Homeotic DUX4 genes shape dynamic inter-chromosomal contacts with nucleoli in human cells

Full Text

К настоящему времени накапливаются данные о важной роли ядрышек в процессах, не связанных с синтезом рРНК и биогенезом рибосом. Ядрышки вовлечены в глобальные механизмы регуляции экспрессии генов, в репарацию разрывов в ДНК, в клеточные ответы на стрессы и в другие процессы [1–5]. Ядрышки образуют меж-хромосомные контакты с генами, контролирующими дифференцировку и канцерогенез [6, 7]. Предполагается, что вокруг ядрышек формируются микро-конденсаты, содержащие репрессоры или активаторы транскрипции, и что гены из разных областей генома, попадая в такие микрокапли, совместно активируются либо репрессируются [2, 3, 8].

Гены DUX4 кодируют фактор транскрипции, содержащий двойной гомеодомен. Они образуют частые контакты с генами рРНК [9]. Это было обнаружено с помощью метода 4C (Circular Chromosome Conformation Capture) на популяции клеток. С помощью данного метода было найдено, что после теплового шока контакты почти полностью пропадают [9]. Метод 4С, как и другие ligation-mediated подходы, способен заметить только близкие контакты между петлями хроматина в ядрах. Для того чтобы независимо подтвердить наличие и выявить частоту контактов генов DUX4 с кластерами генов рРНК в отдельных клетках и выяснить, как далеко при тепловом стрессе уходят эти гены от ядрышек, мы использовали метод FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). В результате впервые на отдельных клетках линии HEK293T было обнаружено, что гены DUX4 образуют стабильные контакты с ядрышками во всех исследованных клетках, а при тепловом шоке гены DUX4 удаляются от ядрышек на 1-3 микрометра. Такое удаление соответствует примерно 150 kb ДНК, упакованной в 30 nm фибрилле хроматина [8, 10], что критично для метода 4С. Следовательно, меж-хромосомные контакты, образуемые ядрышками, прочны, динамичны и обратимы. Мы предполагаем, что их стабильность важна для поддержания состояния дифференцировки.

Для экспериментов FISH использовали Alexa-3-меченый клонированный фрагмент гена рРНК [11]. Фрагмент ДНК длиной около 5.5 kb из chr4 человека, расположенный на расстоянии около 7 kb от кластера генов DUX в субтеломерном районе данной хромосомы (рис. 1) наработали с помощью long PCR и метили Alexa-5. Эксперименты проводили на клетках HEK293T. Тепловой шок проводили в течение 30 минут при 43^°С, с последующим восстановлением клеток в течение 2,5 часов в инкубаторе при 37°С и 5% CO₂. Гибридизацию проводили, как описано ранее [12]. Препараты анализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5. Анализ изображений проводили с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health, США) [https://imagej.net/software/fiji/]. Степень ко-локализации определяли с помощью инструмента оценки ко-локализации сигналов флуоресценции JACoP, (Just Another Co-localization Plugin) [13]. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA v10 (StatSoft, США). Сравнение 2 выборок осуществляли с помощью дисперсионного анализа. Для оценки значимости различий двух групп использовали метод χ2 Пирсона.

Рис. 1. Физическая карта субтеломерной области chr4 и места контактов генов рРНК, выявленные с помощью метода 4С в линии клеток HEK293T (координаты в геномном браузере IGB приведены для версии генома человека hg19). Синим показаны места контактов генов рРНК. Зеленым указаны гены DUX. Красный прямоугольник указывает область ДНК длиной 5511 bp, которая была наработана с помощью long PCR и использована для FISH.

На рис. 2 представлены результаты FISH. Оказалось, что имеется около 10 фокусов гибридизации DUX, что было ожидаемым, т.к. амплифицированный фрагмент является повтором, связанным с генами DUX, и по данным BLAST – Genome (GRCh38.p14 reference assembly RS_2023_10) представлен в хромосомах 3, 4, 10, 12–15, 21, 22, и в нескольких еще нелокализованных областях генома человека. Известно, что в хромосомах 4 и 10 в кластере генов DUX имеется от 8 до 100 копий [14, 15]. Видно, что имеются гены DUX, которые расположены вокруг ядрышка (рис. 2а). Кластеры генов рРНК в клетках HEK293T представлены в виде одного ядрышка. Профили сигналов DUX и rDNA позволили выявить, что в исходных клетках гены DUX расположены непосредственно по краям области ядрышка (рис. 2в). После теплового шока они немного – до 2.5 μm – удаляются от ядрышка (рис. 2г).

Рис. 2. Результаты FISH. a – эксперименты с исходными клетками. б – эксперименты с клетками после теплового шока. Белым показана ось при сканировании сигналов флюоресценции, проходящая через центр ядрышек. в – профиль сканирования ядра без теплового шока. г – профиль сканирования ядра после теплового шока. Сигнал DUX (Alexa-5) показан красным, а сигнал rDNA (Alexa-3)– зеленым. По горизонтали показаны расстояния в мкм.

Мы наблюдали контакты генов DUX c ядрышками во всех исследованных таким образом клетках. Меж-хромосомные контакты генов DUX с генами рРНК исходно были обнаружены с помощью метода 4С на популяции клеток [6, 9, 16]. В настоящей работе с помощью FISH на отдельных клетках выявлено, что эти контакты характерны для всех клеток. Кроме того, удалось выявить достоверные изменения характера контактов после теплового шока. Оказалось, что этот стресс вызывает диссоциацию контактов – небольшое удаление хроматиновых петель разных хромосом от ядрышек. Клетки после шести часов восстанавливают прежний характер контактов (не показано). Следовательно, диссоциация обратима и что-то еще удерживает удаленные на 2.5 μm петли хроматина из разных хромосом близко около ядрышек.

Использование программы ImageJ позволило оценить число близких контактов генов DUX4 с ядрышками. Оказалось, что в среднем около двух таких контактов приходится на ядрышко в исходных клетках, тогда как после теплового шока в четыре раза меньше – один контакт на два ядрышка (рис. 3а). По данным 4С, наибольшее число контактов генов рРНК с генами DUX4 приходится на субтеломерные районы хромосом 4 и 10. Поэтому мы считаем, что два наиболее стабильных контакта должны соответствовать данным районам. Это согласуется и с данными, представленными на рис. 2.

Рис. 3. Диаграммы, показывающие число фокусов гибридизации зонда DUX, приходящееся на одно ядро в исходных клетках и в клетках после теплового шока (a) и % фокусов гибридизации пробы DUX в ядрах по мере удаления от центра ядрышка (б). HS – – эксперименты с исходными клетками. HS+ – эксперименты с клетками после теплового шока. Для анализа использовали по 100 клеток. p-value < 0.05.

Интересные данные были получены при анализе доли фокусов гибридизации генов DUX по мере удаления от границ ядрышек в исходных клетках и в клетках после теплового шока. Доли генов DUX на расстоянии 1–3 мкм от ядрышек резко уменьшаются. При удалении более чем на 3 мкм доли генов DUX в экспериментах с тепловым шоком и без него уменьшаются, но уже мало отличаются друг от друга. Т.е. изменения в ядрышках при тепловом шоке не влияют на копии генов DUX, расположенные на расстоянии более 4 мкм. Это независимо подтверждает вывод о том, что меж-хромосомные контакты генов DUX с ядрышками довольно близки (см. рис. 2в) и их число резко уменьшается на удалении уже в 2 мкм от ядрышка (рис. 3б). Таким образом, при тепловом шоке удерживающее влияние ядрышек на петли хроматина на удалении более 4 мкм не распространяется.

Пока неизвестны механизмы образования меж-хромосомных контактов, в которые вовлечены гены, контролирующие дифференцировку и рак [6]. В разных типах клеток человека в местах таких контактов обнаружены метки неактивного хроматина H3K27me3 в генах, контролирующих морфогенез [17]. Эти метки характерны для эпигенетического сайленсинга. Известно, что гены DUX подвергаются сайленсингу в раннем развитии уже на стадии двух бластомеров [18].

Обнаружено, что местам частых контактов генов рРНК в многочисленных областях генома человека соответствуют протяженные (до 50 kb) области хроматина, содержащие метки активного хроматина H3K27ac [2, 6]. Такие области соответствуют супер-энхансерам [19]. Недавно было обнаружено, что области супер-энхансеров формируют микроконденсаты путем образования разделения жидких фаз в ядре (liquid-liquid phase separation) [20] и что большие группы генов, контролирующих дифференцировку и контактирующих с ядрышками, ко-экспрессируются в разных комбинациях [8]. Таким образом, имеющиеся к настоящему времени данные позволяют предполагать, что наборы факторов транскрипции в составе микроконденсатов, которые образуются вокруг ядрышка, обеспечивают ко-экспрессию больших групп генов, которые образуют меж-хромосомные контакты с кластерами генов рРНК. В настоящее время мы проверяем эти предположения экспериментально.

Источник финансирования

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема №124032100001-4).

Соблюдение этических норм и стандартов

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием человека и животных в качестве объектов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

Е. S. Klushevskaya

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow

I. R. Alembekov

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow

Yu. V. Kravatsky

Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow

N. А. Tchurikov

Author for correspondence.
Email: tchurikov@eimb.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. A physical map of the subtelomeric region of chr4 and the contact points of rRNA genes identified using the 4C method in the HEK293T cell line (coordinates in the IGB genomic browser are given for the hg19 version of the human genome). The blue color shows the contact points of the rRNA genes. The DUX genes are indicated in green. The red rectangle indicates a 5511 bp DNA region that was developed using long PCR and used for FISH.

Download (162KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. FISH results. a – experiments with the original cells. b – experiments with cells after heat shock. White shows the axis when scanning fluorescence signals passing through the center of the nucleoli. b – Core scan profile without heat shock. g – core scan profile after heat shock. The DUX signal (Alexa-5) is shown in red, and the rDNA signal (Alexa-3) is green. The distances in microns are shown horizontally.

Download (153KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Diagrams showing the number of DUX probe hybridization foci per nucleus in the initial cells and in cells after heat shock (a) and % of DUX sample hybridization foci in nuclei as they move away from the center of the nucleolus (b). HS – experiments with initial cells. HS+ – experiments with cells after heat shock. 100 cells were used for the analysis. p-value < 0.05.

Download (87KB)

Indexing metadata

Presented by Academician of the RAS P. G. Georgiev