СРАВНЕНИЕ МЕТОДА ДИФФУЗИИ В АГАР И БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ

Полный текст

Введение Одним из важнейших показателей в оценке качества лекарственной биопродукции является биологическая активность [1, 8, 17]. Для антибиотиков - это антимикробное действие, которое проявляется в способности убивать или ингибировать рост и размножение микроорганизмов [9, 10, 18]. Определение данного параметра проводится с использованием диффузионных подходов, таких как Е-тесты, диффузия из лунок в агаре, из агаровых блоков, методом серийных разведений и турбидиметрией [12-16]. Данные методы используют тест-микроорганизмы, чувствительных к воздействию различных химических веществ, в частности антибиотиков. В современной практике наиболее часто применяют метод диффузии в агар, основанный на диффузии противомикробного агента в питательную среду с микроорганизмами и дальнейшем сравнении зависимости степени угнетения роста тест-штамма от класса и концентрации антибиотика [2]. Основным преимуществом данного метода является простота, обусловленная отсутствием необходимости применения специального оборудования, а также возможность тестировать большое количество образцов. Тем не менее, подход трудоемок, так согласно ГФ РФ XIV издания, требует большого количества расходного материала, затрачиваемого для изготовления питательных сред, отличного состава для каждого тест-штамма, чувствительного к испытуемому антибиотику [2]. Особое значение имеет то, что для фармакопейного метода рекомендованы тест-микроорганизмы, отнесенные, в соответствии санитарными правилами Российской Федерации и принятой классификацией Всемирной организации здравоохранения, к различным группам патогенности [6]. Вследствие этого, анализ с использованием данного подхода требует наличие высокоспециализированного персонала и специальных условия для его реализации. В настоящее время в исследованиях в области биологии, медицины и экологии нашли применение подходы на основе бактериальной биолюминесценции. Светящие микроорганизмы используют в качестве биотестов при мониторинге загрязнения окружающей среды, оценки биологической активности, в том числе антимикробной активности веществ [4-6]. Суть метода заключается в измерении светоизлучения бактерий, образующегося за счет ферментативной реакции, катализируемой люциферазой [3]. Подход прост в использовании, характеризуется быстротой получения результатов анализа, высокой чувствительностью и точностью полученных результатов анализа [3, 11]. Достоинства биолюминесцентного метода обусловлены использованием для измерения светоизлучения современной электронно-оптической техники, преобразующей световой сигнал в электрический [3]. Цель исследования - сравнение метода диффузии в агар и подходов на основе бактериальной биолюминесценции при определении антимикробной активности антибиотиков. Методика В работе использовали 10 фармацевтических субстанций антибиотиков различных химических структур: производные 6-аминопенициллановой кислоты - ампициллин (ОАО «Синтез», Россия, серия 1540815), бензилпенициллин натрия (ОАО «Синтез», Россия, серия 230310) и пенициллин G (SANDOZ, GmbH, Австрия, серия 147305); производные нафтацена - доксициклина (ОАО «Синтез», Россия, серия 03211) и тетрациклина (ВАТ «Вітаміни», Украина, серия 10409) гидрохлориды; аминогликозиды (АГ) - гентамицина (ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, серия 20509) и стрептомицина (ВАТ «Київмедпрепарат», Украина, серия 170410) сульфаты; производные 7-аминоцефалоспорановой кислоты - цефотаксим (ЗАТ НВЦ «Борщаговский химико-фармацевтический завод», Украина, серия 120907), цефепим (ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, серия 10110) и цефтриаксон (ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, серия CN10110). Оценку антимикробной активности антибиотиков проводили двумя методами с использованием тест-штамма, показавшего наибольшую чувствительность к антибиотикам, Photobacterium leiognathi Sh1 из коллекции Института биохимических технологий, экологии и фармации ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» [4, 5, 7]. Оценку диффузии антибиотиков в агар и их влияния на тест-штамм P. leiognathi Sh1 проводили поэтапно. В подготовленные чашки Петри с твердой питательной средой (Nutrient agar M001, Himedia, Индия) с лунками засевали культуру тест-штамма и инкубировали в термостате ТСО-1/80 (СПУ, Россия) при 25 0 С в течении 2-х часов для уменьшения влияния колебаний во времени перед внесением исследуемых веществ [2. Затем в лунки добавляли по 150 мкл растворов антибиотиков в концентрациях от 1 до 10 мкг/мл, приготовленных путем растворения лиофилизированных порошков, исследуемых фармацевтических субстанций, в 3 % водном растворе натрия хлорида, который использовали и в качестве контрольного образца. Чашки с культурой P. leiognathi Sh1 и внесенными растворами антибиотиков инкубировали при температуре 25 0С около 16-18 часов [2, 4]. Анализ результатов диффузии противомикробного агента проводили путем измерения диаметра зон подавления роста тест-штамма P. leiognathi Sh1 с помощью микрометра. Анализ, основанный на бактериальной биолюминесценции, проводили в отношении тест-штамма P. leiognathi Sh1 по методике [7]. Интенсивность свечения оценивали с использованием биохемилюминометра БХЛ-06 (НПО «Биофармавтоматика», Н. Новгород, Россия) и LumiShot (Красноярск, Россия) через 15, 30 минут и 18 часов. Сравнение методов проводили между параметрами - зоной задержки роста (d, мм), для метода диффузии в агар, и биолюминесцентным индексом (БЛИ, %), для метода на основе бактериальной люминесценции, который находят по формуле: БЛИ= Ii/I0 × 100%, где где Ii - интенсивность люминесценции бактерий в опытной пробе, I0 - интенсивность свечения бактерий в контроле [3]. Статистическую обработку полученных результатов проводили согласно требований Государственной фармакопеи РФ XIV издания с применением ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов эксперимента» и ОФС.1.1.0014.15 «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами» [2]. Для сравнения результатов, полученных двумя методами, рассчитывали коэффициент корреляции Карла Пирсона, применяемый для исследования взаимосвязи двух переменных одной выборки. Данный статистический метод позволяет определить наличие или отсутствие линейной связи между двумя анализируемыми методами при нормальном распределении каждой из сопоставляемых переменных. Значения коэффициента корреляции Пирсона варьировали от -1 до 0, так как для сопоставляемых методов характерна обратная взаимосвязь величин. Расчёты проводили с использованием программы Microsoft Excel. Результаты исследования и их обсуждение В ходе исследования влияния 10-ти антибиотиков на тест-штамм P. leiognathi Sh1 биолюминесцентным методом обнаружено, что все антибиотики снижали интенсивность свечения в исследуемых концентрациях от 1 до 10 мкг/мл, что характеризовалось уменьшением величины БЛИ при увеличении концентрации антимикробного агента в пробе. Тетрациклин подавлял рост микроорганизмов уже при концентрации 0,01 мкг/мл (рис. 1). Зависимости интенсивности биолюминесценции от концентраций испытуемых антибиотиков были выражены экспоненциальной и описывались уравнениями (табл. 1). Так для производного 6-аминопенициллановой кислоты бензилпенициллина зависимость была выражена уравнением y= 85,184e-0,086x, где х - концентрация определяемого вещества; y - значение БЛИ. Коэффициент достоверности аппроксимации (R2) составил 0,91. Экспоненциальная зависимость с высоким значениями R2 были характерны также для производных других групп антибиотиков. Для получения линейной зависимости значения интенсивности люминесценции были логарифмированы. Уравнения линейных прямых представлены в табл. 1 с указанием R2 Рис. 1. Графики зависимости интенсивности биолюминесценции, выраженного в БЛИ (%), от концентрации антибиотиков в хроническом (24 часа) воздействии, где а - ампициллин, б - бензилпенициллин, в - пенициллин G, г - тетрациклин, д - доксициклин, е - стрептомицин, ж - гентамицин, з - цефепим, и - цефтриаксон, к - цефотаксим Таблица 1. Уравнения зависимости БЛИ (%) от С (мкг/мл) антибиотиков через 24 часа Антибиотик Уравнение экспоненциальной прямой R2 Уравнение Линейной зависимости R2 Ампициллин y= 95,75e-0,072x 0,91 y= -0,0722x + 4,5617 0,89 Бензилпенициллин y= 85,184e-0,086x 0,88 y= -0,0859x + 4,4448 0,92 Пенициллин G y= 74,36e-0,191x 0,86 y= -0,1907x + 4,3089 0,94 Доксициклин y= 79,481e-0,691x 0,95 y= -0,6913x + 4,3755 0,98 Тетрациклин y= 88,918e-7,253x 0,87 y= -7,2529x + 4,4877 0,92 Стрептомицин y= 55,91e-0,347x 0,90 y= -0,3471x + 4,0237 0,87 Гентамицин y= 151,37e-0,403x 0,82 y= -0,4031x + 5,0197 0,87 Цефепим y= 70,39e-0,304x 0,94 y= -0,3036x + 4,254 0,92 Цефтриаксон y= 51,271e-0,332x 0,87 y= -0,3319x + 3,9371 0,83 Цефотаксим y= 52,871e-0,322x 0,89 y= -0,3218x + 3,9679 0,76 Оценка БЛИ для антибиотиков производных нафтацена, а именно, тетрациклина, показала наибольшую антимикробную активность. При концентрации 1 мкг/мл интенсивность люминесценции составила 5,1±0,03 (табл 1). Наибольшую антимикробную активность из аминогликозидов показал гентамицин, значение БЛИ которого при концентрации 1 мкг/мл составило 11,6% при полуширине доверительного интервала 2,3%. Из производных 7-аминоцефалоспорановой кислоты наибольшую активность в отношении тест-штамма микроорганизмов продемонстрировал цефтриаксон. Однако, данный антибиотик не показал экспоненциальной зависимости БЛИ от концентрации. Так, при концентрации 1 мкг/мл значение БЛИ составило 10,9±0,8 %, а при 2 мкг/мл - 16,5±0,9 %. Дальнейшее увеличение концентрации до 4, 5 и 10 мкг/мл приводит к значениям 8,6±0,7 %, 10,8±0,8 % и 7,4±3,2 % соответственно. Прогнозируемые доверительные интервалы варьировали от 0,03 до 4,4 % для антибиотиков с концентрациями 1 мкг/мл, от 0,1 до 2,5 % - 10 мкг/мл. Для расчета доверительных интервалов определяли среднее значение и стандартное отклонение аналитического сигнала, выраженного интенсивностью свечения, для каждого значения концентрации антибиотиков. Таблица 2. Результаты оценки антимикробной активности антибиотиков биолюминесцентным методом с использованием тест-штамма P. leiognathi Sh1 Наименование субстанции Концентрация, мкг/мл 0 1 2 4 5 10 Ампициллин 100±3,2 92,5±2,9 87,8±2,8 66,2±2,1 57,4±1,8 51,0±1,6 Бензилпенициллин 100±3,2 74,9±2,4 65,8±2,1 57,6±1,8 52,7±1,7 38,5±1,3 Пенициллин G 100±10 51,6±4,1 47,4±4,7 30,4±3,0 28,4±2,6 12,1±1,2 Доксициклин 100±5,3 29,7±2,4 18,7±1,07 6,2±0,3 2,3±0,1 0 Стрептомицин 100±3,5 46,6±1,6 22,4±0,8 8,9±0,3 5,7±0,2 2,8±0,1 Гентамицин 100±4,6 72,9±4,4 64,3±4,3 58,7±3,7 40,6±3,9 1,5±2,5 Цефепим 100±6,2 57,2±3,6 33,3±2,03 18,1±1,1 9,6±0,6 4,6±0,3 Цефтриаксон 100±3,2 39,6±1,3 23,7±0,8 6,9±0,2 5,9±0,2 3,1±0,1 Цефотаксим 100±9,2 42,8±3,9 27,6±2,5 10,6±0,9 3,6±0,4 4,1±0,4 Наименование субстанции Концентрация, мкг/мл 0 0,01 0,05 0,1 0,5 1 Тетрациклин 100±0,6 73,2±0,03 60,9±0,01 43,9±0,01 0 0 В ходе исследования влияния 10-ти антибиотиков на тест-штамм P. leiognathi Sh1 методом диффузии в агар обнаружено, что все исследуемые вещества вызывали угнетение роста тест-микроорганизмов под действием различных концентраций при полуширине доверительного интервала d равной±0,1 мм. Результаты представлены в табл. 2. Таблица 3. Результаты оценки зоны задержки роста тест-штамма P. leiognathi Sh1 после диффузии противомикробного агента в агар Наименование субстанции Концентрация, мкг/мл 0 1 2 4 5 10 Пенициллин G 0 5,9 6,5 6,1 7,2 10,0 Тетрациклин 0 4,7 5,8 6,2 7,2 8,1 Доксициклин 0 6,6 11 11,9 12,1 16,8 Стрептомицин 0 3,4 5,4 6,6 7,4 12,6 Гентамицин 0 4,0 3,5 3,5 4,4 4,8 Цефепим 0 12,3 10,3 11 14,8 15,3 Цефтриаксон 0 16,6 16,3 18,6 22,5 23,2 Цефотаксим 0 3,4 3,5 3,6 4,2 4,7 Результаты тестирования антибиотиков стандартным фармакопейным методом показали увеличение диаметров зон угнетения роста микроорганизмов от увеличения концентрации антимикробных агентов. Так из группы производных 6-аминопенициллановой кислоты наибольшей антимикробной активностью характеризовался пенициллин G поскольку d составило 5,9 мм при концентрации антибиотика 1 мкг/мл, а при максимальной исследованной концентрации 10,0 мм. Из производных нафтацена доксициклин оказывал наибольшее влияние на рост тест-микроорганизмов штамма на P. leiognathi Sh1. При этом d зон задержки роста составили 6,6 мм для концентрации 1 мкг/мл и 16,8 мм при 10 мкг/мл. Из аминогликозидных антибиотиков наибольшим угнетением роста на поверхности агаризованной питательной среды характеризовался гентамицин с d= 4,0 мм при концентрации вещества в пробе 1 мкг/мл. Однако, при увеличении концентрации антибиотика до 10 мкг/мл наибольшее значение зоны задержки роста показал стрептомицин, d составил 12,6 мм. Из производных 7-аминоцефалоспорановой кислоты цефтриаксон характеризовался наибольшей антимикробной активностью в отношении тест-штамма. d составило от 16,6 мм при 1 мкг/мл антибиотика в лунке до 23,2 мм при концентрации 10 мкг/мл. Для сравнения метода диффузии в агар и биолюминесцентного анализа при определении антимикробной активности антибиотиков были рассчитаны коэффициенты корреляции, которые характеризовали степень сходимости результатов. Корреляционный анализ результатов показал наибольшую сходимость для пенициллина G, тетрациклина, доксициклина, гентамицина, цефтриаксона и цефотаксима. Коэффициенты корреляции Карла Пирсона для антибиотиков составили -0,98; -0,98; -0,94; -0,99; -0,97 и -0,93. Хорошую корреляцию показали бензилпенициллин, стрептомицин и цефепим, коэффициенты корреляции которых соответственно составили -0,88, -0,86 и -0,89. А также ампициллин и цефазолин, для которых коэффициенты составили -0,68 и -0,59. Данные могут свидетельствовать о корреляции результатов, полученных в следствии сравнения двух методов, а также применимости биолюминесцентного анализа для оценки их антимикробной активности в отношении тест-штамма P. leiognathi Sh1 для испытуемых субстанций. Заключение В результате экспериментально подтверждена применимость подходов на основе бактериальной биолюминесценции для определения антимикробной активности антибиотиков для пенициллина G, тетрациклина, доксициклина, стрептомицина, гентамицина, цефепима, цефтриаксона и цефотаксима. Методика определения антимикробной активности биолюминесцентным анализом в сравнении с методом диффузии в агар позволила сократить время на проведение исследования, в том числе, исключить необходимость длительной подготовки питательных сред и инкубирования на них микроорганизмов.

Об авторах

Селина Ягьяевна Османова

Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт им. С.И. Георгиевского Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского»

Email: email@example.com
аспирант обучения кафедры медицинской и фармацевтической химии Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт им. С. И. Георгиевского федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» Россия, 295007, Симферополь, бул. Ленина, 5/7

Сергей Леонидович Сафронюк

Институт биохимических технологий, экологии и фармации федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский Федеральный университет им. В.И. Вернадского»

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры медицинской и фармацевтической химии Института биохимических технологий, экологии и фармации федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» Россия, 295007, Симферополь, бул. Ленина, 5/7

Амет-хан Бекирович Кияев

Институт биохимических технологий, экологии и фармации федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский Федеральный университет им. В.И. Вернадского»

Email: email@example.com
аспирант обучения кафедры медицинской и фармацевтической химии Институт биохимических технологий, экологии и фармации федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» Россия, 295007, Симферополь, бул. Ленина, 5/7

Андрей Моисеевич Кацев

Институт биохимических технологий, экологии и фармации федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский Федеральный университет им. В.И. Вернадского»

Email: email@example.com
доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой медицинской и фармацевтической химии Института биохимических технологий, экологии и фармации федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» Россия, 295007, Симферополь, бул. Ленина, 5/7

Список литературы

Дополнительные файлы