Сополимеры акриламидов и акриловой кислоты с противовирусной активностью

Full Text

Несмотря на значительные достижения в области вакцинотерапии, вирусные инфекции по-прежнему остаются важной проблемой здравоохранения. Появление устойчивых к вакцинам вирусов происходит очень быстро. Кроме того, хранение вакцин и их транспортировка требуют соблюдения строгого температурного режима. В условиях сезонных респираторных инфекций и с появлением в мире опасных патогенных вирусов, таких как Ebola, Zika, SARS, H1V и других, против которых вакцины отсутствуют, особенно актуальна потребность в поиске и разработке новых противовирусных средств широкого спектра действия, нейтрализующих вирусы или блокирующих их проникновение в клетку. Среди перспективного класса противовирусных веществ особый интерес представляют высокомолекулярные соединения – водорастворимые синтетические и природные анионные полиэлектролиты.

Впервые противовирусная активность была обнаружена в середине прошлого столетия у полиакриловой и полиметакриловой кислоты [1]. Их активность обусловлена способностью блокировать взаимодействия вирусов с клетками “хозяина”, а также индуцировать выработку организмом специфического противовирусного белка ‒ интерферона, который вырабатывается зараженной клеткой для предупреждения соседних клеток [2]. Эпидемия ВИЧ, начавшаяся в 80-х годах ХХ века, стимулировала исследования по поиску полимеров с противовирусной активностью. Высокую активность продемонстрировали многие полианионные полиэлектролиты синтетические и природные, содержащие ионогенные, фосфатные, фосфонатные, карбоксильные и сульфо-группы [3, 4]. В современных условиях с появлением новых мутантных штаммов коронавируса и волнами сезонных респираторных инфекций целесообразно вести активный поиск макромолекул различного химического строения, обладающих противовирусной активностью, и установления взаимосвязи их строения с биологической активностью.

Целью настоящей работы являлся синтез анионных полиэлектролитов: сополимеров акриламидов различного строения с акриловой кислотой реакциями в цепях полиакрилового ангидрида, установления влияния их химического строения акриламидного звена на противовирусную активность и цитотоксичность.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

В настоящей работе применяли акрилоилхлорид фирмы “Aldrich” (Германия) квалификации ч. 97%, триэтиламин производства “Компонент-реактив” (Россия) квалификации ч.д.а. (СТП ТУ КОМП 2-685-13). Инициатором служил 2,2-азо-бис-(изобутиронитрил) (ДАК), который перекристаллизовывали из этанола и хранили в темноте при ‒3 °С, Т_пл = 103°‒105 °С.

Использовали также бензол квалификации х.ч. Акционерного общества “ЭКОС-1”; толуол ‒ перегоняли над прокаленной окисью кальция, Т_кип = 110 °С, n_d = 1.49; п-аминобензойную кислоту (п-АБК) и п-аминосалициловую кислоту (п-АСК) ‒ перекристаллизовывали из смеси вода : этанол в соотношении 1 : 1 с активированным углем, Т_пл = 186.5°‒188° и 150.5 °С соответственно; диметилформамид ‒ очищали перегонкой азеотропа бензол‒вода, затем фракционировали в вакууме, Т_кип = 153 °С, n_d = 1.4269 [5].

Синтез

Ангидрид акриловой кислоты синтезировали по описанию работы [6] в среде диэтилового эфира, путем взаимодействия акриловой кислоты с акрилоилхлоридом в присутствии пиридина, n_d = 1.4500 (лит. n_d = 1.4487 при 20 °С):

 

 

Полиакриловый ангидрид (ПАА) с разной молекулярной массой синтезировали свободно-радикальной полимеризацией в бензоле (М = 75 × 10³) или толуоле (М = 81 × 10³) с использованием инициатора ДАК в количестве 1 мас. % в атмосфере аргона и запаянных ампулах при температуре 65 °С в течение 20 ч. По окончании полимеризации получали хрупкие блоки, которые извлекали из ампул и промывали соответствующими растворителями (бензолом и толуолом). Выход продукта составил 97‒99 мас. %:

 

 

Ацилирование аминов: анилина, (п-)м-аминофенолов, о-аминобензойной кислоты, п-АБК, п-АСК полиакриловым ангидридом проводили в ДМФА (мольное соотношение 1 : 3) при Т = 65 °С в течение 8 ч и выходом сополимеров 44‒78 мас. %. По окончании реакции сополимеры осаждали в диэтиловый эфир или хлороформ, после чего сушили в вакууме, а затем растворяли в 1 N NaOH. Удаляли низкомолекулярные примеси диализом против воды и выделяли лиофильной сушкой. Получали водорастворимые сополимеры натриевой соли акриловой кислоты с N-замещенным акриламидом. Молекулярную массу сополимеров М = (20‒91) × 10³ оценивали методом вискозиметрии и рассчитывали по формуле работы [7].

Методы

Для определения молекулярной массы ПАА его подвергали гидролизу водой до полиакриловой кислоты (ПАК) (1 г ПАА растворяли при Т = 60 °С в 25 мл дистиллированной воды и выдерживали в течение 3 ч). Для удаления низкомолекулярных компонентов проводили диализ против воды с использованием полупроницаемой мембраны фирмы “Биолот” с пределом пропускания 1 кДа и выделяли ПАК лиофильной сушкой. Характеристическую вязкость ПАК измеряли в 2 N NaOH при Т = 25 °С в вискозиметре Уббелоде. Молелярную массу рассчитывали с помощью уравнения Марка‒Куна‒Хаувинка для ПАК: [ƞ] = 1.05 × 10^‒3 М^0.54 [7]; молекулярная масса находилась в интервале (75‒81) × 10³.

Для идентификации полученных ПАА и ПАК записывали ИК-спектры на приборе “Shimadzu”, “Iraffinity-1S” в таблетках KBr. В спектрах ПАА наблюдали две полосы поглощения карбонильных групп 1750‒1800 см^‒1, а также полосы валентных колебаний C‒O‒C при 1040 см^‒1. После гидролиза ПАА в ИК-спектрах ПАК прослеживается исчезновение двух ангидридных полос в области 1750‒1800 см^‒1 и появление одной карбонильной группы –CO в области 1700 см^‒1 и –COOH в области 1420‒1300 см^‒1.

Состав сополимеров определяли по данным элементного анализа на азот и методом УФ-спектроскопии. Спектры регистрировали на спектрофотометре “СФ-256 УВИ” (Общество с ограниченной ответственностью “ЛОМО Фотоника”, Россия): λ_max = 215 (I), 236 (II), 284 (III), 286 (IV) и 243 нм (V). Строение сополимеров подтверждено данными ИК-спектроскопии (рис. 1; табл. 1) и спектрами ЯМР ¹H.

 

Рис. 1. ИК-спектр сополимера натриевой соли акриловой кислоты с акрилоиланилидом

 

Таблица 1. Основные характеристические ИК-спектральные полосы синтезированных сополимеров

R	NH валентные колебания (см1)	‒CH2‒ (см1)	COOH (см1)	C=O, амид 1 (см1)	Колебания ароматического скелета (см1)	СОО‒, асимм./симм. (см1)
I II III IV V	3293 3280 3294 3289 3300	2920‒2850 2920‒2850 2920‒2850 2920‒2850 2920‒2850	1700 ‒ 1700 плечо 1698 1701, 1683	1660 1645 1673 1670 1657	1594, 1494 1606, 151 1599, 1447 1598, 1501 1587, 1508	1540/1397 1544/1410 1526/1384 1544/1305 1510/1387

 

ИК-спектры регистрировали на ИК-фурье-спектрометре “Vertex 70” фирмы “Bruker” при разрешении 4 см^‒1, число сканов 60. При регистрации спектров использовали микроприставку однократного НПВО “Pike” с рабочим элементом, изготовленным из ZnSe. При регистрации спектров однократного НПВО вводили поправку, учитывающую глубину проникновения луча в образец в зависимости от частоты.

Исследование противовирусной активности синтезированных сополимеров в отношении вируса простого герпеса первого типа и цитотоксичности осуществляли на культуре клеток Vero в лаборатории химиотерапии вирусных инфекций Научно-исследовательского института гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России с использованием стандартных методов [8, 9]. Вирус простого герпеса получали из рабочей коллекции лаборатории химиотерапии вирусных инфекций (накоплен на культуре клеток Vero), далее из вирусосодержащей культуральной жидкости готовили серию аликвот. Полученные аликвоты хранили при температуре ‒80 °С.

В работе использовали клеточную культуру Vero (почечный эпителий зеленой мартышки), полученную из рабочей коллекции лаборатории химиотерапии вирусных инфекций. Для оценки противовирусной активности в отношении простого герпеса первого типа готовили серию 3-кратных разведений веществ, начиная от 2 ЦТД₅₀ (50%-ная цитотоксичная доза, доза препарата, вызывающая гибель половины клеток) на поддерживающей среде “Альфа-МЕМ”, содержащую 20 мкг/мл ципрофлоксацина и 2% фетальной бычьей сыворотки (“Биолот”, Россия). Эти растворы вносили в культуру клеток Vero по 100 мкл на лунку 96-луночного планшета в двукратной концентрации и сразу же добавляли по 100 мкл вируса с концентрацией вирусных частиц в аликвоте не менее 10⁶ в серии из семи 10-кратных разведений (10^‒1–10^‒7) и инкубировали в течение 1 ч при Т = 37 °С и 5% CO₂. Далее клетки отмывали от вируса поддерживающей средой и снова вносили в лунки по 100 мкл разведений тестируемого средства, после чего во все лунки вносили по 100 мкл поддерживающей среды. Планшеты инкубировали в течение 3-х суток при Т = 37 °С и 5% CO₂ в CO₂-инкубаторе, а затем оценивали выживаемость клеток с помощью микротетразолиевого теста (МТТ-тест). Титр вируса во всех случаях рассчитывали по методу Рида и Менча [8] и выражали в 50%-ных тканевых инфекционных дозах (ТИД₅₀). На основании полученных данных рассчитывали 50%-ную ингибирующую концентрацию (ЭД₅₀).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ниже показан синтез сополимеров акриловой кислоты (АК) с N-акрилоильными производными ароматических аминов и аминокислот (АКА):

 

 

В ИК-спектре (рис. 1) сополимера натриевой соли акриловой кислоты с акрилоиланилидом присутствует широкая полоса 3500‒2500 см^‒1 – колебания связи ‒ОН, на фоне которой заметна полоса 3293 см^‒1, относящаяся к валентным колебаниям группы ‒NH вторичного амида, 2945‒2939 см^‒1 – колебания группы ‒СН₂ полимерной цепи, 1660 см^‒1 – полоса поглощения С=О амидной группы (амид 1), 1594 и 1494 см^‒1 – плоскостные колебания С=С ароматического скелета. Полосы 1540 и 1397 см^‒1 относятся соответственно к антисимметричным и симметричным колебаниям ионизованной карбоксильной группы СОО^–. Полоса деформационных колебаний группы ‒NH вторичного амида (амид 2) должна находится в интервале 1570‒1515 см^‒1 и не может быть выделена на фоне интенсивной полосы 1540 см^‒1. Плечо в области 1700 см^‒1 свидетельствует о неполной ионизации полиакриловой кислоты. Другие сополимеры имеют аналогичные спектральные характеристики (табл. 1).

Спектры ЯМР ¹H были зарегистрированы на спектрометре “Bruker Avance-400” (Германия) с рабочей частотой 400 МГц относительно сигналов растворителя D₂O (4.78 м.д.), которые подтверждают строение и состав полученных сополимеров. На примере спектра (рис. 2) сополимера натриевой соли акриловой кислоты с акрилоиламинобензоатом натрия протоны ароматического кольца обнаруживаются по группе сигналов в интервале δ = 7.0‒7.5 м.д., сигнал продукта разложения ДМФА δ = 2.6 м.д., сигналы CH‒ основной цепи δ = 1.8‒2.8 м.д., сигналы CH₂– основной цепи в области 1.2‒1.8 м.д.

 

Рис. 2. Спектр ЯМР ¹H сополимера натриевой соли акриловой кислоты с акрилоиламинобензоатом натрия

 

Из данных (табл. 2) видно, что впервые синтезированные сополимеры акриламидов с акриловой кислотой проявляют высокую противовирусную активность по сравнению с полиакриловой кислотой. Модификация ПАК с введением в ее структуру ароматических фрагментов приводит к резкому повышению противовирусной активности, указывая тем самым на существенную роль гидрофобных факторов при взаимодействии сополимеров с клетками и вирионами (вирусными частицами).

 

Таблица 2. Условия ацилирования ароматических аминов и аминокислот ПАА, растворитель ДМФА. Состав и характеристики синтезированных сополимеров (М₁ ‒ АК) и (М₂ ‒ АКА)

R	Мол. соотношение ПАА : : R‒NH2	[Ƞ]25 ˚С в 2 N NaOH, дл/г	УФ-спектроскопия, λmax	ЯМР 1H	Противовирусная активность против герпеса первого типа
			М1 / М2, мол. %	М1 / М2, мол. %	ЦТД50, мкг/мл	ЭД50, мкг/мл
Анилин (I)	1 : 3	0.22	57 / 43	59 / 41	˃50	47.38
п-аминофенол (II)	1 : 3	0.29	43 / 57	55 / 45	˃50	4.5
п-АБК (III)	1 : 3	0.41	61 / 39	60 / 40	˃50	1.4
п-АСК (IV)	1 : 3	0.45	78 / 22	77 / 23	˃50	<0.6
о-аминобензойная кислота (V)	1 : 3	0.44	86 / 14	77 / 23	˃50	<0.6
ПАК	‒	(75‒81) × 103	‒ / ‒	‒ / ‒	˃50	˃50

 

Таким образом, наиболее высокую активность показали сополимеры акриловой кислоты с акрилоил-п-аминобензойной кислотой, акрилоил-п-аминосалициловой кислотой, акрилоил-п-аминофенолом, акрилоил-о-аминобензойной кислотой. Эти сополимеры перспективны для дальнейшего изучения.

Авторы выражают благодарность Д.Н. Разгуляевой, А.М. Клабукову, А.В. Галочкиной, А.В. Гаршининой, принимавших участие в оценке противовирусной активности образцов.

Работа выполнена в рамках Госзадания “Полимеры для биомедицины” (регистр. № 124013000730-3); а также за счет средств Государственного Задания Министерства Здравоохранения РФ “Молекулярно-биологические подходы к разработке нового лекарственного средства для терапии заболеваний, вызванных штаммами вируса простого герпеса, резистентными к существующим этиотропным препаратам, TVKQ-2024-0004”.

Настоящая статья не содержит описания исследований с использованием в качестве объектов животных и людей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в финансовой или какой-либо сфере.

About the authors

Е. Ф. Панарин

Институт высокомолекулярных соединений – филиал Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"

Author for correspondence.
Email: efra99@mail.ru
Russian Federation, Санкт-Петербург

О. Н. Журавская

Институт высокомолекулярных соединений – филиал Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"

Email: efra99@mail.ru
Russian Federation, Санкт-Петербург

А. В. Ситко

Институт высокомолекулярных соединений – филиал Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"

Email: efra99@mail.ru
Russian Federation, Санкт-Петербург

Е. Н. Власова

Институт высокомолекулярных соединений – филиал Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"

Email: efra99@mail.ru
Russian Federation, Санкт-Петербург

А. А. Штро

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева

Email: efra99@mail.ru
Russian Federation, Санкт-Петербург

References

Supplementary files