FLUOROQUINOLONES EFFECT ON THORACIC AORTA MECHANICAL STRENGTH AND SERUM MAGNESIUM IN LABORATORY RABBITS

Full Text

Введение Препараты группы фторхинолонов обладают широким спектром антибактериальной активности, однако их применение ассоциируется с большим количеством нежелательных реакций. В последние 10 лет стали появляться сообщения об ассоциации применения фторхинолонов с риском аневризмы и диссекции аорты [2, 8]. Данные поражения развиваются относительно нечасто (1,1% назначений), однако разрыв аорты приводит к летальному исходу в 50-80% случаев [2], что обуславливает высокую актуальность исследования механизмов развития этих нежелательных реакций. Класс-специфическим свойством фторхинолонов является способность образовывать комплексные соединения с ионами магния [6, 7]. Магний - эссенциальный для соединительнотканных структур элемент, участвующий в процессах стабилизации нуклеиновых кислот, активации синтеза белка, контроля митотической активности клеток [5]. Высказаны предположения о том, что в основе механизма фторхинолон-ассоциированного поражения сухожилий и хрящей лежит нарушение обмена магния в тканях за счёт образования прочных комплексных соединений [6, 7]. Возможно, поражение стенки аорты при терапии фторхинолонами так же обусловлено нарушением обмена магния. В современной клинической практике наиболее часто используются ципрофлоксацин и левофлоксацин [3], поэтому анализ их свойств наиболее актуален. В литературе описаны модели индуцированной фторхинолонами аневризмы аорты на лабораторных животных, однако не было найдено исследований прочностных характеристик аорты на фоне применения данных препаратов. Цель исследования - оценить взаимосвязь между прочностью грудной аорты лабораторных кроликов при одноосном растяжении и уровнем сывороточного магния на фоне применения ципрофлоксацина и левофлоксацина. Методика Исследование выполнено на 20 лабораторных кроликах-самцах породы «Советская шиншилла» в возрасте 5 месяцев. Методом рандомизации в закрытых конвертах животные были разделены на 3 группы: группа 1 (контроль, 6 кроликов) - животные перорально получали раствор-носитель в течение 14 дней; группа 2 (ципрофлоксацин, 7 кроликов) - животные перорально получали ципрофлоксацин в дозе 150 мг/кг/сут в течение 14 дней; группа 3 (левофлоксацин, 7 кроликов) - животные перорально получали левофлоксацин в дозе 150 мг/кг/сут в течение 14 дней. Эквивалентная доза обоих фторхинолонов для человека (ЭДЧ) составляет ~48,3 мг/кг/сут, что в ~7 раз выше средних терапевтических доз ципрофлоксацина и левофлоксацина (для человека с массой тела 70 кг - 7,1 мг/кг/сут). Токсические дозы использованы для эффективного экспериментального моделирования повреждающего эффекта препаратов на аорту. Подобный подход применялся в ряде исследований других авторов, например, Förster и др. использовали офлоксацин у крыс в суточной дозе 600 мг/кг в течение 28 дней [6] (ЭДЧ = 96,8 мг/кг, средняя терапевтическая доза - 5,7 мг/кг/сут). Для введения препаратов были разработаны композиции на основе водного раствора-носителя, содержащего 10 мг/мл гидроксипропилметилцеллюлозы марки Metolose 60SH (вязкость 4000, производитель Shin-Etsu Chemical, Япония) для достижения оптимальной вязкости и 100 мг/мл сахарозы для маскировки горького вкуса фторхинолонов. Кролики контрольной группы получали только раствор-носитель. Композиции для животных групп 2 и 3 включали 150 мг/мл ципрофлоксацина или левофлоксацина соответственно, использованы измельчённые таблетки «Цифран®» (производитель Сан Фармасьютикал Индастриз Лтд, Индия), и таблетки «Леволет® Р», содержащие 500 мг левофлоксацина (производитель Д-р Редди`с Лабораторис Лтд, Индия). Суточный объём препарата рассчитывался на массу тела животного (1 мл/кг/сут). Композиции вводились глубоко в полость рта на корень языка с помощью интродьюсера. Выведение кроликов из эксперимента осуществлялось на 15 день внутривенной инъекцией 2 мл раствора лидокаина 100 мг/мл в условиях наркоза (0,2 мл раствора «Золетил® 100» внутривенно (тилетамин 50 мг/мл и золазепам 50 мг/мл, производитель Virbac Sante Animale, Франция) и 0,2 мл раствора «Ксила®» внутривенно (ксилазина гидрохлорид 20 мг/мл, производитель Interchemie, Нидерланды). При аутопсии у животного вскрывалась брюшная полость и грудная клетка. Нисходящая часть грудной аорты на протяжении 5-6 см отделялась от клетчатки, межрёберные артерии пересекались скальпелем. Повреждение и механическая деформация выделяемого фрагмента не допускались. Аорта немедленно помещалась в раствор натрия хлорида 0,9%, после чего в этот же день подвергалась механическому испытанию. Механические испытания на одноосное растяжение выполняли на разрывной машине Shimadzu AG-X 50kN (производитель Shimadzu, Япония). Исследуемый образец закреплялся между пневматическими клиновыми захватами машины с помощью абразивных вкладок во избежание выскальзывания образцов из захватов во время испытания. Начальная длина образца между захватами - 30 мм. Скорость перемещения траверсы была 1 мм/мин. В ходе эксперимента строили график зависимости силы, прикладываемой к образцу от относительной деформации (удлинения), по которому определяли следующие параметры: предел прочности (максимальная нагрузка, выдерживаемая образцом без разрушения); максимальная деформация (относительное удлинение при достижении образцом предела прочности); модуль упругости (определялся по максимальному наклону деформационной кривой на линейном участке при начале деформирования образца); работа разрушения (энергия, которую необходимо затратить для разрыва тканей, определялась как площадь под графиком от начала нагружения до точки максимального напряжения - предела прочности). О характере деформационного поведения тканей аорты при растяжении судили по форме кривой зависимости силы от деформации. Прямолинейное нарастание силы в образце по мере растяжения с последующим резким её падением в момент разрыва говорило о том, что деформация образца была упругой. Нелинейный ступенчатый рост силы и последующее плавное её снижение указывали на возникновение микроразрывов, говорящих о наличии в образце участков со сниженной прочностью. Сывороточный уровень магния анализировался колориметрически с использованием набора реактивов «Магний-Ново» (производитель Вектор-Бест, Россия) на спектрофотометре СФ-56 (производитель ЛОМО, Россия). Обработка данных проведена с использованием программы Statistica 13 (лицензия №JPZ904I805602ARCN25ACD-6). Данные представлены как среднее значение и стандартное отклонение (M±s). Для оценки значимости различий использован дисперсионный анализ, парные сравнения с контролем выполнены по критерию Даннета. Для анализа различия качественных признаков использован двусторонний точный критерий Фишера. Корреляции анализировались по критерию Пирсона. Различие взаимосвязи прочности аорты и сывороточного магния между тремя исследованными группами животных исследовалось с помощью ковариационного анализа. Группа рассматривалась как дискретный предиктор, концентрация магния - как ковариата, переменными отклика были параметры прочности аорты. Различия и корреляции считали значимыми при p<0,050. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России на заседании №8 от 25.10.2019. Результаты исследования При макроскопическом исследовании образцов аорт не было обнаружено формирования аневризм или участков диссекции. На рис. 1 приведены примеры графиков зависимости силы, прикладываемой к образцу аорты, от величины деформации. Рис. 1. Графики зависимости силы упругости от деформации для образцов, предел прочности которых максимально близок к медиане по группе. Стрелками указаны точки полного разрушения образцов Графики, характеризующие деформационное поведение всех 6 образцов контрольной группы, имели типичный вид: по мере растяжения напряжение в тканях практически линейно росло до точки разрушения образца, а далее резко снижалось, что говорит о том, что деформация в тканях контрольных животных была упругой. В группе ципрофлоксацина один образец из 7 характеризовался гетерогенностью прочностных свойств (сравнение с контролем: р=1,000, двусторонний точный критерий Фишера). В группе левофлоксацина 5 из 7 образцов демонстрировали микроразрывы. Графики характеризовались нелинейным ступенчатым нарастанием силы и её плавным снижением после достижения предела прочности (сравнение с контролем: р=0,021, двусторонний точный критерий Фишера). Результаты механических испытаний аорты и сывороточные уровни магния животных приведены в табл. 1. Таблица 1. Прочность аорты и сывороточные уровни магния Параметр Контроль N=6 Ципрофлоксацин N=7 Левофлоксацин N=7 р(КЦЛ)* р(КЦ)* р(КЛ)* Предел прочности, Н 5,4±3,1 3,9±1,3 2,8±1,3 0,093 0,309 0,057 Максимальная деформация, % 65,0±13,4 65,6±23,2 46,0±13,8 0,093 0,996 0,121 Модуль упругости, МПа 14,9±13,7 9,6±3,6 10,2±6,3 0,501 0,445 0,521 Работа разрушения, мДж 46,6±17,4 39,6±15,6 21,1±10,2 0,015** 0,597 0,011** Сывороточный магний, ммоль/л 1,2±0,3 1,0±0,2 1,0±0,1 0,336 0,278 0,324 Примечания: * - р(КЦЛ), р(КЦ), р(КЛ) - статистическая значимость различий признака между тремя группами, группами контроля и ципрофлоксацина, контроля и левофлоксацина соответственно; ** -статистически значимые при p<0,050 различия Показатели прочности нисходящей части грудной аорты животных группы контроля и ципрофлоксацина не различались статистически значимо. Применение левофлоксацина ассоциировалось со значимым снижением работы разрушения тканей аорты при продольном растяжении (снижение на 54,7% в сравнении с контролем). Наблюдалась тенденция к уменьшению предела прочности аорты, не достигшая статистической значимости. Модуль упругости, характеризующий жёсткость тканей, не различался по сравнению с контрольной группой. Применение обоих фторхинолонов не изменяло содержание магния в сыворотке крови. В табл. 2 представлены коэффициенты корреляции концентрации Mg2+ и параметров прочности. Таблица 2. Корреляции параметров прочности аорты с сывороточной концентрацией магния Параметр прочности аорты Контроль N=6 Ципрофлоксацин N=7 Левофлоксацин N=7 Предел прочности, Н R = 0,985* R = 0,470 R = -0,309 Максимальная деформация, % R = -0,136 R = 0,428 R = -0,109 Модуль упругости, МПа R = 0,988* R = 0,301 R = -0,343 Работа разрушения, мДж R = 0,940 R = 0,926* R = -0,285 Примечание: * - значимые при p<0,050 корреляции Предел прочности контрольных кроликов тесно коррелировал с сывороточным содержанием магния, но у животных, получавших фторхинолоны, такая ассоциация отсутствовала. Аналогичный результат был получен при анализе модуля упругости. Имелась тенденция к формированию значимой ассоциации работы разрушения аорты животных контрольной группы с сывороточным уровнем магния, в группе ципрофлоксацина наблюдалась значимая ассоциация; применение левофлоксацина приводило к отсутствию такой связи. Максимальная деформация аорты не зависела от содержания магния в сыворотке ни в одной из групп. Ковариационный анализ продемонстрировал статистически значимое воздействие группы и сывороточного содержания магния на предел прочности аорты (табл. 3). Выявленное взаимодействие факторов подтверждает различный характер взаимосвязи предела прочности аорты и уровня магния сыворотки в исследованных группах. Максимальная деформация аорты не ассоциировалась ни с содержанием магния в сыворотке крови, ни с использованием фторхинолонов, а ковариационная модель была незначима и не позволяла объяснить наблюдаемые данные. Модуль упругости аорты определялся только группой, но не сывороточным уровнем магния. Оба фактора взаимодействовали между собой, модель была значима и объясняла значительную долю данных. Работа разрушения аорты зависела только от уровня магния в сыворотке, построенная модель хорошо согласовывалась с данными. Таблица 3. Ковариационный анализ прочности аорты Параметр прочности аорты Значимость воздействия группы (р) Значимость воздействия сывороточного магния (р) Значимость взаимодействия факторов (р) Коэффициент детерминации модели, значимость (R2; р) Предел прочности, Н 0,013* 0,035* 0,006* 0,823; <0,001** Максимальная деформация, % 0,762 0,739 0,576 0,371; 0,333 Модуль упругости, МПа 0,011* 0,099 0,006* 0,770; 0,003** Работа разрушения, мДж 0,165 0,036* 0,071 0,818; <0,001** Примечания: * - значимое влияние фактора при p<0,050; ** - статистически значимая модель при p<0,050 Обсуждение результатов исследования Повреждение стенки аорты под действием левофлоксацина характеризовалось ступенчатостью упругого ответа ткани на растяжение, говорящей о формировании микроразрывов в участках пониженной прочности. Основным звеном патогенеза аневризмы и диссекции аорты считается дегенерация промежуточной оболочки, включающая потерю гладкомышечных клеток и фрагментацию эластических волокон, связывающих концентрически расположенные пластинчатые единицы промежуточной оболочки (media) [4]. Микроскопическая гетерогенность тканей может вызвать неоднородный ответ гладкомышечных клеток при деформации, что имеет решающее значение в нарушении механического гомеостаза стенки аорты [9] и способствует формированию аневризмы и диссекции. Медиана предела прочности аорты кроликов, получавших левофлоксацин, снизилась на треть по сравнению с контролем. Подобное снижение предела прочности на 29% показано для стенок аневризмы восходящей аорты при одноосном продольном растяжении в работе Vorp D.A. и соавт. [10]. Вероятно, ткани аорты под действием левофлоксацина становятся менее прочными даже в отсутствие макроскопически определяемых признаков формирования аневризм или участков диссекции. В связи с этим при использовании фторхинолонов необходима настороженность в отношении рисков повреждения аорты, особенно при имеющемся её поражении. В работе возникновение аневризм ассоциировалось с повышением жёсткости стенки аорты и снижением её эластичности. Между тем, в настоящей работе не было получено значимого изменения модуля упругости тканей аорты при использовании обоих фторхинолонов. Упругий ответ стенки аорты определяется количеством и организацией эластических и коллагеновых волокон [4]. На ранних стадиях повреждения фибриллярного компонента соединительной ткани активируется репаративный процесс, сопровождающийся первоначальным повышением синтеза коллагеновых волокон [4]. В связи с этим в разные моменты времени от начала повреждения фторхинолоном стенка аорты может демонстрировать разнообразное поведение, что объясняет несоответствие изменения модуля жёсткости в настоящем исследовании и работе [10]. Полученные различия свойств исследованных препаратов соответствуют данным крупного исследования базы данных системы контроля неблагоприятных явлений Управления по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств, где терапия левофлоксацином увеличивала шансы возникновения аневризмы аорты в 5,03 раза в сравнении с цефуроксимом (95% доверительный интервал 3,97-6,38), а ципрофлоксацином - в 2,31 раза (95% доверительный интервал 1,62-3,29) [8]. Уровень магния в сыворотке крови не изменялся под действием ципрофлоксацина и левофлоксацина, что может быть объяснено существованием в организме механизмов стабилизации его содержания в крови [1]. В работах других авторов также показано отсутствие снижения сывороточного содержания магния под действием фторхинолонов [6, 7]. Между тем, сывороточная концентрация магния не может служить отражением его уровня в тканях, т. к. в крови содержится около 1% всего организменного пула Mg2+ [1]. Обнаруженная тесная корреляция сывороточного содержания магния и некоторых параметров прочности аорты контрольных животных хорошо согласуется с описанной ролью магния в поддержании функций соединительной ткани [5]. У получавших фторхинолоны кроликов такая связь отсутствовала. Вероятно, за счёт образования прочных комплексных соединений фторхинолоны способствуют перераспределению магния из тканей в кровь, в результате чего наблюдается нормальное содержание Mg2+ в сыворотке, но возникает нарушение его обмена в соединительнотканных структурах, в т.ч. стенке аорты. Заключение Левофлоксацин показал наиболее существенное повреждающее воздействие на прочностные свойства стенки грудной аорты, что соответствует данным крупных фармакоэпидемиологических исследований. Терапия левофлоксацином может снизить прочность стенки аорты даже в отсутствие признаков формирования аневризмы или участков диссекции. Использование ципрофлоксацина и левофлоксацина не сопровождалось снижением сывороточных уровней магния, но способствовало потере взаимосвязи прочности аорты и уровня Mg2+ в крови, что можно объяснить нарушением обмена магния в стенке аорты. Таким образом, при назначении фторхинолонов следует сохранять настороженность в отношении рисков повреждения аорты, особенно у пациентов с имеющимся её заболеванием или нарушением обмена магния.

About the authors

N. V Izmozherova

Ural State Medical University

Email: email@example.com
доктор медицинских наук, доцент, заведующая кафедрой фармакологии и клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России; главный внештатный клинический фармаколог Минздрава Свердловской области 3, Repina St., 620028, Yekaterinburg, Russia

D. V Zaytsev

Ural State Mining University; Ural Federal University named after the First President of Russia B.N. Yeltsin

Email: email@example.com
доктор физико-математических наук, заведующий кафедрой физики Уральского государственного горного университета, доцент кафедры физики конденсированного состояния и наноразмерных систем Института естественных наук и математики Уральского Федерального университета им. первого Президента России Б.Н. Ельцина 30, Kujbisheva St., 620144, Yekaterinburg, Russia; 19, Mira St., 620002, Yekaterinburg, Russia

V. M Bakhtin

Ural State Medical University

Email: email@example.com
аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии ФГБОУ ВО Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России 3, Repina St., 620028, Yekaterinburg, Russia

References

Supplementary files