Влияние сверхэкспрессии гена PDI на продукцию гетерологичных белков в дрожжах PICHIA PASTORIS

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Дрожжи Pichia pastoris используются для синтеза секреторных рекомбинантных белков. Одним из подходов к повышению продукции целевых белков является сверхэкспрессия генов-помощников, белковые продукты которых участвуют в процессе секреции. Задачей нашего исследования была оценка влияния сверхпродукции протеиндисульфидизомеразы (Pdi) дрожжей P. pastoris на продукцию рекомбинантных интерферонов. В ходе нашей работы получены штаммы дрожжей P. pastoris, экспрессирующие ген PpPDI под контролем промотора алкогольоксидазы-1 (AOX1). Показано влияние суперпродукции Pdi на жизнеспособность и скорость роста клеток, а также на продукцию гетерологичных белков - интерферона-альфа16 человека и интерферона-гамма курицы.

Об авторах

Михаил Александрович Цыганков

ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: mial.tsygankov@yandex.ru

инженер-исследователь, лаборатория биохимической генетики, кафедра генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Марина Владимировна Падкина

ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: mpadkina@mail.ru

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория биохимической генетики, кафедра генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Гаретова Л.А., Кириенко О.А. Оценка параметров роста микроорганизмов в условиях периодического и непрерывного культивирования. – Хабаровск: Изд-во Тихоокеан. гос. ун-та, 2010. – 16 с. [Garetova LA, Kirienko OA. Ocenka parametrov rosta mikroorganizmov v uslovijah periodicheskogo i nepreryvnogo kul’tivirovanija. Khabarovsk: Izd-vo Tihookean. gos. un-ta; 2010. 16 p. (In Russ.)]
  2. Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Лапина Т.В., Шишова М.Ф. Количественный анализ экспрессии генов / Под ред. Е.В. Ермиловой. – 2-е изд. – СПб.: ТЕССА, 2011. – 122 c. [Ermilova EV, Zaluckaja ZhM, Lapina TV, Shishova MF. Kolichestvennyj analiz jekspressii genov. Ed by E.V. Ermilovoj. 2nd ed. Saint Petersburg: TESSA; 2011. 122 p. (In Russ.)]
  3. Карабельский А.В., Зиновьева Ю.Г., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris — продуцентов химерных белков «альбумин-интерлейкин-2» и «альбумин-интерферон-α16» // Вестник Cанкт-Петербургского университета. – 2009. – Вып. 2. – Сер. 3. – C. 53–63. [Karabel’skij AV, Zinov’eva JuG, Smirnov MN, Padkina MV. Sozdanie shtammov drozhzhej Pichia pastoris producentov himernyh belkov “al’bumin-interlejkin-2” i “al’bumin-interferon-α16”. Vestnik Sankt-Peterburgskogo uni versiteta. 2009;2(3):53-63. (In Russ.)]
  4. Леонович О.А., Серкова Н.Н., Рабинович Я.М. Токсичность меркаптоэтанола для различных линий дрожжей Pichia methanolica, растущих на различных источниках углерода // Прикладная биохимия и микробиология. – 2001. – Т. 37. – № 1. – С. 96–99. [Leonovich SA, Serkova NN, Rabinovich IM. Toxicity of mercaptoethanol to mutant strains of the yeast Pichia methanolica growing on different carbon sources. Prikl Biokhim Mikrobiol. 2001;37(1):96-9. (In Russ.)]
  5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Ред. А.А. Баев, К.Г. Скрябин. – М.: Мир, 1984. – 480 с. [Maniatis T, Fritch EE, Sambrook J. Molecular Cloning: A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1982:545.]
  6. Манн – Уитни, автоматический расчет. Доступно по: http://www.psychol-ok.ru/statistics/mann-whitney/. Ссылка активна на 27.09.2016.
  7. Методика выделения ДНК, «Smash and Grab». Доступно по: http://web.mit.edu/biology/guarente/protocols/quickprep.html. Ссылка активна на 01.09.16.
  8. Мюльберг А.А. Фолдинг белка. – СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. – 176 с. [Mjul’berg AA. Folding belka. Saint Petersburg: Izd-vo S.-Peterb. un-ta; 2004. 176 p. (In Russ.)]
  9. Наровлянский А.Н., Ершов Ф.И, Гинцбург А.Л. Интерфероны: перспективные направления исследований // Иммунология. – 2013. – № 3. – C. 168–172. [Narovljanskij AN, Ershov FI, Gincburg AL. Interferony: perspektivnye napravlenija issledovanij. Immunologija. 2013;3:168-172. (In Russ.)]
  10. Падкина М.В., Парфёнова Л.В., Градобоева А.Е., Самбук Е.В. Синтез гетерологичных интерферонов в клетках дрожжей Pichia pastoris // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. – Т. 46. – № 4. – С. 448–455. [Padkina MV, Parfenova LV, Gradoboeva AE, Sambuk EV. Heterologous interferons synthesis in yeast Pichia pastoris. Applied Biochemistry and Microbiology. 2010;46(4):409-414. (In Russ.)]
  11. Патент РФ на изобретение № 2380405/ 2007. [Patent RUS No 2380405/ 2007. (In Russ.)]
  12. Ребриков Д.В. ПЦР в реальном времени. – 3-е изд. – М.: БИНОМ, 2011. – 223 c. [Rebrikov DV. PCR v real’nom vremeni. Moscow: BINOM; 2011. 223 p. (In Russ.)]
  13. Цыганков М.А., Зобнина А.Е., Падкина М.В. Синтез модифицированных, устойчивых к протеолитической деградации интерферонов-гамма в дрожжах Pichia pastoris // Прикладная биохимия и микробиология. – 2014. – Т. 50. – № 4. – С. 429–436. [Tsygankov MA, Zobnina AE, Padkina MV. Synthesis of recombinant gamma interferons resistant to proteolysis in the yeast Pichia pastoris. Applied Biochemistry and Microbiology. 2014;50(4):387-393. (In Russ.)]. doi: 10.7868/S055510991404028X.
  14. Шишкин С.С., Еремина Л.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А. AGR2, ERP57/GRP58 и некоторые другие протеин-дисульфидизомеразы человека // Успехи биологической химии. – 2013. – Т. 53. – С. 81–120. [Shishkin SS, Eremina LS, Kovalev LI, Kovaleva MA. AGR2, ERP57/GRP58 i nekotorye drugie protein-disul’fidizomerazy cheloveka. Uspehi biologicheskoj himii. 2013;53:81-120 (In Russ.)]
  15. Balamurugan V, Reddy GR, Suryanarayana VV. S. Pichia pastoris: A notable heterologous expression system for the production of foreign proteins — Vaccines. Indian Journal of Biotechnology. 2007;6:175-186.
  16. Borth N, Mattanovich D, Kunert R, Katinger H. Effect of increased expression of protein disulfide isomerase and heavy chain binding protein on antibody secretion in a recombinant CHO cell line. Biotechnol Prog. 2005 Jan-Feb;21(1):106-11. doi: 10.1021/bp0498241.
  17. Conn PM. The unfolded protein response and cellular stress. Methods Enzymol. 2011;489: xvii. doi: 10.1016/B978-0-12-385116-1.00020-0.
  18. Delic M, Valli M, Graf AB, et al. The secretory pathway: exploring yeast diversity. FEMS Microbiol Rev. 2013Nov;37(6):872-914. doi: 10.1111/1574-6976.12020.
  19. Farquhar R, Honey N, Murant SJ, et al. Protein disulfide isomerase is essential for viability in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 1991;108(1):81-9. doi: 10.1016/0378-1119(91)90490-3.
  20. Gasser B, Maurer M, Rautio J, et al. Monitoring of transcriptional regulation in Pichia pastoris under protein production conditions. BMC Genomics. 2007;19;8:179. doi: 10.1186/1471-2164-8-179.
  21. Gasser B, Saloheimo M, Rinas U, et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microbial Cell Factories. 2008;7:11. doi: 10.1186/1475-2859-7-11.
  22. Hsu TA, Watson S, Eiden JJ, Betenbaugh MJ. Rescue of immunoglobulins from insolubility is facilitated by PDI in the baculovirus expression system. Protein Expr Purif. 1996 May;7(3):281-8. doi: 10.1006/prep.1996.0040.
  23. Humphreys DP, Weir N, Lawson A, et al. Co-expression of human protein disulphide isomerase (PDI) can increase the yield of an antibody Fab’ fragment expressed in Esche richia coli. FEBS Lett. 1996Feb12;380(1-2):194-7. doi: 10.1016/0014-5793(96)00028-2.
  24. Kitchin K, Flickinger MC. Alteration of hybridoma viability and antibody secretion in transfectomas with inducible overexpression of protein disulfide isomerase. Biotechnol Prog. 1995Sep-Oct;11(5):565-74. doi: 10.1021/bp00035a011.
  25. Liu Z, Liu L, Osterlund T, et al. Improved production of a heterologous amylase in Saccharomyces cerevisiae by inverse metabolic engineering. Appl Environ Microbiol. 2014Sep;80(17):5542-50. doi: 10.1128/AEM.00712-14.
  26. Lodi T, Neglia B, Donnini C. Secretion of human serum albumin by Kluyveromyces lactis overexpressing KlPDI1 and KlERO1. Appl Environ Microbiol. 2005Aug;71(8):4359-4363. doi: 10.1128/AEM.71.8.4359-4363.2005.
  27. Lowenthal JW, Lambrecht B, van den Berg TP, et al. Avian cytokines — the natural approach to therapeutics. Dev Comp Immunol. 2000Mar-Apr;24(2-3):355-65. doi: 10.1016/s0145-305x(99)00083-x.
  28. Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 2005Mar;22(4):249-70. doi: 10.1002/yea.1208.
  29. Mattanovich D, Callewaert N, Rouze P, et al. Open access to sequence: browsing the Pichia pastoris genome. Microb Cell Fact. 2009Oct16;8:53. doi: 10.1186/1475-2859-8-53.
  30. Mukaiyama H, Tohda H, Takegawa K. Overexpression of protein disulfide isomerases enhances secretion of recombinant human transferrin in Schizosaccharomyces pombe. Appl Microbiol Biotechnol. 2010Apr;86(4): 1135-43. doi: 10.1007/s00253-009-2393-x.
  31. Norgaard P, Westphal V, Tachibana C, et al. Functional differences in yeast protein disulfide isomerases. J Cell Biol. 2001Feb5;152(3):553-562. doi: 10.1083/jcb.152.3.553.
  32. Ostermeier M, De Sutter K, Georgiou G. Eukaryotic protein disulfide isomerase complements Escherichia coli dsbA mutants and increases the yield of a heterologous secreted protein with disulfide bonds. J Biol Chem. 1996May3;271(18):10616-22.
  33. Pichia Technology from RCT. Available from: http://www.pichia.com/science-center/commercialized-products/. Accessed December 1, 2016.
  34. Radhakrishnan R, Walter LJ, Hruza A, et al. Zinc mediated dimer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography. Structure. 1996Dec15;4(12):1453-63. doi: 10.1016/s0969-2126(96)00152-9.
  35. The Saccharomyces Genome Database. Available from: http://www.yeastgenome.org/locus/S000000548/overview. Accessed September 1, 2016.
  36. Rand JD, Grant CM. The thioredoxin system protects ribosomes against stress-induced aggregation. Mol Biol Cell. 2006Jan;17(1):387-401. doi: 10.1091/mbc.e05-06-0520.
  37. Ryabova LA, Desplancq D, Spirin AS, Pluckthun A. Functional antibody production using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones. Nat Biotechnol. 1997Jan;15(1):79-84. doi: 10.1038/nbt0197-79.
  38. Uniprot No P05015. Available from: http://www.uniprot.org/uniprot/P05015. Accessed October 30, 2016.
  39. Uniprot No P49708. Available from: http://www.uniprot.org/uniprot/P49708. Accessed October 30, 2016.
  40. Warsame A, Vad R, Kristensen T, Oyen TB. Characterization of a gene encoding a Pichia pastoris protein disulfide isomerase. Biochem Biophys Res Commun. 2001Mar;281(5):1176-82. doi: 10.1006/bbrc.2001.4479.
  41. Winter AD, Cormack G, Page AP. Protein disulfide isomerase activity is essential for viability and extracellular matrix formation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 2007Aug15;308(2):449-61. doi: 10.1016/j.ydbio.2007.05.041.
  42. Wu S, Letchworth GJ. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol. BioTechniques. 2004 Jan;36(1):152-4.
  43. Zhang H, He J, Ji Y, et al. The effect of calnexin deletion on the expression level of PDI in Saccharomyces cerevisiae under heat stress conditions. Cell Mol Biol Lett. 2008;13(1):38-48. doi: 10.2478/s11658-007-0033-y.
  44. Zhu T, Guo M, Sun C, et al. A systematical investigation on the genetic stability of multi-copy Pichia pastoris strains. Biotechnol Lett. 2009May;31(5):679-84. doi: 10.1007/s10529-009-9917-4.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Цыганков М.А., Падкина М.В., 2017

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
 


Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».