Immunoliposomes as a promising antiviral agent against SARS-COV-2

T. V. Bobik; Бобик Т. В.; M. A. Simonova; Симонова М. А.; N. U. Rushkevich; Рушкевич Н. Ю.; N. N. Kostin; Костин Н. Н.; G. A. Skryabin; Скрябин Г. А.; V. D. Knorre; Кнорре В. Д.; A. A. Schulga; Шульга А. А.; E. V. Konovalova; Коновалова Е. В.; G. M. Proshkina; Прошкина Г. М.; A. G. Gabibov; Габибов А. Г.; S. M. Deev; Деев С. М.

doi:10.31857/S2686738924010099

Immunoliposomes as a promising antiviral agent against SARS-COV-2

Authors: Bobik T.V.¹, Simonova M.A.¹, Rushkevich N.U.¹, Kostin N.N.¹, Skryabin G.A.¹, Knorre V.D.¹, Schulga A.A.¹, Konovalova E.V.¹, Proshkina G.M.¹, Gabibov A.G.¹^,2, Deev S.M.¹^,3
Affiliations:
1. Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences
2. M.V. Lomonosov Moscow State University
3. National Research University Higher School of Economics
Issue: Vol 514, No 1 (2024)
Pages: 50-55
Section: Articles
URL: https://bakhtiniada.ru/2686-7389/article/view/258937
DOI: https://doi.org/10.31857/S2686738924010099
EDN: https://elibrary.ru/KRWHSS
ID: 258937

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

According to the World Health Organization, as of September 13, 2023, there have been approximately 23 million confirmed cases of COVID-19 reported in the Russian Federation, about 400 thousand of which were fatal. Considering the high rate of mutation of the RNA-containing virus genome, which inevitably leads to the emergence of new infectious strains (Eris and Pyrola), the search for medicinal antiviral agents remains an urgent task. Moreover, taking into account the actively mutating receptor-binding domain, this task requires fundamentally new solutions.

This study proposes a candidate immunoliposomal drug that targets the S protein of SARS-CoV-2 by the monoclonal neutralizing antibody P4A1 and ensures the penetration of a highly active ribonuclease into the virus-infected cell, which degrades, among cellular RNA, viral RNA too. We demonstrate a more than 40-fold increase in the neutralizing activity of the developed drug compared to the free monoclonal neutralizing antibody.

Keywords

immunoliposomes, virus neutralization, barnase

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В 2020 г человечество пережило пандемию короновирусной инфекции SARS-CoV-2. Однако говорить о том, что инфекция побеждена не приходится: в популяции по-прежнему происходит возникновение новых более агрессивных штаммов короновируса, приводящих не только к инфицированию, но и к летальным исходам. Так, по состоянию на сентябрь 2023 года коронавирус SARS-CoV-2 инфицировал более 770 млн человек, число погибших от COVID-19 во всем мире превысило 6.9 млн человек [1].

К настоящему времени одобрены для использования и продолжают проходить клинические испытания большое количество препаратов на основе нейтрализующих моноклональных антител (nAb), действие которых обусловлено связыванием с эпитопами рецептор-связывающего домена S-белка SARS-CoV-2, блокированием его взаимодействия с ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ACE2) и подавлением, таким образом, инфицирования клеток хозяина. Препятствием к созданию универсального иммунопрепарата является значительная мутагенность RBD домена вирусного S-белка. Рекомендуемые для терапии COVID-19 препараты содержат значительные дозы рекомбинантных антител (400–2400 мг при однократном введении) [2], что может провоцировать нежелательные явления в некоторых случаях. Снижение дозы терапевтических антител, таким образом, было бы оправдано как с точки зрения биобезопасности, так и с экономической точки зрения. В этой связи особое значение приобретает подход, связанный с адресной доставкой препарата в зараженную вирусом клетку. Одним из подходов, позволяющих снизить концентрации терапевтического антитела, является применение конъюгатов антител с цитотоксическим агентом. В частности, в качестве цитотоксического агента используются липосомы, нагруженные токсинами различной природы (органической и неорганической) – иммунолипосомы. Данный подход был успешно реализован в ряде работ [3–5], демонстрирующих улучшение терапевтического индекса препарата. Отметим, что липосомальная форма доставки лекарства имеет такие преимущества как: защита инкапсулированного лекарства от ферментативной деградации и быстрого клиренса in vivo, снижение иммуногенности включенных в липосому белковых препаратов, снижение общей токсической нагрузки от инкапсулированного токсина на организм. Кроме того, применение иммунолипосом позволяет расширять количество потенциальных мишеней при одном виде цитотоксических липосом за счет простой смены векторной молекулы на поверхности липосомы.

Известно, что вследствие взаимодействия таргентированных к поверхностному вирусному белку липосом с вирусными частицами и последующего их слияния, наблюдается перенос содержимого липосом внутрь вирусной частицы [6]. Мы предположили, что рибонуклеаза, содержащаяся внутри липосомальных частиц, которые таргетированы к поверхностному белку сложных РНК-содержащих вирусов, таким образом может доставляться внутрь содержимого вируса и/или инфицированной клетки и обеспечивать вируснейтрализующий эффект за счет частичного гидролиза РНК содержимого вируса и/или инфицированной клетки. В данной работе нами показано, что конъюгирование нейтрализующего антитела P4A1 [7] с липосомальными частицами, несущими внутри рибонуклеазу барназу увеличивает более чем в 40 раз нейтрализующую активность антитела P4A1 в псевдовирусной системе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение таргетированных липосомальных препаратов

В качестве цитотоксического компонента, воздействующего на вирусную РНК, использовали рибонуклеазу барназу из Bacillus amyloliquefaciens. Загрузку барназы в липосомы осуществляли на основе электростатического взаимодействия между положительно заряженным белком (при нейтральных значениях рН) и отрицательно заряженной внутренней поверхностью липосом. Липосомы формировали из природных фосфолипидов, содержащих 20 % фосфатидилэтаноламина. Инкубация суспензии фосфолипидов с небольшой, гидрофильной и положительно заряженной (при нейтральных значениях рН) барназой, при низкой ионной силе в результате продавливания через поликарбонатный фильтр с размером пор 100 нм, приводит к образованию липосом с диаметром около 90–100 нм. Модификацию внешней поверхности липосом осуществляли по аминогруппам фосфотидилэтаноламина с использованием 2-иминотолана (реагент Траута, позволяющий ввести SH-группу по первичным аминам фосфолипида, финальная концентрация в реакционной смеси 6 мМ) как описано в [8]. Рекомбинантное антитело P4A1 или пептид G3, который использовали в качестве отрицательного контроля, конъюгировали со 100-кратным молярным избытком sulfo-EMCS (N-ε-maleimidocaproyl-oxysulfosuccinimideester, билинкер, позволяющий ввести в белок через оксисульфосукцинимидмалеимидную группу). Липосомы, содержащие на своей поверхности SH-группы, антитело P4A1 или пептид G3 с малеимидной группой, предварительно очищенные с помощью гель-проникающей хроматографии (сорбент сефадекс G-25, Cytiva) от избытка непрореагировавших реагентов, далее конъюгировали вместе с получением таргетированных липосом P4A1-ЛБ и G3-ЛБ соответственно. Адресные модули P4A1 или пептид G3, непрореагировавшие с липосомами, отделяли от адресных липосом с использованием гель-проникающей хроматографии на колонке, упакованной сорбентом сефароза CL2B. Таргетированные липосомы P4A1-ЛБ и G3-ЛБ при этом сходят с колонки в исключенном объеме, в то время как P4A1 и пептид G3 – в полном объеме колонки. Препарат P4A1-Л получали конъюгированием пустых липосом с антителом P4A1 аналогичным образом. Под пустыми липосомами понимается препарат липосом, внутренняя водная фаза которого не содержит цитотоксического компонента.

Количественное определение P4A1 антитела методом ИФА

В лунки 96-луночных планшетов MaxiSorp (Nunc, Дания) вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного рецептор-связывающий домена S-белка SARS-CoV-2 (RBD) в фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали планшет в течение ночи при 2–8 ^oC. После блокировки свободных сайтов связывания блокирующим буфером (PBS, 0.05 % Tween-20, 0.1 % БСА) вносили образцы анализируемых препаратов и раствор антитела P4A1 известной концентрации в блокирующем буфере в разведениях и инкубировали в течение 30 мин при 37^oС. После 30-минутной инкубации при 37^oC и промывки в лунки планшета добавляли раствор антител к Fс-фрагменту антител человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (SigmaAldrich, США, кат. № AP113P), в разведении 1:10 000 в блокирующем буфере, планшет инкубировали в течение 30 мин. По окончании инкубации и промывки в лунки планшета добавляли по 100 мкл субстратного раствора TMB и инкубировали в темноте в течение 15 мин. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 10 % раствора фосфорной кислоты, измеряли величины ОП450 в лунках планшета на планшетном спектрофотометре. Строили кривую зависимости величин ОП450 от концентрации антитела P4A1 и использовали ее для вычисления концентраций антитела P4A1 в образцах липосомальных препаратов.

Определение нейтрализующей активности в псевдовирусной системе

Оценку нейтрализующей активности проводили с использованием псевдотипированных лентивирусов, несущих S-белок SARS-CoV-2 [9] по методике, описанной в работе [10], используя в качестве контроля растворы антитела P4A1 известной концентрации. Серийные образцы анализируемых липосомальных препаратов готовили разведением исследуемых препаратов в среде DMEM с 10 % FBS. Кривые зависимости величин люминесцентных сигналов от разведений препаратов строили с помощью ПО GraphPadPrism 8 и вычисляли концентрацию веществ, обеспечивающие нейтрализацию IC₄₀ псевдовируса.

Определение цитотоксического действия липосом in vitro

Цитотоксическое действие липосомальных препаратов в отношении клеточной линии HEK293T-ACE2, определяли с использованием стандартного МТТ-теста [11]. Клетки рассевали в 96-луночный планшет в количестве 1.5×10³ клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Ростовую среду заменяли на свежую, содержащую различные концентрации (0, 0.005 и 0.05 нМ) липосом, и инкубировали клетки в течение 72 ч при 37^оС. По окончании инкубации клетки промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали в свежей среде, содержащей 0,5 мг/мл MTT в течение 1 ч. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде. Оптическую плотность в лунках измеряли с использованием планшетного флуориметра Tecan Infinity при 570 нм. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали, как отношение усредненной оптической плотности в лунках с обработанными клетками к усредненной оптической плотности в лунках с необработанными (контрольными) клетками и выражали в процентах.

Обработка данных

На рисунках (если не указано иначе) представлены данные не менее трех независимых экспериментов, обработку данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPadPrism8 (GraphPadSoftwar, США)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Загрузку барназы в липосомы оценивали спектрофотометрически. Для этого из спектра поглощения протеолипосом вычитали спектр пустых липосом (рис. 1). Концентрацию белка рассчитывали, используя молярный коэффициент экстинции e ₂₈₀ = 26930 М^-1см^-1. Концентрация барназы в липосомах составила 13.3 мкМ. Концентрацию липосом, загруженных барназой, оценивали спектрофотометрически, сравнивая спектр пустых и протеолипосом.

Рис. 1. Спектры поглощения липосом. Красная и синяя кривые – спектры поглощения липосом, загруженных барназой, и пустых липосом, соответственно. Сиреневая кривая – спектр поглощения барназы, загруженной в липосомы, который получен вычитанием спектра поглощения пустых липосом из спектра поглощения протеолипосом.

Как видно из рис. 1, спектр протеолипосом совпадает со спектром пустых липосом, полученных 17-кратным продавливанием суспензии фосфолипидов (1.1 мг/мл) через фильтр с диаметром пор 100 нм. Ранее с использованием гидрофильного мембранонепроницаемого красителя фталоцианин-3,4’,4’,4’’-тетрасульфоната меди мы показали, что 1 мг/мл суспензии липидных везикул соответствует 1.2 нМ [8]. Поскольку спектр загруженных барназой липосом совпадает со спектром пустых липосом с концентрацией 1.1 мг/мл, концентрация загруженных белком липосом составляет 1.3 нМ. Для селективной элиминации псевдовирусных частиц, содержащих на своей поверхности ген S-белка, внешнюю поверхность липосом ковалентно модифицировали рекомбинантным нейтрализующим антителом P4A1, специфичным к S-белку вируса SARS-COV-2 (P4A1-ЛБ).

Антитело P4A1 полученно скринингом B-клеток индивидуума, перенесшего COVID-19 [7]. Данное антитело специфично и эффективно (KD = =1.02*10^–10М) связывает рецептор-связывающий домен S-белка SARS-CoV-2 (RBD), блокируя его взаимодействие с ACE2. Для оценки специфичности препарата P4A1-ЛБ получали препарат G3-ЛБ, ковалентно модифицируя внешнюю поверхность липосом, содержащих барназу, пептидом G3. Пептид G3 представляет собой белок неиммуноглобулиновой природы, способный высокоспецифично (KD = 0.9*10^–9M) взаимодействовать с рецептором II эпидермального фактора роста человека [12]. Для оценки вклада барназы в нейтрализующую активность препарата P4A1-ЛБ получали препарат P4A1-Л, ковалентно модифицируя внешнюю поверхность пустых липосом антителом P4A1. Нейтрализующую активность полученных препаратов, а также интактного антитела P4A1, оценивали с помощью псевдовирусной системы с использованием псевдотипированных S-белком SARS-CoV-2 лентивирусов, кодирующих люциферазу светлячка (Luc) [10].

Все три исследуемых препарата демонстрируют нейтрализующую активность, обусловленную, по-видимому, разной природой (рис. 2). В случае препарата G3-ЛБ, имеющего в качестве направляющей молекулы пептид G3, не обладающего способностью связываться с S-белком SARS-CoV-2, нейтрализующая активность проявляется при концентрации липосом более 0.0055 нМ. Этот эффект, возможно, реализуется за счет неспецифического связывания липосомальных частиц с поверхностью псевдовирусов и/или клеток и дальнейшего слияния с ними. Барназа, высвобождающаяся после слияния, проявляет РНКазную активность в отношении вирусного генома в составе псевдовирусов и/или цитоплазматической РНК зараженных клеток, что приводит к снижению синтеза маркерного белка люциферазы. Для исключения возможного объяснения наблюдаемого падения люминесценции гибелью клеток вследствие цитотоксического эффекта неспецифической интернализации липосом, содержащих барназу, мы изучили изменения жизнеспособности клеток линии HEK293T-ACE2, обработанных и необработанных препаратами G3-ЛБ, P4A1-ЛБ и P4A1-Л, с использованием стандартного МТТ-теста [11]. Полученные данные не выявили статистической разницы в жизнеспособности клеток линии HEK293T-ACE2 между обработанными и необработанными клетками для всех исследуемых препаратов, что свидетельствует об отсутствии значимого цитотоксического действия исследуемых липосомальных препаратов в диапазоне концентраций 0–0.05 нМ.

Рис. 2. Зависимость интенсивности люминесценции клеток линии HEK293T-ACE2, экспрессирующих на поверхность рецептор ACE2 человека, от концентрации липосомальных препаратов в псевдовирусной системе.

В случае препарата P4A1-Л, не содержащего барназу, нейтрализующая активность обусловлена концентрационно-зависимым блокированием антителом P4A1 S-белка SARS-CoV-2 на поверхности псевдовирусов, что в свою очередь препятствует взаимодействию с рецептором ACE2 и дальнейшему проникновению псевдовирусов в клетки. В случае препарата P4A1-ЛБ мы можем предположить, что нейтрализующая активность достигается за счет синергического эффекта, обусловленного концентрационно-зависимым блокированием проникновения псевдовирусов, как в случае препарата P4A1-Л, так и РНК-азной активности барназы, как в случае препарата G3-ЛБ. Для корректного сравнения нейтрализующей активности полученных липосомальных препаратов P4A1-ЛБ и P4A1-Л определяли концентрацию конъюгированного антитела P4A1 в составе препаратов методом ИФА. Поскольку для препарата P4A1-ЛБ значения люминесценции для концентраций P4A1 выше 0.0028 нМ, соответствующих концентрациям липосом более 0.0055 нМ, могут быть занижены вследствие влияния неспецифической интернализации барназы, то сравнение нейтрализующей активности проводили, определяя ингибирующую концентрацию 40 % (IC₄₀). Согласно полученным данным (рис. 3) нейтрализующая активность липосомальных препаратов P4A1-Л и P4A1-ЛБ (IC₄₀ 17 ± 9 и 1.2 ± 0.9 рМ соответственно) выше таковой свободного антитела P4A1 (IC₄₀ 55 ± 6 рМ). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что липосомальные частицы вносят значительный вклад в нейтрализацию взаимодействия S-белка псевдовируса с рецептором ACE2. Данный эффект может быть объяснен несколькими механизмами.

Рис. 3. Зависимость интенсивности люминесценции клеток линии HEK293T-ACE2, экспрессирующих на поверхности рецептор ACE2 человека, от концентрации антитела Р4А1 в составе липосомальных препаратов и буферного раствора в псевдовирусной системе.

Возможно, липосомы эффективно экранируют взаимодействие свободных молекул S-белка с рецептором ACE2, предупреждая инфекцию клеток. Также возможен эффект «экстракции» молекул S-белка с поверхности псевдовирусов липосомальными частицами [13]. Значительное увеличение нейтрализующей активности P4A1-ЛБ (IC₄₀ 0.12 ± 0.09 рМ) по сравнению с P4A1-Л (IC₄₀ 1.7 ± 0.9 рМ) обусловлено проявлением РНКазной активности по отношению к вирусному геному псевдовирусов и/или РНК молекул инфицированных клеток вследствие высвобождения барназы из липосомных частиц.

Таким образом, в результате данной работы были получены иммунолипосомы, таргетированные к S-белку вируса SARS-COV-2 рекомбинантным нейтрализующим антителом P4A1, содержащие (P4A1-ЛБ) и не содержащие (P4A1-Л) внутри РНКазу барназу. Показано, что липосомальные препараты P4A1-ЛБ и P4A1-Л обладают нейтрализующей активностью выше активностисвободного нейтрализующего антитела P4A1. А препарат иммунолипосом P4A1-ЛБ обладает нейтрализующей активностью более чем в 40 раз превышающей активность нейтрализующего антитела P4A1. В то же время предложенный в этой статье подход продемонстрирован на примере таргетированных липосом к конкретному вирусу. Но эта методология, включающая использование антитела P4A1 в качестве направляющей молекулы, не может рассматриваться как универсальное средство для создания противоковидных препаратов в силу мутагенеза, обычно приводящего к изменению параметров взаимодействия уже известных связывающих и нейтрализующих антител (в том числе и P4A1) с вирусными белками. Поэтому для создания препаратов в этом и других случаях будут требоваться исследования специфичности взаимодействия таргетной липосомы и мишени на поверхности вируса.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, соглашение №075-15-2021-1049.