Visualisation of GABAergic neurons and synapses in the rat brain using immunohistochemistry for two forms of glutamate decarboxylase

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

BACKGROUND: Taking into account the importance of GABAergic brain system research and also the opportunity to achieve specific and accurate results in laboratory studies using immunohistochemical approaches, it seems important to have a reliable method of visualization GABA-synthesizing cells, their projections and synapses, for the morphofunctional analysis of GABAergic system both in normal conditions and in the experimental pathology.

AIM: The aim of the study was to visualize analyze GABAergic neurons and synapses within rat’s brain using three different antibody types against glutamate decarboxylase and to identify the optimal conditions for reaction performing.

MATERIALS AND METHODS: The study was performed on paraffin brain tissue sections of 5 adult Wistar rats. Immunohistochemical reactions using three antibody types against glutamate decarboxylase isoform 67 (GAD67) and glutamate decarboxylase isoform 65 (GAD65) were performed. Additional controls on C57/Bl6 mice and Chinchilla rabbits brain samples were also carried out.

RESULTS: Antibodies used in the research made it possible to achieve high quality of GABAergic structures visualizing without increasing background staining. At the same time different antibody types are distinct in their efficacy to perform immunohistochemistry reaction on laboratory animal brain tissue samples. By performing additional controls, we discovered that there is necessary to adsorb secondary reagent’s immunoglobulins in order to eliminate nonspecific staining. It was found that GAD67 and GAD65 distribution in rat forebrain structures is different. It was stated that GAD67 immunohistochemistry most completely reveals GABAergic brain structures compared to GAD65 immunhistochemistry. The possibility of determining morphological features of GABAergic neurons and synaptic terminals, as well as performing quantitative analysis, was demonstrated.

CONCLUSIONS: The approach proposed makes it possible to specifically visualize GABAergic structures of the central nervous system of different laboratory animals. This could be useful both in fundamental studies and in pathology research.

About the authors

Valeria A. Razenkova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN-code: 8877-8902
Scopus Author ID: 57219609984
ResearcherId: AAH-1333-2021

Postgraduate student, Junior Researcher, Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

Russian Federation, Saint Petersburg

Dmitrii E. Korzhevskii

Institute of Experimental Medicine

Email: DEK2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-code: 3252-3029
Scopus Author ID: 12770589000

MD, PhD, DSc (Medicine), Professor of the RAS, Head of the Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

Russian Federation, Saint Petersburg

References

  1. Gerfen CR, Economo MN, Chandrashekar J. Long distance projections of cortical pyramidal neurons. J Neurosci Res. 2018;96(9):1467–1475. doi: 10.1002/jnr.23978
  2. Xu Q, Cobos I, De La Cruz E, et al. Origins of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 2004;24(11):2612–2622. doi: 10.1523/JNEUROSCI.5667-03.2004
  3. Kubota Y. Untangling GABAergic wiring in the cortical microcircuit. Curr Opin Neurobiol. 2014;26:7–14. doi: 10.1016/j.conb.2013.10.003
  4. Kimoto S, Bazmi HH, Lewis DA. Lower expression of glutamic acid decarboxylase 67 in the prefrontal cortex in schizophrenia: contribution of altered regulation by Zif268. Am J Psychiatry. 2014;171(9):969–978. doi: 10.1176/appi.ajp.2014.14010004
  5. LeWitt PA, Rezai AR, Leehey MA, et al. AAV2-GAD gene therapy for advanced Parkinson’s disease: a double-blind, sham-surgery controlled, randomised trial. Lancet Neurol. 2011;10(4):309–319. doi: 10.1016/S1474-4422(11)70039-4
  6. McQuail JA, Frazier CJ, Bizon JL. Molecular aspects of age-related cognitive decline: the role of GABA signaling. Trends Mol Med. 2015;21(7):450–460. doi: 10.1016/j.molmed.2015.05.002
  7. Seney ML, Tripp A, McCune S, et al. Laminar and cellular analyses of reduced somatostatin gene expression in the subgenual anterior cingulate cortex in major depression. Neurobiol Dis. 2015;73:213–219. doi: 10.1016/j.nbd.2014.10.005
  8. Duman RS, Sanacora G, Krystal JH. Altered connectivity in depression: GABA and glutamate neurotransmitter deficits and reversal by novel treatments. Neuron. 2019;102(1):75–90. doi: 10.1016/j.neuron.2019.03.013
  9. Silkis IG. Role of acetylcholine and GABAergic inhibitory transmission in seizure pattern generation in neural networks integrating the neocortex, hippocampus, basal ganglia, and thalamus. Neyrokhimiya. 2020;37(2):106–124. (In Russ.). doi: 10.31857/s1027813320020120
  10. Theoretical bases and practical applications of methods of immunohistochemistry. 2nd ed. Ed. by D.E. Korzhevskiy. Saint Petersburg; 2014. (In Russ.)
  11. Martin DL, Liu H, Martin SB, Wu SJ. Structural features and regulatory properties of the brain glutamate decarboxylases. Neurochem Int. 2000;37(2–3):111–119. doi: 10.1016/s0197-0186(00)00014-0
  12. Petroff OA. GABA and glutamate in the human brain. Neuroscientist. 2002;8(6):562–573. doi: 10.1177/1073858402238515
  13. Kaufman DL, Houser CR, Tobin AJ. Two forms of the gamma-aminobutyric acid synthetic enzyme glutamate decarboxylase have distinct intraneuronal distributions and cofactor interactions. J Neurochem. 1991;56(2):720–723. doi: 10.1111/j.1471-4159.1991.tb08211.x
  14. Pinal CS, Tobin AJ. Uniqueness and redundancy in GABA production. Perspect Dev Neurobiol. 1998;5(2–3):109–118.
  15. Saper CB. A guide to the perplexed on the specificity of antibodies. J Histochem Cytochem. 2009;57(1):1–5. doi: 10.1369/jhc.2008.952770
  16. Korzhevskii DE, Otellin VA, Grigor’ev IP, et al. Immunocytochemical detection of neuronal NO synthase in rat brain cells. Neurosci Behav Physiol. 2008;38(8):835–838. doi: 10.1007/s11055-008-9063-9
  17. Weller MG. Quality Issues of Research Antibodies. Anal Chem Insights. 2016;11:21–27. doi: 10.4137/ACI.S31614
  18. Bordeaux J, Welsh A, Agarwal S, et al. Antibody validation. Biotechniques. 2010;48(3):197–209. doi: 10.2144/000113382
  19. Kirik OV, Grigoriev IP, Sukhorukova EG, et al. Use of immunocytochemical methods to identify the boundaries between the subventricular zone of the telencephalon and the striatum. Neurosci Behav Physi. 2013;43(2):157–159. doi: 10.1007/s11055-013-9708-1
  20. Fritschy JM. Is my antibody-staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur J Neurosci. 2008;28(12): 2365–2370. doi: 10.1111/j.1460-9568.2008.06552.x
  21. Ward JM, Rehg JE. Rodent immunohistochemistry: pitfalls and troubleshooting. Vet Pathol. 2014;51(1):88–101. doi: 10.1177/0300985813503571
  22. Gown AM. Diagnostic immunohistochemistry: What can go wrong and how to prevent it. Arch Pathol Lab Med. 2016;140(9):893–898. doi: 10.5858/arpa.2016-0119-RA
  23. Korzhevskii DE, Sukhorukova EG, Kirik OV, Grigorev IP. Immunohistochemical demonstration of specific antigens in the human brain fixed in zinc-ethanol-formaldehyde. Eur J Histochem. 2015;59(3):5–9. doi: 10.4081/ejh.2015.2530
  24. Greif KF, Erlander MG, Tillakaratne NJ, Tobin AJ. Postnatal expression of glutamate decarboxylases in developing rat cerebellum. Neurochem Res. 1991;16(3):235–242. doi: 10.1007/BF00966086
  25. Martin DL, Rimvall K. Regulation of gamma-aminobutyric acid synthesis in the brain. J Neurochem. 1993;60(2):395–407. doi: 10.1111/j.1471-4159.1993.tb03165.x
  26. Muñoz-Manchado AB, Bengtsson Gonzales C, Zeisel A, et al. Diversity of interneurons in the dorsal striatum revealed by single-cell RNA sequencing and PatchSeq. Cell Rep. 2018;24(8):2179–2190.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2018.07.053
  27. Lim L, Mi D, Llorca A, Marín O. Development and functional diversification of cortical interneurons. Neuron. 2018;100(2):294–313. doi: 10.1016/j.neuron.2018.10.009
  28. Petilla Interneuron Nomenclature Group; Ascoli GA, Alonso-Nanclares L, Anderson SA, et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 2008;9(7):557–568. doi: 10.1038/nrn2402
  29. Feldmeyer D, Qi G, Emmenegger V, Staiger JF. Inhibitory interneurons and their circuit motifs in the many layers of the barrel cortex. Neuroscience. 2018;368:132–151. doi: 10.1016/j.neuroscience.2017.05.027
  30. Tremblay R, Lee S, Rudy B. GABAergic interneurons in the neocortex: From cellular properties to circuits. Neuron. 2016;91(2):260–292. doi: 10.1016/j.neuron.2016.06.033
  31. Zaitsev AV. Classification and functions of GABAergic interneurons of the mammalian new cortex. Biologicheskie membrany. 2013;30(4):253–270. (In Russ.). doi: 10.7868/S0233475513040099
  32. Markram H, Toledo-Rodriguez M, Wang Y, et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 2004;5(10):793–807. doi: 10.1038/nrn1519
  33. Wang J, Tian Y, Zeng LH, Xu H. Prefrontal disinhibition in social fear: A vital action of somatostatin interneurons. Front Cell Neurosci. 2020;14:611732. doi: 10.3389/fncel.2020.611732
  34. Guet-McCreight A, Skinner FK, Topolnik L. Common principles in functional organization of VIP/calretinin cell-driven disinhibitory circuits across cortical areas. Front Neural Circuits. 2020;14:32. doi: 10.3389/fncir.2020.00032
  35. Bereshpolova Y, Hei X, Alonso JM, Swadlow HA. Three rules govern thalamocortical connectivity of fast-spike inhibitory interneurons in the visual cortex. Elife. 2020;9:e60102. doi: 10.7554/eLife.60102
  36. Razenkova VA, Korzhevskii DE. GABAergic axosomatic synapses of rat cortical neurons. Tsitologiya. 2020;62(11):815–821. (In Russ.). doi: 10.31857/s0041377120110097
  37. Kolos EA, Korzhevskii DA. Heterogeneous choline acetyltransferase staining in cholinergic neurons. Neurochem J. 2016;10(1):47–52. doi: 10.1134/S1819712416010104
  38. Andrews WD, Barber M, Nemitz M, et al. Semaphorin3A-neuropilin1 signalling is involved in the generation of cortical interneurons. Brain Struct Funct. 2017;222(5):2217–2233. doi: 10.1007/s00429-016-1337-3

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. GABAergic terminals on cortical pyramidal neurons: a — Rat forebrain, GAD67 immunocytochemistry with rabbit polyclonal antibodies; b — Rabbit forebrain. GAD67 immunocytochemistry with mouse monoclonal antibodies. Ob. ×100. Arrows indicate GABAergic synapses, asterisk shows pyramidal neuron

Download (360KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. GAD distribution in rat forebrain structures. Frontal slices at –0.4 mm from Bregma: a — GAD67 distribution; b — GAD65 distribution; c — Scheme of forebrain structures. ДС — dorsal striatum (caudate nucleus and putamen), БШ — globus pallidus, Септ — septum

Download (322KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. GABAergic neurons in rat cortex: a — stellate cell; b — fusiform cell; c — triangle cell; d — oval cell; e — round cell. Ob. ×100

Download (373KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Quantitative analysis of GABAergic interneurons in rat cortex and striatum: а — Number of GABAergic neurons in different forebrain areas; b — GABAergic neurons area in diverse forebrain structures. * significant difference in parameters (p < 0.001)

Download (103KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2021 Razenkova V.A., Korzhevskii D.E.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».