Induction of the PERK-eIF2𝛼-ATF4 pathway in M1 macrophages under endoplasmic reticulum stress

Full Text

Список сокращений

РИБ-II – рибосом-инактивирующие белки II типа; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; UPR – unfolded protein response; RSR – ribotoxic stress response; ERAD – ER-associated degradation; ОТ-кПЦР – количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; ФТ – фактор транскрипции.

Вискумин – это растительный лектин, выделенный из омелы белой (Viscum album). Вискумин относится к семейству белков РИБ-II. Еще одним представителем этого семейства является чрезвычайно токсичный белок рицин [1, 2, 3]. Белки РИБ-II – это гетеродимерные гликопротеины, состоящие из двух субъединиц: A (active) и B (binding), связанных дисульфидной связью [4]. А-цепь обладает каталитической активностью и гидролизует N-гликозидную связь аденозина в положении А4324 𝛼-сарцин-рициновой петли 28S рРНК 60S субъединицы эукариотических рибосом [5, 6, 7]. Эта депуринизация приводит к блокировке связывания фактора элонгации EF-2 с рибосомой, вследствие чего останавливается синтез белка в клетке. Необратимое повреждение рибосом активирует специфический сигнальный путь (ribotoxic stress response, RSR), что в конечном итоге приводит к апоптозу или аутофагии. В-цепь – лектин, который обеспечивает связывание со специфическими клеточными рецепторами [8].

Клиническое применение вискумина (Mistletoe lectin 1) имеет вековую историю [9, 10], однако механизм его терапевтического действия остается неясным. Рассматриваются его противоопухолевые и противовоспалительные эффекты [11, 12]. Семейство РИБ-II насчитывает более десятка белков. Наиболее изученным является рицин. Было показано, что рицин вызывает стресс ЭПР, причем это играет важную роль в реакции клетки на воздействие токсина [13]. Стресс ЭПР возникает в ответ на накопление несвернутых белков в люмене и активирует путь UPR (Unfolded Protein Response). Это изменяет транскрипционные и трансляционные программы клетки, чтобы справиться со стрессовыми условиями [14]. В частности, UPR запускает механизм деградации неправильно свернутых белков в протеасоме (ERAD, ER-associated degradation) и активирует экспрессию шаперонов в ЭПР. В случае, если восстановить жизнеспособность не удается, UPR индуцирует апоптоз. Существует три основных сигнальных каскада UPR, которые инициируются тремя белковыми сенсорами, локализованными в ЭПР: IRE1a, PERK и ATF6 [15]. В физиологических условиях все три сенсора находятся в неактивном состоянии, поскольку связаны с шапероном BiP (HSPA5/GRP78). Этот белок в условиях стресса ЭПР связывается с несвернутыми белками, что приводит к его высвобождению из комплекса с сенсорами и активации сенсоров. Ранее было показано, что обработка клеток рицином активирует только путь, опосредованный IRE1a [13].

В качестве модели изучения стресса ЭПР использовали провоспалительные М1 макрофаги, полученные из клеточной линии THP-1, поскольку макрофаги играют значимую роль в иммунном ответе, являясь основными индукторами воспаления. М1 макрофаги обрабатывали вискумином в диапазоне концентраций от 0.1 до 100 нМ. Цитотоксическое действие вискумина оценивали с помощью метода МТТ. Показано, что 50%-ное ингибирование жизнеспособности (IC50) достигается при концентрации вискумина 4.5 нМ (рис. 1). Небольшое увеличение жизнеспособности клеток при низких концентрациях вискумина может быть связано с тем, что при низких концентрациях он действует как митоген [16]. Чувствительность макрофагов к вискумину оказалась примерно в 1000 раз выше, чем у клеток колоректальной аденокарциномы Сасо-2 [17].

 

Рис. 1. Кривая жизнеспособности макрофагов М1 при обработке клеток вискумином. Точки на графике представляют среднее значение жизнеспособности по трем биологическим повторам. В качестве планок погрешностей использовали стандартную ошибку среднего. Макрофаги М1, полученные из клеточной линии ТНР-1, обрабатывали указанными концентрациями вискумина в течение 6 ч с последующей отмывкой и 24-ч инкубацией в культуральной среде.

 

Оценку доли рибосом, инактивированных вискумином, проводили как описано ранее [17]. Вкратце, суть подхода состоит в том, что ревертаза в ходе обратной транскрипции напротив образовавшегося в результате действия токсина AP-сайта встраивает дезоксиаденин. Поэтому синтезированные на интактной и поврежденной матрицах фрагменты кДНК будут отличаться одним нуклеотидом (А вместо Т), что можно детектировать с помощью ПЦР. Обнаружено дозозависимое увеличение количества апуриновых сайтов в 28S рРНК (табл. 1).

 

Таблица 1. Доля апуринизированных молекул в пуле 28S рРНК при обработке макрофагов М1 разными концентрациями вискумина в течение 6 ч и последующей инкубацией в среде без вискумина в течение 24 ч. Эксперимент выполнен в трех биологических повторах.

Концентрация вискумина, нМ	Доля модифицированных 28S рРНК, %
0 (Контроль)	0 ± 0.00
0.1	0.1 ± 0.01
1	1.2 ± 0.3
10	3.8 ± 0.5
100	6.4 ± 0.6

 

Доля модифицированных рибосом в клетках М1 макрофагов после обработки вискумином в концентрации 100 нМ, приводящей к 85% ингибированию жизнеспособности, составила всего 6.45% (рис. 1, табл. 1). Интересно, что, как показано нами ранее, у клеток Сасо-2 при инактивации даже 20% рибосом жизнеспособность не снижается [17]. Эти данные в сочетании с повышенной чувствительностью макрофагов к вискумину позволяют предположить, что цитотоксическое действие вискумина на М1 макрофаги опосредовано не только остановкой трансляции.

С помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) оценили уровни экспрессии генов стресса ЭПР: PERK, IRE1a, DDIT3, ATF4 и ATF6 [18, 19]. При высоких концентрациях вискумина детектировали статистически значимое увеличение экспрессии всех маркерных генов (рис. 2).

 

Рис. 2. Оценка индукции стресса ЭПР методом ОТ-кПЦР. Изменение экспрессии log2(FC) в обработанных вискумином макрофагах М1 в диапазоне концентраций 0.1 – 100 нМ оценивали относительно контрольных необработанных макрофагов М1 по методу ΔΔCt [20]. Статистическую значимость оценивали с помощью t-теста Стьюдента с поправкой на множественность методом Бенджамини-Хохберга (** – p-adjusted < 0.005, * – p-adjusted < 0.05). В качестве референсных генов использовали ACTB, GAPDH. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего по трем биологическим повторам. Поляризованные макрофаги М1 обрабатывали указанными концентрациями вискумина в течение 6 ч с последующей инкубацией в среде без вискумина в течение 24 ч.

 

Для анализа путей, активируемых во время стресса, провели высокопроизводительное секвенирование на платформе Illumina. Стандартный биоинформатический анализ включал оценку контроля качества, обрезку адаптеров, картирование на геном человека и оценку дифференциальной экспрессии. Секвенируемые образцы обрабатывали вискумином в концентрации 1 нМ (концентрация, при которой > 50% клеток сохраняют жизнеспособность) в течение 6 ч с последующей инкубацией в среде без вискумина в течение 24 ч. Анализ транскриптома показал, что в результате 742 гена значительно изменили свою экспрессию (FC > 1.5, FDR p-value < 0.05): экспрессия 552 генов была повышена и 190 генов понижена. Значительная часть генов с повышенной экспрессией вовлечена в воспалительные пути, включая NF-кB путь.

Экспрессия генов, активируемых PERK: ATF4 и DDIT3 (рис. 3), увеличилась в 2.6 и 2.2 раза соответственно, что согласуется с результатами ОТ-кПЦР (рис. 2), а экспрессия PERK, ATF6 и IRE1a значимо не изменилась.

 

Рис. 3. Схема сигнального пути UPR, индуцируемого стрессом ЭПР. Показаны три каскада UPR, активируемые сенсорами PERK, IRE1a и ATF6.

 

Для всех факторов транскрипции (ФТ) проанализировали изменение экспрессии их генов-мишеней с помощью гипергеометрического теста. В табл. 2 представлены ФТ, активирующие наибольшее число генов-мишеней. Видно, что из трех каскадов UPR активировался только путь PERK-ATF4 (рис. 3, табл. 2).

 

Таблица 2. ФТ, активирующие наибольшее число мишеней

ФТ	Число мишеней	Отношение шансов	FDR
RELA	158	8.22	0.5e-8
NFKB1	150	8.48	0.5e-8
JUN	64	9.84	0.002
HIF1A	43	9.91	0.005
STAT1	36	10.7	0.004
CEBPB	27	19.1	0.0003
ATF4	21	17.1	0.003

 

В число генов-мишеней ATF4 с повышенной экспрессией вошли DDIT3 (FC = 2.1, padj = 4e-11), участвующий в пути, который активирует сенсор PERK, а также CEBPB (FC = 1.8, padj = 3e-4), ATF3 (FC = 2, padj = 1.6e-39), CXCL8 (FC = 4, padj = 6.7e-26), PPP1P15A/GADD34 (FC = 3.7, padj = 3.2e-125) и SIRT1 (FC = 1.6, padj = 1.9e-20), которые активируют воспалительный ответ и апоптоз. Экспрессия ФТ, опосредующих клеточный ответ при активации двух других сенсоров стресса ЭПР – ATF6 и XBP1, а также экспрессия их генов-мишеней значимо не изменилась. Это может свидетельствовать о преимущественном вкладе пути PERK-eIF2𝛼-ATF4 в активацию механизмов ответа макрофагов М1 на обработку вискумином.

Таким образом, М1 макрофаги обладают высокой чувствительностью к вискумину, которая, вероятно, обусловлена не только стрессом, вызванным повреждением рибосом (RSR). Обработка вискумином приводила к активации стресса ЭПР. Из трех ветвей UPR, активируемых сенсорами стресса ЭПР, наиболее значимым оказался путь PERK-eIF2𝛼-ATF4. Это может свидетельствовать о важности сенсора PERK в активации ответа М1 макрофагов на воздействие вискумина. Интересно, что ранее для близкого, но более токсичного белка рицина было показано, что он активирует путь, запускаемый сенсором IRE1a, тогда как путь PERK-eIF2𝛼-ATF4 не активируется [13]. Активация рицином и вискумином разных путей ответа на стресс ЭПР может вносить вклад в их разную цитотоксичность.

Источник финансирования

Исследование проводилось в рамках проекта “Создание экспериментальных научно-исследовательских лабораторий по естественно-научным направлениям” и программы фундаментальных исследований НИУ ВШЭ.

Соблюдение этических норм и стандартов

Работа выполнена на клеточной линии моноцитов человека ТНР-1 (приобретена от АТСС), дифференцированной в провоспалительные макрофаги М1. В исследовании отсутствовало изучение человека и животных.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что не имеют конфликта интересов.

About the authors

O. E. Kolodeeva

Faculty of Biology and Biotechnology, HSE University

Author for correspondence.
Email: oekolodeeva@hse.ru
Russian Federation, Moscow

D. A. Averinskaya

Faculty of Biology and Biotechnology, HSE University

Email: oekolodeeva@hse.ru
Russian Federation, Moscow

Yu. А. Makarova

Faculty of Biology and Biotechnology, HSE University; Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: oekolodeeva@hse.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files