ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И АНТИАГРЕГАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПОДЗЕМНЫХ ОРГАНОВ МАЛИНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (RUBUSIDAEUSL.)

Полный текст

Введение Малина обыкновенная (Rubus idaeus L.) распространена в лесной зоне по всей территории России от Кавказа до Дальнего Востока и имеет хорошо обеспеченную сырьевую базу. В настоящее время у малины обыкновенной заготавливают плоды для применения в качестве потогонного и жаропонижающего средства. Малина обыкновенная широко распространена в подлеске, где она не перспективна для заготовки плодов, но является огромным сырьевым источником подземных органов, которые издавна применялись в народной медицине и представляют интерес для внедрения в медицинскую практику. Подземные органы рода Rubus и их экстракты в экспериментах обладали противовоспалительной, гепатопротекторной, противораковой активностью [4, 7, 8, 10]. Наши прошлые исследования сухого водного экстракта малины обыкновенной корневищ с корнями позволили установить антидиабетическую активность, сравнимую по выраженности действия с метформином, одним из самых популярных антидиабетических препаратов [1, 2]. При поиске новых возможных видов активности, наше внимание привлекло исследование, где показано как экстракт листьев Rubus idaeus L. значительно ингибировал агрегацию тромбоцитов в крови, стимулированной аденозинтрифосфатом [5]. Представляло интерес, определить антиагрегантную активность малины обыкновенной корневищ с корнями. Антиагрегантоное действие растительного сырья и лекарственных растительных препаратов часто связывают с фенолами и полифенольными соединениями [3]. Поэтому, в задачи исследования было включено определение содержания дубильных веществ и полифенолов. В подземных органах рода Rubus обнаружены сапонины. В корнях растения Rubus innominatus S. Moore., производные олеаноловой, урсоловой кислот [4]. В подземных органах Rubus chingii Hu обнаружили урсоловую кислоту, эускафиновую кислоту, 11α-гидроксиэускафиновую кислоту [10]. Широкое распространение сапонинов в подземных органах рода Rubus дает основание для исследований по определению их содержания в подземных органах малины обыкновенной. Цель исследования - определение содержания биологически активных веществ и антиагрегантной активности малины обыкновенной корневищ с корнями. Методика Объектами исследования являлись корневища с корнями малины обыкновенной. Подземные органы собирали в октябре 2022 года. Данное сырье было собрано в подлеске смешанного и темнохвойного леса. Определение суммы полифенольных соединений проводили с реактивом Folin-Ciocalteu [6]. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 30 мл спирта этилового 60%. Колбу закрывали и взвешивали с погрешностью +0,01 г, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 40 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Колбу с содержимым охлаждали до комнатной температуры, закрывали пробкой, взвешивали с погрешностью +0,01 г и доводили массу спиртом этиловым 60% до первоначальной и перемешивали. Полученный экстракт центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 2500 об/мин. Затем готовили разведение экстракта в соотношении 1:1 (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 0,1 мл раствора А, прибавляли 0,5 мл реактива Folin-Ciocalteu, 10 мл воды очищенной и доводили объем раствора до метки 15% раствором натрия карбоната (раствор Б). Через 40 мин измеряли оптическую плотность полученного раствора Б на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 760 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения раствор, состоящий из 0,5 мл реактива Folin-Ciocalteu, 10 мл воды очищенной и доведенный 15% раствором натрия карбоната до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Содержание суммы фенольных соединений (Х) в пересчете на галловую кислоту и абсолютно сухое сырье, в процентах, вычисляли по формуле 1: , где C - содержание фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, найденное по калибровочному графику, в мг/мл; V - объем полученного извлечения, в мл; V1 - объем колбы (25 мл); V2 - объем пипетки (0,1 мл); 2 - разбавление; m - масса навески, в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья, в % Количественное определение содержания дубильных веществ проводили в соответствии с ОФС № 1.5.3.008.18 ГФ 14 издания титриметрическим методом, основанным на легкой окисляемости дубильных веществ раствором перманганата калия в присутствии индикатора индигосульфокислоты до золотисто-желтого окрашивания. Определение содержания процианидинов в малины обыкновенной корневищах с корнями проводили с помощью кислотного расщепления процианидинов до антоцианидинов по методу Портера [13]. Определение содержания сапонинов проводили по следующей методике: сырье измельчали до частиц размером 1 мм. Точную навеску около 1,0 экстрагировали 50 мл спирта этилового 70% в течение 1 часа на водяной бане. Спирт удаляли путем отгонки, после чего водный остаток обрабатывали 10 мл хлороформа. Хлороформную фракцию отделяли и отбрасывали. К очищенному водному остатку прибавляли 3 мл серной кислоты концентрированной и 12 мл уксусной кислоты ледяной. Содержимое колбы нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Образовавшиеся агликоны извлекали хлороформом трехкратно по 10 мл. Хлороформный слой промывали водой порциями по 20 мл в делительной воронке до рН=7. Хлороформ фильтровали через бумажный фильтр, на который помещали 2 г натрия сульфата безводного, в мерную колбу объемом 50 мл; фильтр промывали 10 мл хлороформа. Затем содержимое колбы доводили до метки хлороформом. В мерную пробирку помещали 0,4 мл фильтрата, хлороформ удаляли до сухого остатка при нагревании на водяной бане. К сухому остатку прибавляли серную кислоту, концентрированную до объема 5 мл. Смесь термостатировали при температуре 700°С в течение 1 часа. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см при λ=315 нм, в качестве раствора сравнения использовали серную кислоту концентрированную. Содержание суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту и абсолютно-сухое сырье вычисляли по формуле: , где А - значение оптической плотности; ε - удельный показатель поглощения олеаноловой кислоты, равный 311; m - масса сырья, г; V1 - объем извлечения, равный 50 мл; V2 - объем извлечения, взятый для разведения, равный 0,4 мл; V3 - объем разведения, равный 5 мл Эксперименты в условиях in vitro выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Общее количество доноров составило 11 человек. Забор крови для исследования соединений в отношении системы гемостаза проводился из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовался 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (ОАО ТНК «ДАСТАН», Киргизия). Исследование влияния на агрегацию тромбоцитов проводили по методу Born G.G. (1962) на агрегометре «АТ-02» (НПФ «Медтех», Россия). В качестве индукторов агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 мкг/мл и коллаген в концентрации 5 мг/мл производства «Технология-Стандарт» (Россия). Проводили оценку максимальной амплитуды агрегации, скорости агрегации, время достижения максимальной амплитуды и дезагрегацию в присутствии изучаемых соединений при агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ. При коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов оценивали латентный период, во время которого происходит активация фосфолипазы С (что приводит к образованию вторичных посредников, вследствие чего развивается секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А2). Исследуемый экстракт вносили в плазму из расчета 5% от объема реакционной смеси. Антиагрегационная активность пентоксифиллина и ацетилсалициловой кислоты представлена для концентрации 1×10-3 М/л. Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Выявлено, что вид распределения полученных данных отличается от нормального, поэтому при дальнейшей работе использовались непараметрические методы. Данные представлены в виде медианы, 25 и 75 процентилей. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05. Результаты исследования и их обсуждение На первом этапе работы с растительным сырьем проводят качественные реакции для определения групп биологически активных веществ. Поэтому, нами проведены качественные реакции с отваром малины обыкновенной корневищ с корнями. Отвар готовили в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XIV издания. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1. Качественные реакции на основные группы БАВ малины обыкновенной корневищ с корнями № п/п Группа БАВ Реакция Ожидаемый эффект Результат 1. Кумарины С 10% раствором NaOH (лактонная проба) 1-я пробирка с NaOH - желтый раствор 2-я пробирка - раствор мутнеет Отрицательно 2. Сапонины Пенообразования Образование устойчивой пены Устойчивая пена в пробирке с кислой средой (тритерпеновые сапонины) 3. Флавоноиды Проба Синода Оранжево-красное окрашивание Отрицательно С 2% раствором AlCl3 Желтое с желто-зеленой флуоресценцией Отрицательно 4. Фенольные соединения Реакция образования азокрасителя Окрашивание от оранжевого до вишнево-красного Красное окрашивание С раствором FeCl3, 3% Желто-оранжевое окрашивание 5. Дубильные вещества С 1% раствором ЖАК Черно-синее или черно-зеленое окрашивание Черно-синее окрашивание С 1% раствором желатина Муть или белый хлопьевидный осадок Муть 6. Полисахариды С 95% спиртом этиловым Белый хлопьевидный осадок Белый хлопьевидный осадок 7. Алкалоиды С реактивом Драгендорфа Оранжевый или красно-бурый осадок Отрицательно С реактивом Вагнера Бурый осадок Отрицательно С реактивом Бушарда Бурый осадок Отрицательно С пикриновой кислотой Желтый осадок Отрицательно По результатам качественных реакций в малины обыкновенной корневищах с корнями обнаружены сапонины, фенольные соединения, дубильные вещества и полисахариды. Флавоноиды были не обнаружены, эти данные согласуются с результатами высокоэффективной жидкостной хроматографии сухого водного экстракта малины обыкновенной корневищ с корнями [4]. Определение содержания сапонинов определяли в пересчете на олеаноловую кислоту. Ранее было установлено, что основным агликоном сапонинов в экстракте корневищ с корнями малины обыкновенной является олеаноловая кислота. На ВЭЖХ-УФ хроматограмме экстракта корневищ с корнями малины после гидролиза при 210 нм наблюдается максимум 18,2 мин., что совпадает со временем удерживания стандартного образца олеаноловой кислоты [4]. Результаты количественного определения основных групп БАВ представлены в табл. 2. Таблица 2. Содержание основных групп биологически активных веществ в малины обыкновенной корневищах с корнями № Группа БАВ Содержание в сырье, % 1. Сапонины 4,94±0,35 2. Дубильные вещества 9,76±0,95 3. Процианидины 2,17±0,2 4. Сумма фенольных соединений с реактивом Folin-Ciocalteu 7,36±1,34 В результате исследования установлено, что дубильные вещества являются основной группой биологически активных веществ в малины обыкновенной корневищах с корнями. Дубильные вещества представлены преимущественно гидролизуемой группой, на что указывает черно-зеленое окрашивание с 1% раствором ЖАК и не высокое содержание процианидинов, относящихся к конденсированной группе. Однако, следует учитывать, что окисляются перманганатом калия не только макромолекулы дубильных веществ, но и некоторые другие группы веществ. На следующем этапе исследования определяли влияние водного экстракта корневищ с корнями малины обыкновенной на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro. Результаты исследования представлены в табл. 3. Таблица 3. Влияние сухого водного экстракта малины обыкновенной корневищ с корнями на показатели агрегации тромбоцитов № Вещество Латентный период, % к контролю Макс. амплитуда, % к контролю Скорость агрегации, % к контролю Время достижения МА, % к контролю 1. Экстракт малины обыкновенной корневищ с корнями -1,3 (1,0-3,6) † -20,5 (17,4-21,7) *, #, † -30,4 (28,5-33,7) *, # +12,6 (10,5-14,7) *, † 2. Ацетилсалициловая кислота -2,1 (1,1-2,6) -13,7 (10,8-16,4) * -10,5 (7,6-12,3) * +10,5 (8,7-13,4) * 3. Пентоксифиллин +32,4 (28,7-5,6) **, ## -48,4 (42,7-56,5) **, ## -34,9 (28,7-39,6) ** +32,1 (27,6-36,4) **, # Примечание: *р<0,05 - в сравнении с контролем; #р<0.05 - в сравнении с ацетилсалициловой кислотой; †р≤0,05 - в сравнении с пентоксифиллином Установлено, что сухой водный экстракт малины обыкновенной корневищ с корнями проявляет антиагрегационную активность, которая проявляется удлинением lag-периода и снижением агрегации тромбоцитов. Исследуемый экстракт превосходит по уровню антиагрегационной активности ацетилсалициловую кислоту, которая выступала в качестве препарата сравнения. Заключение По результатам исследования установлено, что основными группами биологически активных веществ малины обыкновенной корневищ с корнями являются дубильные вещества, сапонины. В сырье преобладают дубильные вещества гидролизуемой группы. Сухой водный экстракт малины обыкновенной корневищ с корнями обладает антиагрегантным действием, превосходящим по силе ацетилсалициловую кислоту.

Об авторах

Дмитрий Константинович Гуляев

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент, доцент кафедры фармакогнозии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Валентина Дмитриевна Белоногова

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой фармакогнозии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Ирина Дмитриевна Крылова

Башкирский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
студентка педиатрического факультета ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 450008, Уфа, ул. Ленина, 3

Гульшат Ралифовна Юлмухаметова

Башкирский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
ассистент кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 450008, Уфа, ул. Ленина, 3

Чынара Саидовна Курбанова

Башкирский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
ассистент кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 450008, Уфа, ул. Ленина, 3

Список литературы

Дополнительные файлы