РАЗРАБОТКА СОСТАВА ПЛЕНОК СЕКСТАФАГ® ПИОБАКТЕРИОФАГ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ НА ОСНОВЕ МЕТОДА МНОГОКРИТЕРИАЛЬНОЙ ОПТИМИЗАЦИИ

Полный текст

Введение Эпидемиологическая ситуация, связанная с распространением и ростом смертности от инфекционных болезней в мире, в последние десятилетия остается напряженной [1]. Стандартизированный коэффициент смертности от заболеваний инфекционной природы в РФ последние 30 лет вырос в 1,8 раза [9]. Стратегия борьбы с антибиотикорезистентными штаммами микроорганизмов включает задачи по разработке новых биотехнологических антибактериальных лекарственных препаратов. В качестве альтернативы антибиотикам предлагается использование бактериофагов, характеризующихся специфичностью к бактериальным клеткам и высокой эффективностью для профилактики и лечения многих бактериальных инфекций, в том числе вызванных антибиотико-резистентными возбудителями [2, 4, 7, 10-12]. Лечебно-профилактические бактериофаги - это активная фармацевтическая субстанция биологического происхождения, обладающая строгой специфичностью литического действия в отношении патогенных микроорганизмов. не угнетают нормальную микрофлору, не подавляют иммунной защиты, не обладают токсическим действием и не вызывают аллергизации [14]. Современные тенденции промышленной фармации направлены на разработку систем локальной доставки активной фармацевтической субстанции с модифицированным высвобождением. К таким системам локальной доставки относят твёрдую дозированную лекарственную форму - пленки. Биодеградируемые плёнки прочно фиксируются на поврежденных тканях слизистой оболочки, набухают и модифицированно высвобождают активную фармацевтическую субстанцию из биосовместимой полимерной матрицы. Целью работы являлась разработка состава пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный математическим методом планирования многокритериальной выборки по аддитивному критерию оптимальности. Методика Объектом исследования являлся комбинированный бактериофаг Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, представляющий собой смесь в равных соотношениях стерильных фильтратов шести фаголизатов бактерий Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Escherichia coli. В качестве формообразователей использовали 12 биодеградируемых полимеров природного и синтетического происхождения: гидроксипропилметилцеллюлозу (ТУ 2231-001-71806407-2005), желатин пищевой (ГОСТ 23058-89), карбопол (ТУ 6-02-1181118-83), крахмал картофельный (ГОСТ Р 53876-2010), метилцеллюлозу марки 15 (ТУ 2231-107-05742755-96), метилцеллюлозу марки 35 (ТУ 2231-107-05742755-96), натрий-карбоксиметилцеллюлозу (ТУ 6-55-39-90 70-450«О»), натрия альгинат (ФС 42-3383-97), оксипропилметилцеллюлозу (ВФС 42-187-73), пектин цитрусовый (ГОСТ 29186-91), пектин яблочный (ГОСТ 29186-91), поливиниловый спирт 7/2 (ГОСТ 10779-78). Пластификатор - глицерин (ГОСТ 6824-96). Модельные образцы пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный получали методами воздушного высушивания в термостате при температуре 37±1°С. Полученные пленки на основе различных биодеградируемых полимеров представляли собой однородные пластины различных оттенков размером 1×1 см, эквивалентные 5 мл коммерческого препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный в форме раствора. Специфическую (литическую) активность бактериофагов (БФ) оценивали по методу Аппельмана (отрицательная степень десятичного разведения от 10-3 до 10-6, вызывающая полный лизис культуры) согласно ОФС.1.7.1.0002.15 «Бактериофаги». Значения вычисляли в процентах, сопоставляя суммарное количество баллов по отношению к контролю (Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, раствор) [14]. Релиз (высвобождение) бактериофагов из пленок определяли in vitro методом диффузии в агар на плотной питательной среде. На чашки Петри с плотной питательной средой согласно ОФС.1.7.1.0002.15 «Бактериофаги» засевали бактериальную культуру тест-штаммов микроорганизмов: Staphylococcus (aureus, epidermidis), Streptococcus (pneumoniae, agalactiae, pyogenes), Proteus (mirabilis, vulgaris), Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli. Образцы пленок с иммобилизованным Секстафагом площадью 1 см2 накладывали на поверхность тест-системы и термостатировали в течении 24 часов при температуре 37±1°С. Фаголизабельность оценивали визуально по четырехбалльной шкале (по количеству «крестов») согласно Методическим рекомендациям МР 3.5.1.0101-15: «-» отсутствие литической активности; «+» низкая активность; «++» образование зоны лизиса с большим количеством колоний вторичного роста бактерии; «+++» зона лизиса с единичными колониями вторичного роста; «++++» прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста. Значения вычисляли в процентах, сопоставляя суммарное количество баллов по отношению к контролю (Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, раствор). Фармакокинетику бактериофагов изучали in vitro методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану по Крувчинскому. В качестве диализной среды для бактериофагов использовали стерильную воду очищенную. Прибор помещали в термостат, в котором поддерживали температуру 37°С. Диализат в приемнике заменяли стерильной водой очищенной каждые 30 мин. в течение 360 мин. Наличие бактериофага в пробах диализата изучали на микроорганизмах: Staphylococcus (aureus, epidermidis), Streptococcus (pneumoniae, agalactiae, pyogenes), Proteus (mirabilis, vulgaris), Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli. Диализат наносили капельно на чашку Петри с плотной питательной средой и бактериальной культурой тест-штамма. После выдерживания в термостате в течении суток при температуре 37°С визуально оценивали результаты по наличию «+» лизиса или фаговых колоний и «-» по активному росту культуры. Адгезионные свойства полимерных пленок по способности прилипать к поверхности слизистой определяли с помощью равноплечих тарирных весов по адаптированной методике [6]. На левой чаше весов фиксировали стеклянную пластину размером 3,0×7,5 см. Снизу под той же чашей крепили аналогичную пластину. На правую чашу помещали емкость для воды, над которой устанавливали цилиндр с краном. Перед работой весы уравновешивали. Образец размером 1×1 см помещали на поверхность нижней пластины с предварительно нанесенной с помощью микропипетки каплей воды очищенной (0,05 мл). Пленку накрывали верхней пластиной и прижимали стандартным грузом массой в 100 граммов в течение 10 секунд. Затем, сняв груз, открывали кран мерного цилиндра. При этом вода из крана должна вытекать равномерно, с постоянной скоростью. В момент отклеивания образца от стеклянной пластинки кран закрывали и замеряли массу жидкости, оторвавшей пленку от субстрата. Результаты измерений выражали силой отрыва (F) в ньютонах (Н×10-3), которую рассчитывали по формуле: , где: F - сила отрыва, Н; m - масса жидкости, оторвавшей пленку от субстрата, г; g - ускорение свободного падения, м/с2. Оптимизацию состава пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный проводили с использованием методов математического планирования: 1. Многокритериальная выборка по аддитивному критерию оптимальности для скрининга пленкообразователя [3, 8]. Аддитивный критерий оптимальности - это метод, при котором целевая функция образуется путём сложения нормированных значений частных критериев с учётом их относительной важности. Критерий оптимальности - это критерий выбора элемента из некоторого множества, наилучшим образом удовлетворяющий некоторым условиям [15]. Вес критерия рассчитывали по формуле: , где: λj - вес (важность) j-го частного критерия. Аддитивный критерий оптимальности (обобщенная функция цели), рассчитывали по формуле: , где F(aij) - аддитивный критерий оптимальности; λj - вес (важность) j-го частного критерия; aij - значение частного (локального) критерия. 2. Принцип Парето для оптимизации пластифицирующих свойств пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный. Множество Парето включало анализ критериев стабильности комбинированного бактериофага при воздушном высушивании (специфическая активность) и по силе адгезии полимерных биоматричных систем [13]. Статистическую обработку результатов проводили и анализировали методами вариационной статистики в соответствии с ОФС.1.1.0013 «Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний». Результаты статистической обработки многократных последовательных измерений одного показателя представлены в виде среднего арифметического и граничные значения доверительного интервала (X±∆X) [5]. Компьютерная обработка проводилась с использованием электронных таблиц «Exсel» и программы «Biostat» для Windows, версия 4.03. Результаты исследования и их обсуждение Первостепенной задачей создания инновационного лекарственного средства Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный в форме пленок модифицированного высвобождения является скрининг оптимального матричного носителя (пленкообразователя) биологически активной фармацевтической субстанции. Многокритериальная выборка по аддитивному критерию оптимальности включает определение значения частных критериев технологических и биофармацевтических характеристик полимеров. Изучены 12 модельных биодеградируемых пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный. Критериями отбора пленкообразователей являлись 4 частных критерия: специфическая (литическая) активность секстафага в пленке, релиз, диализ, адгезия (табл. 1). Таблица 1. Биофармацевтические свойства полимерных систем с бактериофагом № Полимер Специфическая активность, % Релиз, % Диализ AUC0-6 Адгезия, (X±∆X), Н 1 Пектин цитр., 18 33 0,27 3,0±0,1 2 Пектин ябл., 22 39 0,27 3,1±0,1 3 Карбопол 65 83 24,23 3,0±0,1 4 Натрия альгинат 34 61 6,61 3,0±0,1 5 Оксипропилметилцеллюлоза 52 50 11,10 3,5±0,1 6 Желатин 100 89 19,41 3,4±0,1 7 Крахмал 78 44 12,02 3,0±0,1 8 Спирт поливиниловый 65 89 26,68 2,0±0,1 9 Метилцеллюлоза-15 90 89 22,57 3,2±0,1 10 Метилцеллюлоза-35 92 78 24,65 3,3±0,1 11 Гидроксипропилметилцеллюлоза 48 44 11,10 3,1±0,1 12 Натрий карбоксиметилцеллюлоза 66 72 23,95 3,5±0,1 Примечание: AUC0-6 - площадь под фармакокинетической кривой, начиная с нулевого значения времени до времени отбора образца диализата через 6 ч. после начала эксперимента; расчет площади под фармакокинетической кривой (AUC0-6) производился по методу обычных трапеций В зависимости от природы полимерной матрицы специфическая (литическая) активность компонентов комбинированного бактериофага Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный в пленках варьировала от 18 до 100%. У пленок на основе оксипропилметилцеллюлозы, карбопола, поливинилового спирта, натрий-карбоксиметилцеллюлозы, крахмала картофельного, метилцеллюлозы марки 35, метилцеллюлозы марки 15 и желатина пищевого стабильность бактериофагов после воздушного высушивания составила более 50%. Изучение биологической доступности фагов из пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный методом диффузии в агаровый гель показало, что все изученные образцы являются релиз-активными. Выявлено, что высвобождение стафилококкового бактериофага, стрептококкового, протейного, синегнойного, энтерококкового, клебсиеллезного, фага кишечной палочки происходит путем сочетания двух процессов: диффузии и биодеградации. Релиз-активными полимерными матричными системами с высоким показателем высвобождения иммобилизованных бактериофагов являются следующие пленкообразователи - желатин, карбопол, метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и спирт поливиниловый. Исследования фармакокинетики методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану показало, что стрептококковый, стафилококковый, синегнойный, клебсиеллезный, протейный и фаг кишечной палочки диффундируют через диализную мембрану и обнаруживаются в диализной среде. У модельных пленок релиз комбинированного бактериофага, иммобилизованного в полимерную матрицу, наблюдали в диапазоне 210÷240 мин., а из раствора в течение 150 мин. Данные кинетики свидетельствуют о модифицированном характере высвобождения бактериофага из пленок. Определение адгезионных свойств у модельных пленок показало, что показатели адгезии для изученных полимеров оказались относительно близки и входили в интервал значений 3,0÷3,5 Н. Высокий показатель адгезии наблюдали у образцов на основе натрий карбоксиметилцеллюлозы - 3,5±0,1 Н, оксипропилметилцеллюлозы - 3,5±0,1 Н, желатина - 3,4±0,1 Н, метилцеллюлозы марки 15 - 3,3±0,1 Н. Наименьшие адгезионные свойства проявились у образцов на основе пектина цитрусового - 3,0±0,1 Н, карбопола 3,0±0,1 Н, натрия альгината - 3,0±0,1 Н, крахмала - 3,0±0,1 Н, спирта поливинилового - 2,0±0,1 Н. В результате изучения 4 частных критериев (специфическая активность, релиз, диализ, адгезия) 12 биодеградируемых модельных пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный проведена нормализация 4 аддитивных критериев оптимальности для 12 полимерных матриц с комбинированным бактериофагом, которая представлена в табл. 2. Таблица 2. Нормализация аддитивных критериев оптимальности для полимерных матриц с комбинированным бактериофагом № Полимерные матрицы (n=12) Критерии оптимальности (К) (n=4) К1 К2 К3 К4 Специфическая активность БФ, % Релиз, % Диализ AUC0-6 Адгезия, Н 1 Пектин цитр., 18/100=0,1800 33/89=0,3708 0,27/26,68=0,0101 3,0/3,5=0,8571 2 Пектин ябл., 22/100=0,2200 39/89=0,4382 0,27/26,68=0,0101 3,1/3,5=0,8857 3 Карбопол 65/100=0,6500 83/89=0,9326 24,33/26,68=0,9119 3,0/3,5=0,8571 4 Натрия альгинат 34/100=0,3400 61/89=0,6854 6,61/26,68=0,2478 3,0/3,5=0,8571 5 Оксипропил-метилцеллюлоза 52/100=0,5200 50/89=0,5618 11,10/26,68=0,4160 3,5/3,5=1,0000 6 Желатин 100/100=1,0000 89/89=1,0000 19,41/26,68=0,7275 3,4/3,5=0,9714 7 Крахмал 78/100=0,7800 44/89=0,4944 12,02/26,68=0,4505 3,0/3,5=0,8571 8 Спирт поивиниловый 65/100=0,6500 89/89=1,0000 26,68/26,68=1,0000 2,0/3,5=0,5714 9 Метилцеллюлоза-15 90/100=0,900 89/89=1,0000 22,57/26,68=0,8460 3,2/3,5=0,9143 10 Метилцеллюлоза-35 92/100=0,9200 78/89=0,8764 24,65/26,68=0,9239 3,3/3,5=0,9429 11 Гидроксипропил-метилцеллюлоза 48/100=0,4800 44/89=0,4944 11,01/26,68=0,4127 3,1/3,5=0,8857 12 Натрий карбокси-метилцеллюлоза 66/100=0,6600 72/89=0,8090 23,95/26,68=0,8977 3,5/3,5=1,0000 Вес критерия, λj 0,25 0,25 0,25 0,25 Значение max 100 89 26,68 3,5 Вес критериев, удовлетворяющих по биофармацевтическим характеристикам, оценили в равнозначной пропорции λj = 0,25. Максимальная эффективность К1 (специфическая активность комбинированного бактериофага) составила 100%, К2 (релиз, %) - 89%, К3 (диализ) - 26,68, К4 (адгезия) - 3,5 Н. Результаты расчета аддитивного критерия оптимальности для полимерных матриц с комбинированным бактериофагом Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный в соответствии с критерием max эффективности представлены на рис. 1. Рис. 1. Аддитивный критерий оптимальности для полимерных матриц с комбинированным бактериофагом Из представленных данных видно, что оптимальными показателями обладают полимерные матрицы с комбинированным бактериофагом Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный №6 - желатин пищевой (F6 = 0,9247); №10 - метилцеллюлоза марки 35 (F10 = 0,9158), №9 - метилцеллюлоза марки 15 (F9 = 0,9151). Наибольшему значению аддитивного критерия оптимальности соответствует полимер F6 желатин пищевой. На втором этапе осуществляли пластификацию пленок путем подбора оптимального соотношения пластификатора глицерина и пленкообразователя. Для этого в биомассу раствора комбинированного бактериофага с желатином добавляли глицерин в количестве 10%, 20%, 30% от веса желатина пищевого. Далее формование пленок осуществляли, как описано ранее. В табл. 3 представлено влияние содержания количества полимера (желатина) и пластификатора (глицерина) на биофармацевтические характеристики модельных пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный. Таблица 3. Биофармацевтические характеристики модельных пленок на основе желатина № Состав рецептуры, об.ч. Биофармацевтические характеристики Желатин Глицерин Вода очищенная Секстафаг Средняя специфическая активность по секстафагу, титр Адгезия (Х±ΔХ), Н 1 5 0,5 54,5 40 10-4,90 4,55±0,34 2 5 1,0 54,0 40 10-4,90 5,21±0,42 3 5 1,5 53,5 40 10-4,90 5,70±0,51 4 5 2,0 53,0 40 10-4,90 6,15±0,52 5 10 1,0 49,0 40 10-4,53 5,73±0,62 6 10 2,0 48,0 40 10-4,38 5,84±0,67 7 10 3,0 47,0 40 10-4,16 6,03±0,65 8 10 4,0 46,0 40 10-4,14 6,10±0,62 9 15 1,5 43,5 40 10-4,30 5,60±0,61 10 15 3,0 42,0 40 10-4,12 5,82±0,65 11 15 4,5 40,5 40 10-4,05 5,95±0,62 12 15 6,0 39,0 40 10-3,94 5,98±0,64 Оптимизацию состава полимерной биоматрицы проводили по принципу Парето по анализу критериев стабильности комбинированного бактериофага при воздушном высушивании и по адгезии модельных пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный (рис. 2). Оптимальную биосовместимую плёнкообразующую основу по многокритериальным показателям выбирали среди множества Парето. В качестве критериев оптимизации использовали показатель адгезии полимерных матричных систем (ось x, x → max) и специфической активности бактериофагов в пленках лекарственных Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный (ось y, y → max). Доминирующие биофармацевтические характеристики по критериям оптимизации выявлены у модельных пленок состава №4 (желатин - 5,0; глицерин - 2,0; Секстафаг® - 40,0; вода очищенная - 53,0). Рис. 2. Многокритериальная оптимизация состава пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный по принципу Парето Заключение В результате проведенных комплексных технологических, биофармацевтических и микробиологических исследований с использованием методов математического планирования разработан оптимальный состав модифицированных пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, обладающих антибактериальным действием в отношении бактерий Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Escherichia coli.

Об авторах

Наталья Анатольевна Ковязина

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Алевтина Максимовна Николаева

Пермская государственная фармацевтическая академия

Email: email@example.com
доктор биологических наук, профессор кафедры промышленной технологии с курсом биотехнологии ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Россия, 614990, Пермь, ул. Полевая, 2

Список литературы

Дополнительные файлы