The RRE-REV module has no effect on the packaging efficiency of cas9 and Gag proteins into nanomedic virus-like particles

Мұқаба

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Аннотация

Delivery of ribonucleoprotein complexes of Cas9 nuclease and guide RNA into target cells with virus-like particles (VLP) is one of the novel methods of genome editing, suitable for gene therapy of human diseases in the future. Efficiency of genome editing with VLPs depends on the packaging of Cas9 into VLPs, that is mediated by viral Gag protein. To increase the packaging of Cas9 into NanoMEDIC system VLPs plasmid constructs for expression of Cas9 and Gag were modified by the addition of HIV RRE (Rev response element), that is expected to increase the nuclear export of RRE-containing transcripts to cytosol via accessory protein Rev, as described for Vpr-Cas9-based VLP system. Here we found that Cas9 and Gag protein levels in the cell lysates are increased upon cotransfection of either Rev-expressing plasmid or empty control plasmid. Moreover, this effect does not depend on the presence of RRE in the transcript. On the top of that, we showed that AP21967-induced dimerization of FRB and FKBP12, but not the modification of plasmids with RRE and/or cotransfection of Rev-expressing plasmid, plays the major role in packaging of Cas9 into NanoMEDIC system VLPs. These data suggest that it is impractical to use the RRE-Rev module to enhance the packing of Cas9 nuclease into VLPs.

Негізгі сөздер

Толық мәтін

Развитие технологий редактирования генома человека с помощью системы CRISPR/Cas9 позволило начать разработки лекарственных средств для лечения ряда заболеваний человека, многие из которых уже находятся на различных стадиях клинических исследований [1]. Это обусловливает актуальность создания эффективных технологий доставки компонентов системы CRISRP/Cas9 в клетки человека [2]. Один из таких методов доставки – вирусоподобные частицы (VLP, virus-like particles) на основе оболочечных вирусов: лентивируса ВИЧ или γ-ретровируса MLV [3]. VLP представляют собой вирусные частицы, собранные из структурных белков и содержащие некоторые вирусные ферменты, но лишенные вирусного генома и акцессорных белков. На своей поверхности VLP несут белок оболочки, чаще всего гетерологичный белок VSVG из вируса везикулярного стоматита (VSV). За счет этого VLP могут эффективно проникать в клетки, доставляя компоненты системы редактирования генома [3]. Различные варианты VLP для доставки комплекса белка Cas9 и гидовой РНК (рибонуклеопротеиновый комплекс, РНП) были описаны в ряде недавних работ [4–8]. При этом одна из лимитирующих стадий получения VLP – это упаковка в них нуклеазы Cas9. Большинство вариантов систем сборки VLP основано на слиянии нуклеазы Cas9 с полипротеином Gag вирусов ВИЧ или MLV [6–8]. Нуклеаза Сas9 упаковывается в частицы в составе слитого белка с Gag, и после формирования частицы вирусные протеазы расщепляют слитый белок, высвобождая Cas9. Было обнаружено, что протеаза вируса ВИЧ способна частично разрушать нуклеазу Cas9 [5]. Для предотвращения деградации Cas9 была разработана система сборки VLP NanoMEDIC, в которой упаковка Cas9 в VLP основана на димеризации Cas9, слитой с доменом FRB (FRB-Cas9), c белком Gag из вируса ВИЧ, слитым с доменом FKBP12. В присутствии рапамицина или его аналогов домены FKBP12 и FRB димеризуются, в результате чего нуклеаза Cas9 привлекается в упаковывающиеся частицы, а в клетках-мишенях концентрация димеризатора падает, и Cas9 высвобождается из комплекса с Gag [5].

Геном ретровирусов содержит так называемые Rev response element (RRE), которые необходимы для экспорта несплайсированных вирусных транскриптов из ядра в цитоплазму. У вируса ВИЧ акцессорный белок Rev связывается с RRE и помогает экспорту по CRM1-зависимому пути [9]. У более простых ретровирусов молекулы РНК-генома содержат так называемые constitutive transport elements (CTEs), которые привлекают компоненты NXF1/NXT1-зависимого пути экспорта вирусных транскриптов. Есть данные о том, что добавление RRE элемента к транскрипту в присутствии белка Rev значительно ускоряет экспорт транскрипта в цитоплазму и приводит к более быстрому накоплению белка-репортера [10]. Подобное наблюдение было сделано и для CTE сигнала вируса M-PMV [10]. В работе [Indikova et al., 11] была предложена система для сборки VLP на основе слитого белка Vpr-Cas9, и для повышения эффективности сборки VLP в генетическую конструкцию, кодирующую Vpr-Cas9, были добавлены элементы RRE или CTE. Оказалось, что RRE-Rev модуль примерно в два раза повышал уровень упаковки Vpr-Cas9 в VLPs по сравнению с CTE-сигналом [11]. Однако в данной работе не проводилось сравнение эффективности упаковки Vpr-Cas9 в VLP между конструкциями несущими RRE или CTE и без таковых [11]. Таким образом, остается непонятным, каков был вклад RRE-Rev модуля в улучшенную упаковку Vpr-Cas9 в VLP по сравнению с конструкциями без RRE. В данной работе мы решили выяснить, можно ли повысить эффективность упаковки нуклеазы Cas9 и белка Gag в VLP системы NanoMEDIC за счет RRE-Rev-зависимого экспорта транскриптов из ядра. Для этого был оценен эффект добавления RRE-элементов в генетические конструкции, кодирующие FRB-Cas9 и FKBP12-Gag, на уровень соответствующих белков в клеточных лизатах и VLP системы NanoMEDIC.

Вначале на основе ранее описанных плазмид системы NanoMEDIC pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A (Addgene # 138477) и pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV) (Addgene # 138476), любезно предоставленных [Akitsu Hotta, 5], были получены конструкции, несущие элемент RRE вируса ВИЧ-1 между кодирующей последовательностью и сигналом полиаденилирования (рис. 1). Для этого элемент RRE амплифицировали в ПЦР на матрице плазмиды pUCHR (описана ранее в [12]) с праймерами 5’-EcoRI-BstBI-RRE (5-CCGAATTCGAAGAGCAGTGGGAATAGGAGC-3) и 3’-PspXI-RRE (5-CGACTCGAGGAGCTGTTGATCCTTTAGG-3) и клонировали по сайтам EcoRI/PspXI в pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A или по сайтам BstBI/PspXI в вектор pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV). Далее оценивали эффект от введения RRE элементов на уровень продукции белков FRB-Cas9 и FKPB12-Gag при транзиторной трансфекции в клетки линии HEK293T (получены из NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, США), которые культивировали при 37 °C в увлажненной атмосфере в присутствии 5% CO2 в среде Dulbecco’s modified Eagle’s medium (HyClone, #SH30285.01), содержащей 10%-ю фетальную бычью сыворотку (HyClone, США, #SV30160.03), 2 мМ L-глутамин (Gibco, США, #25003-024), 1000 ед./мл пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США, 15140-122) и 400 мкг/мл G418 сульфата (Calbiochem, Германия, #345812). Клетки рассевали в 24-х луночные планшеты (Costar, США, #3524) в плотности 100-150 тыс. в лунку, и трансфицировали плазмидами для экспрессии FRB-Cas9 или FKBP12-Gag, содержащими RRE элемент или без такового, вместе с плазмидой для экспрессии белка Rev (pRSV-Rev, Addgene #12253, любезно предоставлена Дидье Троно и описана ранее [13] или вместе с контрольной плазмидой pBluescriptSKII(-) (Stratagene, США), которая не содержит функциональных генетических элементов млекопитающих, в соотношении 1:1. Клетки трансфицировали, используя реагент GenJectTM-39 (Molecta, Россия) в соответствии с протоколом производителя, используя 500 нг плазмидной ДНК на лунку. Через 48 ч после трансфекции клетки лизировали в 1-кратном буфере для ДСН-ПААГ и полученные лизаты анализировали с помощью вестерн-блоттинга с мышиными моноклональными антителами к белку p17 HIV Type 1 клон 32/5.8.42 (Zeptometrix, США, #0801005) в разведении 1:2500, мышиными моноклональными антителами к α-тубулину, клон DM1α (Sigma-Aldriсh, США, #T6199), в разведении 1:2000, и кроличьими поликлональными антителами к HA-эпитопу для детекции Cas9 (Cell Signaling, Нидерланды, #3724S), разведение 1:2000. Хемилюминесцентный сигнал детектировали с помощью системы гель-документации ChemiDoc MP (Bio-Rad, США), используя набор реагентов Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, США). Денситометрический анализ результатов вестерн-блоттинга проводили с помощью программы Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). В результате было установлено, что котрансфекция плазмиды для экспрессии белка Rev приводила к 1.76-кратному повышению уровня FRB-Cas9-RRE в клеточных лизатах (рис. 2, FRB-Cas9, образцы Rev+ RRE+). Неожиданно, более выраженный эффект (3-кратное повышение уровня белка FRB-Cas9) отмечался в случае транскрипта без элемента RRE (см. рис. 2, FRB-Cas9, образцы Rev+ RRE-). Для белка FKBP12-Gag было выявлено незначительное повышение уровня белка примерно в 1.2-раза при котрансфекции плазмиды для экспрессии Rev, также не зависящее от наличия в транскрипте элемента RRE (рис.2, FKBP12-Gag, Rev+ и Rev-). Полученные результаты указывают либо на неспецифический эффект от котрансфекции плазмиды pRSV-Rev, либо на то, что эффект от экспрессии белка Rev не зависит от его способности стимулировать экспорт мРНК из ядра за счет связывания с RRE элементами.

Для проверки этих гипотез был проведен контрольный эксперимент, в котором плазмиды для экспрессии FRB-Cas9 и FRB-Cas9-RRE котрансфицировали вместе с плазмидой pRSV-Rev (рис. 3, Rev) или с контрольными плазмидами pBluescriptSKII(-) (pBl), pCMV-pA (CMV) и pEYFP-N1 (Clontech, США) (Eyfp). Плазмида pCMV-pA получена ранее в лаборатории и содержит промотор цитомегаловируса человека и сигнал полиаденилирования вируса SV40, но не содержит кДНК. Плазмида pEYFP-N1 экспрессирует флуоресцентный белок Eyfp под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования вируса SV40. В результате было установлено, что уровень белка FRB-Cas9 повышался при котрансфекции как pRSV-Rev (в 1.66 для FRB-Cas9 и в 1.25 для FRB-Cas9-RRE), так и контрольной плазмиды pCMV-pA (в 1.39 для FRB-Cas9 и в 1.9 для FRB-Cas9-RRE), независимо от присутствия в транскрипте элемента RRE (рис. 2а). Таким образом, наблюдаемый эффект на уровень белка FRB-Cas9, по всей видимости, не связан с взаимодействием белка Rev c RRE-элементом, а является следствием неспецифического эффекта при котрансфекции плазмиды.

Дополнительно были получены плазмиды на основе pRSV-Rev c нарушенной кодирующей последовательностью белка Rev. Для этого плазмиду pRSV-Rev либо обрабатывали рестриктазой BamHI, после чего липкие концы плазмиды достраивали с помощью фрагмента Кленова и лигировали вектор сам на себя. В результате в кодирующей последовательности Rev образуется преждевременный стоп-кодон, таким образом экспрессируется укороченный белок Rev с 1 по 61 аминокислоту (Rev∆B). В другом варианте плазмиду pRSV-Rev обрабатывали рестриктазами PspXI-BamHI, удаляя N-концевой фрагмент белка Rev вместе со старт-кодоном (Rev∆BP). Полученная плазмида не содержит старт-кодон в одной рамке считывания с С-концевой частью белка Rev и не должна экспрессировать даже минимальные фрагменты этого белка. В результате трансфекции полученных плазмид вместе с FRB-Cas9 было обнаружено 2-кратное повышение уровня FRB-Cas9 при экспрессии Rev, но не Rev∆B или Rev∆BP (см. рис. 2б). Полученный результат указывает на то, что помимо неспецифического эффекта от транзиторной трансфекции, наблюдаемый эффект от трансфекции плазмиды pRSV-Rev частично может быть связан с функцией Rev, не ассоциированной с влиянием на экспорт мРНК из ядра. Однако для FRB-Cas9-RRE в данном эксперименте не было обнаружено существенного эффекта от котрансфекции плазмид с Rev (см. рис. 2б). С одной стороны, это противоречит результатам на рис. 1 и 2а, но с другой стороны, эффект от экспрессии Rev в этих экспериментах составлял всего 1.75 и 1.25. Поэтому вариабельность результатов может быть обусловлена малой величиной наблюдаемого эффекта при котрансфекции плазмиды для экспрессии Rev вместе с FRB-Cas9-RRE либо быть артефактом транзиторной трансфекции (см. ниже).

 

Рис. 1. Схемы плазмидных конструкций для получения VLP системы NanoMEDIC. Плазмиды pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A и pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV) модифицировали путем добавления элемента RRE вируса ВИЧ-1 (RRE) между кодирующей последовательностью (FRB-Cas9 или FKBP12-Gag) и сигналом полиаденилирования (pA). EF1α – промотор гена EEF1A1 человека.

 

Рис. 2. Влияние экспрессии белка Rev на уровень продукции FRB-Cas9 и FKPB12-Gag. Лизаты клеток HEK293T, трансфицированных плазмидами для экспрессии FRB-Cas9 и FKPB12-Gag c элементами RRE (RRE+) или без таковых (RRE-) вместе с плазмидой для экспрессии белка Rev (Rev+) или контрольной плазмидой pBluescriptSKII(-) (Rev-), анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA-эпитопу (FRB-Cas9), белку ВИЧ p27 (FKBP12-Gag) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

 

Рис. 3. Оценка специфичности эффекта от экспрессии белка Rev на уровень продукции FRB-Cas9. Лизаты клеток HEK293T, трансфицированных плазмидами для экспрессии FRB-Cas9 c элементами RRE или без таковых (RRE-) вместе с плазмидами (а) для экспрессии белков Rev и Eyfp или контрольными плазмидами pBluescriptSKII(-) (pBl) и pCMV-pA (CMV), или (б) для экспрессии белка Rev, его укороченной формы (Rev∆B), плазмиды с делецией N-концевой части кДНК Rev (Rev∆BP) и контрольной плазмиды (pBl) анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA-эпитопу (FRB-Cas9) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

 

Для выявления эффекта RRE-Rev модуля на упаковку Cas9 и Gag в VLP системы NanoMEDIC получали VLP, используя плазмиды для экспрессии соответствующих белков с RRE элементом или без такового в присутствии или отсутствие плазмиды для экспрессии Rev. В частности, для продукции VLP 2 ∙ 105 клеток НЕК293Т рассевали в лунки 12-луночного планшета в 1 мл полной среды (DMEM/F12 (“ПанЭко”, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки телят (HyClone), 4 мМ L-глутамина и 40 мг/л гентамицина (“ПанЭко”). Через 24 ч клетки трансфицировали, используя 0.1 мкг плазмиды pHLF-EF1α-FRB-Cas9 или pHLF-EF1α-FRB-Cas9-RRE, 0.1 мкг плазмиды pHLS-EF1α-FKBP12-Gag или pHLS-EF1α-FKBP12-Gag-RRE, 0.04 мкг плазмиды pCMV-VSV-G (Addgene #8454, любезно предоставлена Бобом Вайнбергом и описана ранее [14] ), 0.08 мкг pKSgRNA-GFPt (плазмида для экспрессии гидовой РНК, направленной к кДНК белка TurboGFP, мишень: GATGCGGCACTCGATCTCCATGG) с добавлением 0.1 мкг плазмиды pRSV-Rev или pBluescriptII KS (+). Для трансфекции использовали трансфекционный реагент GenJect-39 (“Молекта”) в соотношении 1:2 (мкг ДНК : мкл GenJect) и среду OptiMEM (Gibco). Через 4 ч после добавления к клеткам комплексов ДНК/GenJect среду меняли на свежую, предварительно прогретую до 37оС, для образцов с димеризатором в среду добавляли реагент AP21967 (Takara Bio Inc., Япония) до конечной концентрации 300 нМ.

Для получения препарата VLP через 48 ч после трансфекции отбирали супернатант, центрифугировали его 5 мин при 3600 g, после чего переносили в новые пробирки и центрифугировали при 4 оС и 21 000 g в течение 2.5 ч. Супернатант отбирали, оставляя около 15 мкл жидкости над осадком, содержащим VLP. Суммарный объем доводили до 20 мкл с помощью OptiMEM (Gibco), смешивали с 4-кратным буфером для ДСН-ПААГ (250 мМ Трис-HCl, pH = 6.8, 40%-ный глицерин, 8%-ный ДСН, 4%-ный 2-меркаптоэтанол и 0.2%-ный бромфеноловый синий) и инкубировали в течение 5 мин при 80 °С. Параллельно клетки-продуценты вирусоподобных частиц трипсинизировали с помощью раствора трипсина-ЭДТА 0.05% (“ПанЭко”), отмывали в буфере PBS, суспендировали на холоду в 120 мкл лизирующего буфера, содержащего 20 мM Трис-HCl pH = 8.0, 150 мM NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% (w/v) “Тритон Х-100”, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и инкубировали при 4 оС 15 мин. Затем лизаты центрифугировали 10 мин при 4 оС и 12 000 g, после чего супернатанты смешивали с 4-кратным буфером образца для ДСН-ПААГ и инкубировали в течение 5 мин при 80 °С.

Далее проводили вестерн-блот-анализ полученных препаратов VLP и лизатов клеток-продуцентов с антителами к HA-эпитопу, белку Gag и α-тубулину. В результате было установлено, что обработка клеток веществом AP21967, вызывающим димеризацию FRB и FKBP12, приводит к примерно 2-3-кратному повышению уровня упаковки Cas9 в VLP, что было описано ранее для системы NanoMEDIC [5] (рис. 4, образцы AP+). При этом уровень упаковки Cas9 в VLP в образцах без добавления AP21967 был примерно в два раза выше для RRE-транскриптов, но не зависел от присутствия Rev. В образцах, обработанных AP21967, уровень Cas9 существенно не различался между образцами с RRE и без такового. Анализ клеточного лизата выявил повышение уровня белка Cas9 примерно в два раза во всех образцах, трансфицированных плазмидами с RRE элементом, не зависящее от присутствия Rev (см. рис. 4, панель лизаты, FRB-Cas9). По всей видимости повышенный уровень упаковки Cas9 в VLP в клетках, трансфицированных RRE плазмидами и не обработанных AP21967, обусловлен повышением уровня Cas9 в лизатах. Кроме того, при получении VLP для трансфекции используется смесь из четырех плазмид, поэтому возможное влияние плазмиды pRSV-Rev на уровень белка FRB-Cas9 в данных условиях может быть менее выражено по сравнению с экспериментами с котрансфекцией двух плазмид.

Таким образом, было установлено, что лишь обработка клеток димеризатором AP21967 оказывала существенный эффект на уровень упаковки Cas9 в VLP. Присутствие элемента RRE повышало уровень Cas9 в лизатах и уровень упаковки Cas9 в VLP без обработки димеризатором AP21967, однако при добавлении AP21967 уровень упаковки Cas9 в VLP был примерно одинаков во всех образцах. Это свидетельствует о том, что основную роль при упаковке Cas9 в частицы системы NanoMEDIC играет именно AP21967-индуцированная димеризация FRB и FKBP12, но не модификация плазмид с помощью элемента RRE или ко-трансфекция плазмиды, экспрессирующей Rev.

 

Рис. 4. Влияние RRE-элементов на упаковку нуклеазы Cas9 в VLP системы NanoMEDIC. VLP получали, как описано в тексте, используя плазмиды для экспрессии FRB-Cas9 и FKPB12-Gag c элементами RRE или без таковых в присутствии белка Rev (Rev+) или без белка Rev (Rev-). Для индукции димеризации FRB и FKBP12 клетки обрабатывали веществом AP21967 в концентрации 300 нМ (AP+) или ДМСО (AP-). Через 48 ч после трансфекции получали лизаты VLP и клеток-продуцентов и анализировали их с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA- эпитопу (FRB-Cas9), белку ВИЧ p17 (FKBP12-Gag) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

 

Доставка РНП с помощью VLP для редактирования генома с терапевтическими целями сходна по эффективности с электропорацией РНП [7]. При этом VLP можно псевдотипировать различными белками вирусной оболочки, тем самым направляя в определенный тип клеток in vivo [7]. Наконец, доставка РНП снижает вероятность редактирования нецелевых локусов из-за быстрой деградации белка Cas9, а также элиминирует риск инсерционного мутагенеза из-за отсутствия вирусного генома [15]. Все это в совокупности определяет актуальность развития методов эффективной продукции VLP.

В данной работе был оценен эффект от модификации транскриптов элементами RRE для повышения упаковки FRB-Cas9 и FKBP12-Gag в частицы системы NanoMEDIC в присутствии акцессорного белка Rev. Было выявлено, что транзиторно котрансфицируемые плазмиды, как для экспрессии Rev, так и контрольные, не содержащие кДНК, могут неспецифически влиять на уровни белков Cas9 и Gag в клеточных лизатах. При этом эффект не зависит от наличия элемента RRE в этих плазмидах. Известно, что при транзиторной котрансфекции плазмидных векторов могут наблюдаться различные артефакты, включая активацию репортерных генов пустыми плазмидными векторами [16], а также ряд других парадоксальных эффектов (см. обзор [17]. Это может объяснить полученные в данной работе результаты.

Влияние модуля RRE-Rev на уровень упаковки нуклеазы Vpr.Prot.Cas9 в VLP было показано в работе [Indikova et al, 11]. Уровень упаковки Vpr.Prot.Cas9 в VLP был в два раза выше для RRE по сравнению со CTE-элементом, однако уровень Vpr.Prot.Cas9 в лизатах не различался между транскриптами с CTE и RRE элементами. Важно отметить, что в данной работе не проводилось сравнения с контрольным транскриптом, не содержащим RRE или CTE элементы. В качестве источника белка Rev авторы использовали плазмиды pRSV-Rev и упаковочную плазмиду psPAX2, несущую также гены gag и pol. Наличие двух плазмид, кодирующих Rev, вероятно, обеспечивает более высокий уровень белка Rev по сравнению с нашей экспериментальной системой. Однако и в этом случае отсутствовал необходимый контроль в виде оценки упаковки Vpr.Prot.Cas9-RRE в VLP в отсутствие плазмиды pRSV-Rev. Таким образом, отсутствие важных контролей, а также вероятность детекции артефактов транзиторной котрансфекции не позволяют сделать вывод о необходимости модуля RRE-Rev для повышения эффективности упаковки Vpr.Prot.Cas9. Результаты нашей работы указывают на то, котрансфекция не только pRSV-Rev, но и контрольных плазмид, не экспрессирующих Rev, обладает неспецифическим эффектом на уровень экспрессии FRB-Cas9 в лизатах, и это не зависит от наличия RRE элемента в транскрипте. Более того, было обнаружено, что именно AP21967-индуцированная димеризация FRB и FKBP12 играет основную роль при упаковке Cas9 в частицы системы NanoMEDIC, но не модификация плазмид с помощью элемента RRE или котрансфекция плазмиды, экспрессирующей Rev.

В настоящий момент основной способ получения VLP – это транзиторная котрансфекция нескольких плазмид [4, 5, 7, 11]. Результаты данной работы указывают на нецелесообразность использования RRE-Rev модуля для повышения упаковки нуклеазы Cas9 в VLP системы NanoMEDIC. Полученные артефактные результаты при транзиторной котрансфекции определенных плазмид указывают на необходимость тщательного контроля условий получения VLP для выявления факторов, повышающих эффективность упаковки нуклеазы Cas9 в VLP. Мы предполагаем, что создание стабильных клеточных линий, экспрессирующих некоторые из компонентов, необходимых для сборки функциональных VLP, может помочь в стандартизации и оптимизации условий получения VLP.

Благодарности

Работа была выполнена с использованием инфраструктуры Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Института биологии гена РАН.

Источник финансирования

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-15-00381).

Соблюдение этических стандартов

Исследований с участием людей и/или животных не проводилось.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

Авторлар туралы

N. Kruglova

Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences

Email: mshepelev@mail.ru
Ресей, Moscow

D. Komkov

Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences; Ben-Gurion University of the Negev

Email: mshepelev@mail.ru

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences

Ресей, Moscow; Israel, Be’erSheva

D. Mazurov

Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences; University of Minnesota

Email: mshepelev@mail.ru

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine

Ресей, Moscow; USA, Minneapolis

M. Shepelev

Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: mshepelev@mail.ru
Ресей, Moscow

Әдебиет тізімі

  1. Doudna J.A. // Nature. 2020. V. 578. № 7794. P. 229–236.
  2. Lino C.A., Harper J.C., Carney J.P., Timlin J.A. // Drug Deliv. 2018. V. 25. № 1. P. 1234–1257.
  3. Mazurov D., Ramadan L., Kruglova N. // Viruses. 2023. V. 15. № 3. P. 690.
  4. Banskota S., Raguram A., Suh S., Du S.W., Davis J.R., Choi E.H., Wang X., Nielsen S.C., Newby G.A., Randolph P.B., et al. // Cell. 2022. V. 185. № 2. P. 250-265.e16.
  5. Gee P., Lung M.S.Y., Okuzaki Y., Sasakawa N., Iguchi T., Makita Y., Hozumi H., Miura Y., Yang L.F., Iwasaki M., et al. // Nat Commun. 2020. V. 11. № 1. P. 1334.
  6. Mangeot P.E., Risson V., Fusil F., Marnef A., Laurent E., Blin J., Mournetas V., Massouridès E., Sohier T.J.M., Corbin A., et al. // Nat Commun. 2019. V. 10. № 1. P. 45.
  7. Hamilton J.R., Tsuchida C.A., Nguyen D.N., Shy B.R., McGarrigle E.R., Sandoval Espinoza C.R., Carr D., Blaeschke F., Marson A., Doudna J.A. // Cell Rep. 2021. V. 35. № 9. P. 109207.
  8. Montagna C., Petris G., Casini A., Maule G., Franceschini G.M., Zanella I., Conti L., Arnoldi F., Burrone O.R., Zentilin L., et al. // Mol Ther Nucleic Acids. 2018. V. 12. P. 453–462.
  9. Fernandes J., Jayaraman B., Frankel A. // RNA Biol. 2012. V. 9. № 1. P. 6–11.
  10. Pocock G. M., Becker J.T., Swanson C.M., Ahlquist P., Sherer N.M. // PLoS Pathog. 2016. V. 12. № 4. P. e1005565.
  11. Indikova I., Indik S. // Nucleic Acids Res. 2020. V. 48. № 14. P. 8178–8187.
  12. Mazurov D., Ilinskaya A., Heidecker G., Lloyd P., Derse D. // PLoS Pathog. 2010. V. 6. № 2. P. e1000788.
  13. Dull T., Zufferey R., Kelly M., Mandel R.J., Nguyen M., Trono D., Naldini L. // J Virol. 1998. V. 72. № 11. P. 8463–8471.
  14. Stewart S.A., Dykxhoorn D.M., Palliser D., Mizuno H., Yu E.Y., An D.S., Sabatini D.M., Chen I.S.Y., Hahn W.C., Sharp P.A., et al. // RNA. 2003. V. 9. № 4. P. 493–501.
  15. Han X., Liu Z., Ma Y., Zhang K., Qin L. // Adv Biosyst. 2017. V. 1. № 1–2. P. e1600007.
  16. Hu Q., Suzuki K., Hirschler-Laszkiewicz I., Rothblum L.I. // Biotechniques. 2002. V. 33. № 1. P. 74, 76, 78 passim.
  17. Stepanenko A.A., Heng H.H. // Mutat Res Rev Mutat Res. 2017. V. 773. P. 91–103.

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар
Әрекет
1. JATS XML
Жүктеу
2. Fig. 1. Schemes of plasmid constructs for obtaining VLP of the NanoMEDIC system. Plasmids pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A and pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV) were modified by adding an HIV-1 virus RRE element (RRE) between the coding sequence (FRB-Cas9 or FKBP12-Gag) and the polyadenylation signal (pA ). EF1α is the promoter of the human EEF1A1 gene.

Жүктеу (92KB)
Метадеректер
3. Fig. 2. Effect of Rev protein expression on the level of FRB-Cas9 and FKPB12-Gag production. Lysates of HEK293T cells transfected with FRB-Cas9 and FKPB12-Gag expression plasmids with or without RRE elements (RRE+) together with Rev protein expression plasmid (Rev+) or control plasmid pBluescriptSKII(-) (Rev-), were analyzed using Western blotting with antibodies to the HA epitope (FRB-Cas9), HIV p27 protein (FKBP12-Gag) and α-tubulin to control the total protein level in cell lysates. Results from one of two representative experiments are shown.

Жүктеу (64KB)
Метадеректер
4. Fig. 3. Assessment of the specificity of the effect of Rev protein expression on the level of FRB-Cas9 production. Lysates of HEK293T cells transfected with plasmids for the expression of FRB-Cas9 with or without RRE elements (RRE-) together with plasmids (a) for the expression of Rev and Eyfp proteins or control plasmids pBluescriptSKII(-) (pBl) and pCMV-pA (CMV) , or (b) for the expression of the Rev protein, its truncated form (Rev∆B), a plasmid with a deletion of the N-terminal part of the Rev cDNA (Rev∆BP) and a control plasmid (pBl) were analyzed using Western blotting with antibodies to HA- epitope (FRB-Cas9) and α-tubulin to control the total protein level in cell lysates. Results from one of two representative experiments are shown.

Жүктеу (95KB)
Метадеректер
5. Fig. 4. Influence of RRE elements on the packaging of Cas9 nuclease in the VLP of the NanoMEDIC system. VLPs were produced as described in the text using FRB-Cas9 and FKPB12-Gag expression plasmids with or without RRE elements in the presence of Rev protein (Rev+) or without Rev protein (Rev-). To induce dimerization of FRB and FKBP12, cells were treated with AP21967 at a concentration of 300 nM (AP+) or DMSO (AP-). 48 hours after transfection, lysates of VLPs and producer cells were obtained and analyzed using Western blotting with antibodies to the HA epitope (FRB-Cas9), HIV p17 protein (FKBP12-Gag) and α-tubulin to control the total protein level in cell lysates. Results from one of two representative experiments are shown.

Жүктеу (79KB)
Метадеректер

© Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».