Отправить статью по E-mail Апробация метода электрофоретического разделения и идентификации некоторых белков мочи у крыс при токсической нефропатии
- Авторы: Сивак К.В.1, Забродская Я.А.1,2,3, Добровольская О.А.1
-
Учреждения:
- ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева» Минздрава РФ
- ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики имени Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»
- ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»
- Выпуск: Том 19, № 3 (2019)
- Страницы: 71-82
- Раздел: Новые технологии
- URL: https://bakhtiniada.ru/MAJ/article/view/16301
- DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ19371-82
- ID: 16301
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель исследования. Целью настоящей работы была апробация метода определения некоторых белковых маркеров в моче крыс методом электрофоретического разделения с последующей масс-спектрометрической идентификацией для раннего выявления нефротоксичности. В задачи исследования входили оценка воспроизводимости метода разделения белков, сравнение белковых профилей мочи в норме и при введении гентамицина сульфата, а также биохимическое и морфологическое исследования биоптатов почек.
Материалы и методы. Гентамицина сульфат вводили крысам обоего пола внутримышечно в дозе 60 мг/кг в течение 5 дней. Суточную мочу собирали в день 0, на 3, 7 и 14-е сутки от начала введения гентамицина сульфата в обменных клетках. Измеряли концентрации общего белка и креатинина в пробах мочи, уровень липидов в гомогенатах почек. Электрофоретическое разделение белков мочи проводили в Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis. Гели окрашивали, а окрашенные зоны полиакриламидного геля вырезали и выполняли ферментативный гидролиз белков. Спектры триптических пептидов регистрировали на MALDI-TOF/TOF-масс-спектрометре ultrafleXtreme (Bruker, Германия). Белки идентифицировали в программе Biotools при обращении к базе данных Mascot (matrixscience.com).
Результаты. Оценка воспроизводимости результатов электрофоретического разделения белков мочи крыс показала приемлемую величину коэффициента вариации (в среднем 8,03 %) и погрешности анализа (Δанализа = 14,53 %). Было обнаружено, что в норме у крыс-самцов в моче доминирует предшественник альфа-2-уроглобулина, у самок преобладают легкие цепи иммуноглобулина G. На фоне введения гентамицина сульфата в моче у крыс обоих полов появляются лейкоциты в патологических концентрациях; у самцов протеомный профиль характеризуется сильной внутривидовой дисперсией, в том числе за счет спермальной контаминации; у самок наблюдаются хорошо идентифицируемые зоны альбумина, альфа-1-антитрипсина, аминопептидазы М, бета-2-микроглобулина, трансферрина. При биохимическом исследовании гомогенатов почек выявлено увеличение уровня общего холестерина (самцы) и триацилглицеридов (самки). Патоморфологические изменения были схожими у самцов и самок крыс в виде жировой дистрофии нефротелия проксимальных канальцев и лейкоцитарной инфильтрации интерстиция и подтверждали изменения в спектре белков мочи.
Заключение. На основании данных исследования было установлено, что технология электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующей MALDI-масс-спектрометрической идентификацией и денситометрическим определением доли белковых фракций применима для выявления нефротоксичности. Из-за половых различий в белковом спектре предпочтительно исследовать мочу крыс-самок.
Ключевые слова
Полный текст
Открыть статью на сайте журналаОб авторах
Константин Владимирович Сивак
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева» Минздрава РФ
Автор, ответственный за переписку.
Email: kvsivak@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4064-5033
SPIN-код: 7426-8322
Scopus Author ID: 35269910300
канд. биол. наук, заведующий отделом доклинических исследований
Россия, Санкт-ПетербургЯна Александровна Забродская
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева» Минздрава РФ; ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики имени Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»; ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»
Email: zabryaka@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2012-9461
канд. физ.-мат. наук, научный сотрудник отдела молекулярной биологии вирусов;
Россия, Санкт-ПетербургОльга Андреевна Добровольская
ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева» Минздрава РФ
Email: dobrovolskaya.od@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0857-4733
научный сотрудник лаборатории генной инженерии и экспрессии рекомбинантных белков
Россия, Санкт-ПетербургСписок литературы
- Slater MB, Gruneir A, Rochon PA, et al. Identifying high-risk medications associated with acute kidney injury in critically ill patients: a pharmacoepidemiologic evaluation. Paediatr Drugs. 2017;19(1):59-67. https://doi.org/10.1007/s40272-016-0205-1.
- Сивак К.В. Механизмы нефропатологии токсического генеза // Патогенез. – 2019. – Т. 17. – № 2. – С. 16–29. [Sivak KV. Mechanisms of toxic nephropathology. Pathogenesis. 2019;17(2):16-29. (In Russ.)]. https://doi.org/ 10.25557/2310-0435.2019.02.16-29.
- Magalhães P, Pontillo C, Pejchinovski M, et al. Comparison of urine and plasma peptidome indicates selectivity in renal peptide handling. Proteomics Clin Appl. 2018;12(5):e1700163. https://doi.org/10.1002/prca.201700163.
- Rus-LASA. Директива Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/EU от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. – СПб., 2012. – 48 с. [Rus-LASA. Directive of the European parliament and of the Council of the European Union 2010/63/EU for the protection of animals used for scientific purposes. Saint Petersburg; 2012. 48 р. (In Russ.)]
- Kimura J, Ichii O, Otsuka S, et al. Quantitative and qualitative urinary cellular patterns correlate with progression of murine glomerulonephritis. PLoS One. 2011;6(1):e16472. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016472.
- Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-685. https://doi.org/10.1038/ 227680a0.
- Antimonova OI, Lebedev DV, Zabrodskaya YA, et al. Changing times: fluorescence-lifetime analysis of amyloidogenic SF-IAPP fusion protein. J Struct Biol. 2019;205(1):78-83. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2018.11.006.
- Стандартные технологические процедуры при проведении патологоанатомических исследований: клинические рекомендации RPS1.1. 2016 / П.Г. Мальков, Г.А. Франк, М.А. Пальцев; Российское общество патологоанатомов. – М.: Практическая медицина, 2017. – 135 с. [Standartnyye tekhnologicheskiye protsedury pri provedenii patologoanatomicheskikh issledovaniy: klinicheskiye rekomendatsii RPS1.1. 2016. P.G. Malkov, G.A. Frank, M.A. Pal’tsev. Russian Society of Pathologists. Moscow: Practical medicine; 2017. 135 p. (In Russ.)]
- Lehman-McKeeman LD, Caudill D. Biochemical basis for mouse resistance to hyaline droplet nephropathy: lack of relevance of the alpha 2u-globulin protein superfamily in this male rat-specific syndrome. Toxicol Appl Pharmacol. 1992;112(2):214-221. https://doi.org/10.1016/0041-008X(92)90190-4.
- Lehman-McKeeman LD, Caudill D. d-Limonene induced hyaline droplet nephropathy in alpha 2u-globulin transgenic mice. Fundam Appl Toxicol. 1994;23(4):562-568. https://doi.org/10.1006/faat.1994.1141.
- Ланда С.Б., Аль-Шукри С.Х., Горбачев М.И., и др. Патохимические особенности олигомерных форм белка Тамма – Хорсфалла при уролитиазе // Клиническая лабораторная диагностика. – 2016. – Т. 61. – № 6. – С. 335–341. [Landa SB, Al-Shukri SH, Gorbachev MI, et al. The pathochemical characteristics of oligomeric forms of Tamm-Horsfall protein under urolithiasis. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. 2016;61(6):335-341. (In Russ.)]. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2016-6-335-341.
- Saunders DA, Begg EJ, Kirkpatrick CM, et al. Measurement of total phospholipids in urine of patients treated with gentamicin. Br J Clin Pharmacol. 1997;43(4):435-440. https://doi.org/10.1046/j.1365-2125.1997.00568.x.
Дополнительные файлы
