ВЛИЯНИЕ БИОСТИМУЛЯЦИИ ТРАВЫ МАНЖЕТКИ ОБЫКНОВЕННОЙ СВЕЖЕЙ НА ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ СОКА

Полный текст

Введение Интерес к изучению влияния стрессовых факторов на изменения химического состава растительного сырья вызван перспективами разработки лекарственных средств на основе метаболитов, образующихся в результате адаптивных реакций [1, 4, 5, 6]. Влияние низкой положительной температуры в условиях отсутствия света на фармакологическую активность сырья алоэ и других растений изучал В. П. Филатов в 30-х годах XX века, он же впервые ввел термин «биогенные стимуляторы». Можно предположить, что процессы, происходящие в изолированных тканях растения аналогичны происходящим в естественных местообитаниях под действием низких положительных температур. Многочисленными исследованиями показано, что стресс, вызванный низкими положительными температурами, приводит к генерированию в клетках растения активных форм кислорода, которые в свою очередь вызывают активацию защитной системы. Важными компонентами ответа (защитной реакцией) растения является индукция специфических ферментов (полифенолоксидазы, пероксидазы, каталазы и др.), катализирующих синтез вторичных метаболитов, поддерживающих баланс оксидант-антиоксидантной системы. Ферментативные трансформации претерпевают флавоноиды, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, полисахариды [7, 10]. Современные исследования подтверждают изменения в химическом составе и биологической активности свежего сырья под периодическим влиянием низких положительных температур. Изменения носят индивидуальный характер и выражаются в повышении выхода фенольных соединений в листьях осины обыкновенной, экстрактивных и дубильных веществ в листьях ольхи, экстрактивных веществ в соке из листьев подорожника большого [1, 4, 5]. Содержание антиоксидантов - аскорбиновой кислоты и флавоноидов в листьях алоэ и каллизии душистой в стрессовых условиях (при температуре 4-8°С) увеличивалось, что по мнению авторов связано с адаптивной реакцией растений на стресс [6]. Изменения химического состава биостимулированного сока подорожника привело к повышению ранозаживляющей активности по сравнению с нативным соком [1]. Ранее нами показано, что сок из свежей травы Alchemilla vulgaris содержит широкий спектр биологически активных соединений [8]. В связи с вышеизложенным интерес вызывает изучение влияния биогенной стимуляции свежей травы манжетки на химический состав и антиоксидантную активность сока. Цель исследования - изучить химический состав и антиоксидантную активность сока из свежей травы манжетки обыкновенной, подверженной периодическому воздействию низких положительных температур. Методика Надземную часть манжетки обыкновенной заготавливали в период цветения и начала плодоношения на разнотравном луге с преобладанием в фитоценозе манжетки в Краснокамском районе Пермского края. Из свежего сырья получали образцы соков: 1. нативный сок (СН), свежее сырьё измельчали до частиц размером 3-5 мм, полученную массу отжимали через 4-5 слоев марли, далее консервировали 95% этиловым спиртом, отстаивали 10 суток при t+4°С после чего осадок отфильтровали через бумажный фильтр (образец сока получен из сырья без воздействия на него стрессовых факторов); 2. соки из биостимулированного сырья (СБ7 и СБ14), свежее сырье манжетки, упакованное в полиэтилен, выдерживали в условиях отсутствия света при низких положительных температурах (при t + 4±2°С) в течение 7 и 14 дней. Соки получали аналогичным нативному соку способом. Фенольные соединения исследовали методом восходящей хроматографии на бумаге в системах бутиловый спирт - уксусная кислота ледяная - вода очищенная (БУВ 4:1:5) и уксусная кислота ледяная - вода очищенная (УВ 15:85) на бумаге марки FN 1, плотностью 150 г/м2, производитель MUNKTEL &FILTRAK GmbH. Детектирование веществ, проводили по хроматографическим характеристикам веществ и с применением детектирующих реагентов: пары аммиака, алюминия III хлорида спиртового раствора 2%. Идентифицировали зоны адсорбции по соответствию стандартным образцам рутина, хлорогеновой, кофейной и феруловой кислоты. Профиль фенольных соединений сока травы манжетки обыкновенной биостимулированной в течение 7 дней определяли методом ультраэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC/MS) на хроматографе Waters Acquility с диодно-матричным УФ-детектором и тандемным квадрупольным MC-детектором TQD (Waters). Хроматографировали испытуемый раствор и растворы стандартов в следующих условиях: объем пробы 2 мкл и 5 мкл; колонка 0,21×15,0 см Acuility UPLC BEH C18 (1,7 мкм); температура колонки 35; скорость потока 0,25 мл/мин; градиентный режим хроматографирования формировался путем смешивания подвижных фаз А и В: подвижная фаза А (ПФ А) - смесь: вода очищенная - ацетонитрил (95 : 5) с муравьиной кислотой; подвижная фаза В (ПФ В): ацетонитрил с муравьиной кислотой. УФ-детекция: 220-500 нм. Условия МС: МС детекция в режиме позитивных ионов; параметры детектора: напряжение на капилляре +3 кВ; напряжение на конусе 50 В; температура капилляра 450; температура источника 120; скорость потока осушающего газа 800 л/ч, скорость потока газа в конусе 50 л/ч и сканирование в диапазоне масс от 100 до 1500 ед.; МС-детекция в режиме негативных ионов; параметры детектора: напряжение на капилляре -3 кВ; напряжение на конусе -30 В; температура капилляра 350; температура источника 120; скорость потока осушающего газа 500 л/ч, скорость потока газа в конусе 50 л/ч и сканирование в диапазоне масс от 100 до 1500 ед. В соках, определяли содержание сухого остатка, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ, полисахаридов по фармакопейным методикам. Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин проводили дифференциальным спектрофотометрическим методом на приборе СФ-2000 при длине волны 405 нм, с использованием реакции комплексообразования с алюминия хлоридом [9]. Антиоксидантную активность (АОА) определяли радикал-нейтрализующим методом, с использованием 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ). Вычисляли АОА исследуемых веществ по формуле АОА= (Ак - Аи/Ак)*100%; где Ак - оптическая плотность раствора ДФПГ, Аи - оптическая плотность ДФПГ в присутствии испытуемого образца [2] и концентрацию сока, при которой АОА равна 50% (IC50 мг/мл). Результаты исследования обрабатывали статистически: для каждой группы образцов сока рассчитывали среднее значение и среднее квадратичное отклонение, для оценки различий между группами использовали t критерий Стьюдента. Результаты исследования и их обсуждение Влияние периодического воздействия стрессовых факторов (низких положительных температур и отсутствие света) на сырьё изучали на соках, полученных из сырья биостимулированного в течение 7 и 14 дней. Для фиксации изменения химического состава проводили сравнительное качественное и количественное исследование биологически активных веществ (БАВ). На хроматограммах всех исследуемых соков обнаружили флавоноиды (флавоны, флавонолы, в том числе флавонол-3-гликозиды), изофлавоноиды, коричные и фенолкарбоновые кислоты, вещества фенольной природы неустановленной группы. В соке СН детектировано в системах БУВ и УВ по 21 веществу, в соке СБ7 -18/24 соответственно, в СБ14 - 22/19 веществ. Сравнительный анализ характеристик зон адсорбции веществ соков показал различие в химическом составе, вне зависимости от принадлежности их к одной группе биологически активных веществ. В соках СН/СБ7 детектированы флавонол-5-гликозиды (система БУВ, Rf 0,46/0,44 соответственно), метилированные флавонолы (система УВ, Rf 0,10/0,10), флавон-5-гликозиды (система УВ, Rf 0,30, 0,43, 0,50/0,30, 0,43, 0,44). В соках СН/СБ14 обнаружены флавоноиды с различными формами замещения фенольных групп (система БУВ, Rf 0,31/ 0,26, 0,45, 0,49, 0,77 соответственно), агликоны метоксифлавонолов (система УВ, Rf 0,01/0,01), флавоны без 5-ОН группы (система УВ, Rf 0,32/БУВ Rf 0,04). В соках СБ7/СБ14 детектированы агликоны флавонолов (система УВ, Rf 0,16/0,16) и агликоны метоксифлавонов (система УВ, Rf 0,15, 0,23/0,26). Флаваноны (система БУВ, Rf 0,43), метоксифлавоны (система УВ, Rf 0,19), дигидрохалконы (система УВ, Rf 0,45) детектированы только в соке СН. Метилированные производные коричной кислоты (система БУВ, Rf 0,73) - только в соке СБ7. Агликоны флавонов с 3-ОН группой (система БУВ, Rf 0,10) и 3,5-диметоксифлавонолы (система УВ, Rf 0,76) - в соке СБ14. Идентичные характеристики на хроматограммах всех соков имели только вещества в системе БУВ 4:1:2 с Rf 0,16±0,00, соответствующие окисленным флавоноидам (флавонам или флавонолам), с Rf 0,26±0,01 - п-кумаровой кислоте (или др. коричным кислотам), с Rf 0,80±0,01 - фенолкарбоновым кислотам и с Rf 0,84±0,01- изофлавоноидам. В системе УВ 15:85 идентичных веществ, присутствующих на хроматограммах всех соков не обнаружено. В образцах соков из сырья подвергавшегося 7-дневному воздействию низких положительных температур (биостимуляции) наблюдали достоверно большее содержание полифенолов: дубильных веществ и флавоноидов, но меньшее количество аскорбиновой кислоты в сравнении с нативным соком (СН). Содержание полисахаридов, и сухого остатка не имело достоверных отличий (табл. 1). Таблица 1. Содержание биологически активных веществ и сухого остатка в соках из травы манжетки обыкновенной Группа БАВ Содержание БАВ, % сок нативный сок из сырья, биостимулированного 7 дней сок из сырья, биостимулированного 14 дней Аскорбиновая кислота 0,052±0,003 0,046±0,002* 0,050±0,006 Флавоноиды 5,8±0,2 7,0±0,7* 6,4±0,6 Дубильные вещества 7.9±0,6 11,7±0,9* 11,6±0,7* Полисахариды 55±9 51±6 43±5* Сухой остаток 6,9±0,4 6,9±0,3 5,9±0,3* 2* Примечание: *- при р <0,05 уровень различий в сравнении с соком нативным; 2* - при р <0,05 уровень различий в сравнении с соком из сырья биостимулированного 7 дней Воздействие на сырье низких положительных температур в течение 14 дней привело к достоверному снижению содержания сухого остатка в СБ14 в сравнении с соками СН и СБ7. Содержание аскорбиновой кислоты и флавоноидов в СБ14 статистически значимо не отличалось от соков СН и СБ7. Количество дубильных веществ и полисахаридов в соках СБ14 и СБ7 находилось в одном диапазоне колебаний концентраций, но имело статистически значимое отличие от сока СН. В результате выявили, что наибольшее содержание дубильных веществ и флавоноидов характерно для всех образцов сока, сырьё которых подвергалось биогенной стимуляции. Все исследуемые образцы соков из травы манжетки обыкновенной проявили антиоксидантную активность в тесте с ДФПГ, которая уступала веществу сравнения - аскорбиновой кислоте. Биостимуляция травы манжетки в течение 7 дней привела к достоверному увеличению антиоксидантной активности сока в сравнении с СН, более длительное воздействие (в течение 14 дней) низких положительных температур показало статистически более низкую АОА в сравнении с СБ7 (табл. 2). Таблица 2. Антиоксидантная активность исследуемых соков Образцы соков IC50 мг/мл ED50 мг сок нативный 0,15-0,19 0,80-1,00 сок из сырья биостимулированного 7 дней 0,06-0,07 1* 0,30-0,40 сок из сырья биостимулированного 14 дней 0,10-0,11 2* 0,60-0,61 аскорбиновая кислота 0,0041±0,2 0,0221±1,1 Примечание: 1* - при р <0,05 уровень различий в сравнении с СН; 2* - при р <0,05 уровень различий в сравнении с СБ7 Природу фенольных соединений, содержащихся в соке из травы манжетки обыкновенной биостимулированной в течение 7 дней, определяли методом LC/MS. На основании масс-спектров при ионизации в позитивном и негативном режимах были предположены молекулярные ионы (М+Н+, M+Na+ и М-Н-) и молекулярный вес компонента, а по фрагментации и УФ-спектрам предположена структура агликона, входящего в состав молекулы. Использованы данные для пиков, имеющих площадь не менее 1% от суммы всех площадей при 260 нм. Полученные данные приведены в табл. 3. В соке СБ7 идентифицировано 16 веществ фенольной природы: протокатеховая и эллаговая кислота, флавонолы - производные кверцетина и кемферола, флавононы, флавоны и метоксифлавоны производные апигенина. Таблица 3. Фенольные соединения сока из травы манжетки биостимулированной 7 дней Структурная формула / название вещества Protocatechuic Acid /Ellagic acid Quercetin-3-O-glucuronide Quercetin 3-O-glucuronilglucoside Quercetin-3-O-arabinoglucoside Rhamnazin Rhamnazin-3-O-glucuronide Rhamnetin-3-O-glucuronilglucoside Rhamnetin-3-O-glucuronide Kaempferol-3-O-glucuronide Kaempferide-3-O-glucuronide Apigenin-7-O-glucuronide Methoxyapigenin-7-O-glucuronide Hesperetin-7-O-glucuronide Blumeatin B-3-O-dimethylramnosylglucuronide Persicogenin-5-O-glucuronide Преобладание производных кверцетина и кемферола согласуется с литературными данными, описывающими ферментативные превращения флавоноидов при окислительно-восстановительных реакциях инициированных низкими положительными температурами [7]. Выводы 1. Воздействие низких положительных температур (биостимуляции) на траву манжетки обыкновенной свежую приводит к изменению качественного состава, количественного содержания биологически активных веществ и антиоксидантной активности соков, что подтверждает протекание адаптивных реакций в сырье под влиянием стрессового фактора. 2. Продолжительность биостимуляции сырья манжетки влияет на химический состав и антиоксидантную активность сока. Семидневная биостимуляции манжетки является оптимальным периодом подготовки сырья. Полифенольные соединения, идентифицированные в соке биостимулированной травы манжетки, показывают перспективность дальнейшего изучения химического состава и фармакологической активности.

Об авторах

Елена Васильевна Черемных

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
ассистент кафедры фармакогнозии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, Полевая ул., 2

Елена Владимировна Зорина

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, Полевая ул., 2

Валентина Дмитриевна Белоногова

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой фармакогнозии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, Полевая ул., 2

Список литературы

Дополнительные файлы