleksey V. Shchul’kin

Ryazan State Medical University

Email: alekseyshulkin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1688-0017
SPIN-code: 2754-1702

MD, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor

Russian Federation, Ryazan

Elena N. Yakusheva

Ryazan State Medical University

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6887-4888
SPIN-code: 2865-3080

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Ryazan

References

  1. Wonga CY, Al-Salamia H, Dassa CR. C2C12 cell model: its role in understanding of insulin resistance at the molecular level and pharmaceuticalт development at the preclinical stage. J Pharm Pharmacol. 2020;72(12):1667–93. doi: 10.1111/jphp.13359
  2. Mangnall D, Bruce C, Fraser RB. Insulin-stimulated glucose uptake in C2C12 myoblasts. Biochem Soc Trans. 1993;21(4):438s. doi: 10.1042/bst021438s
  3. Nedachi T, Kanzaki M. Regulation of glucose transporters by insulin and extracellular glucose in C2C12 myotubes. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006;291(4):E817–28. doi: 10.1152/ajpendo.00194.2006
  4. Ludolph DC, Konieczny SF. Transcription factor families: muscling in on the myogenic program. FASEB J. 1995;9(15):1595–604. doi: 10.1096/fasebj.9.15.8529839
  5. Davis RL, Weintraub H, Lassar AB. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 1987;51(6):987–1000. doi: 10.1016/0092-8674(87)90585-x
  6. Kopantseva EE, Belyavsky AV. Key regulators of skeletal myogenesis. Molecular Biology. 2016;50(2):195–222. (In Russ). doi: 10.7868/S0026898416010079
  7. Shishkin SS. Miostatin i nekotoryye drugiye biokhimicheskiye faktory, reguliruyushchiye rost myshechnykh tkaney u cheloveka i ryada vysshikh pozvonochnykh. Uspekhi Biologicheskoy Khimii. 2004;44:209–62. (In Russ).
  8. Sin J, Andres AM, Taylor DJR, et al. Mitophagy is required for mitochondrial biogenesis and myogenic differentiation of C2C12 myoblasts. Autophagy. 2016;12(2):369–80. doi: 10.1080/15548627.2015.1115172
  9. Ferri P, Barbieri E, Burattini S, et al. Expression and subcellular localization of myogenic regulatory factors during the differentiation of skeletal muscle C2C12 myoblasts. J Cell Biochem. 2009;108(6):1302–17. doi: 10.1002/jcb.22360
  10. Emelin AM, Buev DO, Slabikova AA, et al. Kolichestvennaya otsenka miogennoy differentsirovki kletochnoy linii C2C12 s ispol'zovaniem polietilenglikolya i induktsionnykh sred in vitro. Genes & Cells. 2019;14(S):87-87. (In Russ). doi: 10.23868/gc122609
  11. Sestili P, Barbieri E, Martinelli C, et al. Creatine supplementation prevents the inhibition of myogenic differentiation in oxidatively injured C2C12 murine myoblasts. Mol Nutr Food Res. 2009;53(9):1187–204. doi: 10.1002/mnfr.200800504
  12. Asfour HA, Allouh MZ, Said RS. Myogenic regulatory factors: The orchestrators of myogenesis after 30 years of discovery. Exp Biol Med (Maywood). 2018;243(2):118–28. doi: 10.1177/1535370217749494
  13. Lipton B, Schultz E. Developmental fate of skeletal musclesatellite cells. Science. 1979;205(4412):1292–4. doi: 10.1126/science.472747
  14. Partridge TA, Grounds M, Sloper JC. Evidence of fusionbetween host and donor myoblasts in skeletal muscle grafts. Nature. 1978;273(5660):306–8. doi: 10.1038/273306a0
  15. Mendell JR, Kissel JT, Amato AA, et al. Myoblast transfer in the treatment ofDuchenneʼs muscular dystrophy. N Engl J Med. 1995;333(13):832–8. doi: 10.1056/NEJM199509283331303
  16. Giordani L, Parisi A, Le Grand F. Satellite Cell Self‐Renewal. Curr Top Dev Biol. 2018;126:177–203. doi: 10.1016/bs.ctdb.2017.08.001
  17. Bouchentouf M, Benabdallah BF, Dumont M, et al. Real‐time imaging of myoblast transplantation using the human sodium iodide symporter. Biotechniques. 2005;38(6):937–42. doi: 10.2144/05386IT01
  18. Incitti T, Magli A, Darabi R, et al. Pluripotent stem cell‐derived myogenic progenitors remodel their molecular signature upon in vivo engraftment. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116(10):4346–51. doi: 10.1073/pnas.1808303116
  19. Patz TM, Doraiswamy A, Narayan RJ, et al. Two‐dimensional differential adherence and alignment ofC2C12 myoblasts. Materials Science and Engineering: B. 2005;123(3):242–7. doi: 10.1016/j.mseb.2005.08.088
  20. Calzia D, Ottaggio L, Cora A, et al. Characterization of C2C12 cells in simulated microgravity: Possible use for myoblast regeneration. J Cell Physiol. 2020;235(4):3508–18. doi: 10.1002/jcp.29239
  21. Kachesova AA, Shchurova EN, Sayfutdinov MS, et al. Functional Capaсities of Limb Muscles in Patients with Partial Damage to the Cervical Spinal Cord. I. P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2022;30(2):203–12. (In Russ). doi: 10.17816/PAVLOVJ96752

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. C2C12 cell line before differentiation and at different stages of differentiation. Phase-contrast microscopy, magnification x 200. Romanowsky–Giemsa stain of nuclei.

Download (75KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Myoblast fusion index depending on the day of С2С12 cell line differentiation.

Download (13KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Formation of multinucleate structures at different stages of C2C12 cell line differentiation. Romanowsky–Giemsa stain of nuclei. Phase-contrast microscopy, x 400 magnification.

Download (45KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Relative amounts of myosin, MyoD, MyoG and α-actin in C2C12 line cells before (1), at the early (2), middle (3) and late (4) differentiation stages.

Download (42KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Stages of myogenesis and participation of MyoD and MyoG transcription factors, adapted [12].

Download (19KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2023 Eco-Vector


 


Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».