POTENTIAL MARKER OF CHRONIC PAIN STRESS

Full Text

Введение Стресс-индуцированные нарушения представляют собой серьёзную медико-социальную проблему современности. По данным ВОЗ [14], распространенность психосоматических и психических расстройств, ассоциированных с дезадаптацией к стрессу, неуклонно растет во всем мире. Хронический стресс запускает комплексные нейроэндокринные и иммунные сдвиги, которые со временем приводят к развитию целого каскада патологических изменений. Гиперактивация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси с повышением глюкокортикоидов, катехоламинов, а также изменение баланса между стресс-реализующими и стресс-лимитирующими системами (симпатической и парасимпатической системами соответственно) нарушают гомеостатические процессы [1]. Это сопровождается снижением функциональной активности Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, гиперпродукцией провоспалительных цитокинов, что в конечном счёте способствует развитию воспаления, нарушению барьерных функций, метаболическим и трофическим сдвигам [12]. Подобная дизрегуляция стрессовых систем лежит в основе коморбидности широкого спектра заболеваний: от хронических болевых синдромов и функциональных расстройств до сердечно-сосудистой патологии [20], сахарного диабета [17] и даже онкологических процессов [18]. Стресс-индуцированные расстройства широко распространенный феномен, представленный в иммунологии (как один из факторов повышенного риска при развитии инфекционных заболеваний) [11], в кардиологии и ангионеврологии (нарушение ритма и проводимости, гиперкоагуляция, как один из эволюционных механизмов адаптации организма к острой кровопотере, ускорение развития атеросклероза, артериальной гипертензии) [2], мануальной медицине (мышечное напряжение, сопровождающееся головной болью, болью в шее, в частности посредством повышения тонуса трапецевидной мышцы, болей в спине) [8], пульмонологии (бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких) [3], гастроэнтерологии (гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, синдром раздраженного кишечника, колит) [13], дерматологии (атопический дерматит, псориаз, акне) [4]. В ответ на кратковременное действие стрессирующего фактора активируются одновременно симпатическая и парасимпатическая нервная системы в реципрокных отношениях (симпатовагальный баланс), однако хроническое воздействие раздражающего фактора приводит к дисбалансу, нарушается нейроэндокринная регуляция и адаптация, развивается стресс-индуцированная патология [6]. Изучение биомаркеров стрессовой адаптации имеет огромное значение для понимания её патогенетических механизмов, разработки новых диагностических подходов и персонализированных стратегий коррекции стресс-индуцированных состояний. В качестве таких маркеров выступают показатели нейроэндокринной (грелин, кортизол, адренокортикотропный гормон, катехоламины) и иммунной (лимфоциты, NK-клетки, провоспалительные цитокины) систем [5]. Их динамические изменения под влиянием острого или хронического стресса позволяют объективно оценить адаптационные резервы организма и степень напряженности стрессовых систем. В ряде случаев в роли стресс-индуирующего фактора выступает боль. Функционально (особенно в острых формах) она становится сигналом и элементом защиты, информируя организм о потенциальной угрозе повреждения и запуская серию физиологических и поведенческих актов, необходимых для предотвращения или уменьшения деструкции, предотвращения её повторного появления и активации репарационных процессов. Ноцицепция представляет собой механизм трансформации воздействия вредного стимула посредством болевого раздражения в сознательное переживание. Значительную роль в активации ноцицептивных нейронов играют субстанция Р, нейрокинин А и кокальцигенин. Также важное значение в механизмах стимуляции ноцицептивных нервных клеток придается оксиду азота (NO) - внесинаптическому медиатору, способному свободно перемещаться через клеточную мембрану [9]. Защитные эффекты NO связаны с способностью к дилатации сосудов внутренних органов, усилению процессов микроциркуляции, активации ферментов антиоксидантной системы, а также стимуляции образования гипоксия индуцируемого фактора 1 (HIF-1) [7]. HIF1 представляет собой антигипоксический димерный белок, координирующий процессы пролиферации, дифференцировки и клеточной выживаемости путём регулирования ангиогенеза, эритропоэза, гликолиза, а также тонуса сосудов [10]. Исследование на крысах в условиях нормобарической гипоксии показали, что в головном мозге животных повышается регуляция экспрессии мРНК фактора роста эндотелия сосудов VEGF (регуляция ангиогенеза и тонуса сосудов) и адреномедуллина (стимуляция нейропротективных процессов), которые являются непосредственными генами-мишенями HIF1 [16]. Исходя из этого, можно сделать вывод, что фактор играет важную роль в формировании адаптации мозга не только к гипоксии-ишемии, как считалось ранее, но и к стрессу. В качестве одной из методик регистрации ноцицептивной стресс-реакции грызунов на умеренную, непрерывную боль, вызванную повреждением тканей можно использовать «Формалиновый» тест [19]. Считается, что тест обеспечивает более эффективную модель клинической боли, чем тесты с фазными механическими или температурными раздражителями [15], что позволяет исследовать стресс-реакцию не только в острейший и острый периоды, но и при хронизации процесса. Цель исследования - изучить показатели динамики экспрессии HIF1α у крыс Вистар в течение определенного времени (1 час, 24 часа, 72 часа) после воздействия болевого стимула в модели «формалинового» теста. Выбор исследуемой ткани (кровь, кора головного мозга - PFC), миндалина (AMG) был обусловлен различными причинами: кровь - как наиболее удобный биоматериал, используемый в стандартной клинической лабораторной практике, PFC - ткань, наиболее остро реагирующая на гипоксию, а AMG - наиболее остро реагирующая на стресс область головного мозга, играющая ключевую роль в формировании отрицательных эмоций: страх и тревога. Методика Исследование проводилось на крысах Вистар в возрасте 8-9 мес. массой 250-300 г. Животные содержались в пластиковых клетках при температуре воздуха 22±2°С, световом режиме 12/12 ч, со свободным доступом к гранулированному корму и воде. В клетке было по 6 однополых особей. Все эксперименты выполнялись в соответствии с Национальным стандартом РФ ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и Европейской конвенции Directive 2010/63/EU. Моделирование стресс-индуцированных нейрофизиологических механизмов адаптации к болевому раздражению воспроизводили с использованием «Формалинового» теста. Подопытные животные были разделены на 4 группы (по 6 крыс в каждой): первые три группы были подвержены острой воспалительной реакции, вызываемой введением 2,5% раствором формалина в дорсальную поверхность стопы задней конечности в дозе 50 мкл, а четвертая группа - контрольная, которая не подвергалась болевому воздействию. Определение уровня HIF1α проводили методом ИФА на образцах прозрачной фракции крови, миндалине и коре головного мозга крыс (центрифугирование 8.000/об/мин), полученных при декапитации крыс у первой группы через 1 час после воздействия (моделирование фульминантного периода стресса), второй - через 1 день (моделирование острого периода стресса), а у третьей - через 3 дня (моделирование хронического периода стресса). ИФА выполнялся сэндвич-методом с использованием тест-систем ELISA Kit for HIF-1α (Cloud-Clone Corp., Хъюстон, США) в соответствии с протоколом фирмы изготовителя. Детекция антигена осуществлялась на спектрофотометре на длине волны 450 нм. До момента определения образцы сохраняли при -20°С. Статистическую обработку производили с использованием GraphPadPrism8 и IBM SPSS Statistics 27 с оценкой статистической значимости показателей при p<0,05. По результатам критерия Шапиро-Уилка (p=0,200) и Колмогорова-Смирнова (p=0,730) проверяемое распределение показателя HIF1 в коре головного мозга соответствует нормальному, а в миндалине головного мозга и крови не соответствует нормальному (критерий Шапиро-Уилка (p <0,05) и Колмогорова - Смирнова (p<0,05), однако учитывая малую выборку, все данные обработаны при помощи непараметрического критерия. В связи с невозможностью получения значения параметров у одного объекта исследования более одного раза (т.е. в динамике), принято решение взять четыре группы объектов с абсолютно одинаковыми характеристиками и снять показания: в первой группе - до стрессирования (контрольная группа), во второй группе - через 1 час после стрессирования, в третьей - через 1 сутки после стрессирования, в четвертой - через 3 суток после стрессирования. Статистический анализ проводился при помощи однофакторного дисперсионного анализа Краскалла-Уоллиса для несвязанных выборок. Результаты исследования Сравнение уровня HIF1 в миндалине головного мозга (Ме - 0,09497, n - 23, σ - 0,02253) выявило статистически значимое различие между группами (p=0,019), в частности, значимое увеличение уровня HIF1α через 3 суток после введения формалина в сравнении с уровнем HIF1α и первой группы (через 1 час после введения). Рис. 1. Сравнение уровня HIF1α в миндалине головного мозга (AMG) Анализируя уровень HIF1α в коре головного мозга до введения формалина (Ме - 0,08671, n - 24, σ - 0,01357) также выявлено статистически значимое различие между группами (р=0,039). В частности, значимое снижение уровня HIF1 через 1 час после введения формалина в сравнении с уровнем HIF1 через 3 суток после введения. Рис. 2. Сравнение уровня HIF1α в коре головного мозга (PFC) При исследовании уровня HIF1α в крови (Ме - 0,07078, n - 24, σ - 0,02360) статистически значимых различий не выявлено (р=0,423). Анализ полученных статистических данных свидетельствует о том, что после воздействия формалином уровень HIF1α в коре и миндалине головного мозга крыс после стрессирования падает, а затем постепенно возрастает, при этом статистически значимые изменения отмечаются на 3 день после болевого стрессирования. Рис. 3. Сравнение уровня HIF1α в крови Обсуждение результатов исследования На основании полученных нами результатов, было выявлено, что различные отделы головного мозга реагируют на стресс одинаково. Через трое суток после болевого стрессирования и в коре, и в миндалине головного мозга крыс появляются статистически значимые изменения уровня HIF1α, но в краткосрочном периоде таких изменений не наблюдается. Наиболее яркие результаты были получены при анализе уровня HIF1α в коре головного мозга: статистически значимые изменения уровня HIF1α выявлены во всех трёх экспериментальных группах. При графическом анализе изменений HIF1α в коре и миндалине головного мозга выявлена прямая корреляция в течение всего исследования. Это может указывать на синхронность реакций и скоординированность активации ответа на стрессовое воздействие в обеих областях головного мозга, а также на схожесть механизмов адаптации и компенсации гипоксии и боли. Рис. 4. Сравнение динамика HIF1α в отделах головного мозга (графический анализ) Статистически значимые изменения в крови в течение всего периода исследования полностью отсутствовали. Учитывая известные данные о стимуляции синтеза HIF1α в ответ на снижение концентрации кислорода в дыхательной среде отсутствие изменений концентрации HIF1α в крови было теоретически ожидаемо. Однако, результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что изучаемый биологический маркер в экспериментальных условиях демонстрирует определённую роль в нейрогенной адаптации к хроническому болевому стрессу. По результатам многочисленных исследований стало ясно, что HIF1 непосредственно регулирует экспрессию более 1 тыс. генов человека, участвующих в компенсации негативного воздействия гипоксии. При хроническом болевом стрессе HIF1 также участвует в регуляции клеточных ответов на воздействие, включая активацию противовоспалительных и анальгезирующих путей. В обоих случаях HIF1 помогает клеткам адаптироваться к неблагоприятным условиям, что делает его потенциальным маркером диагностики как для гипоксических состояний, так и маркером хронического болевого стресса. Для окончательного подтверждения возможности использования HIF1α в качестве надёжного индикатора хронического болевого стресса требуется проведение дополнительных исследований. Важно определить продолжительность сохранения стабильных изменений уровня этого маркера и его сопоставимость с другими лабораторными маркерами, имеющими потенциал применения в качестве диагностики хронического стресса. Необходимо изучить долгосрочную стабильность и воспроизводимость выявленных изменений, а также провести аналогичные исследования на других экспериментальных моделях и в различных условиях, чтобы обеспечить универсальность и значимость использования HIF1α в клинической практике. Комплексный подход к этим вопросам позволит утвердить HIF1α как важный диагностический инструмент в оценке хронического болевого стресса и повысить точность и надёжность диагностики подобных состояний. При дальнейшем подтверждении диагностической эффективности HIF1α, он может быть использован в клинической практике для мониторинга хронического болевого стресса у людей или животных, а также в качестве мишени для фармакологической профилактики и коррекции адаптации и компенсации хронической гипоксии и хронического болевого стресса.

About the authors

A. V Lyubimov

Military Medical Academy; Institute of Experimental Medicine

Email: email@example.com
кандидат медицинских наук, преподаватель кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» 6, acad. Lebedeva St., 194044, St. Petersburg, Russia; 12, Acad. Pavlov St., 197376, St. Petersburg, Russia

A. V Efimov

Military Medical Academy

Email: email@example.com
кандидат медицинских наук, преподаватель кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 6, acad. Lebedeva St., 194044, St. Petersburg, Russia

A. S Tarakhteev

Military Medical Academy

Email: email@example.com
соискатель кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 6, acad. Lebedeva St., 194044, St. Petersburg, Russia

D. D Bykova

Military Medical Academy

Email: email@example.com
соискатель кафедры военно-морской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 6, acad. Lebedeva St., 194044, St. Petersburg, Russia

A. E Trandina

Military Medical Academy

Email: email@example.com
врач клинической лабораторной диагностики научно-исследовательской лаборатории тканевой инженерии научно-исследовательского отдела медико-биологических исследований Научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 6, acad. Lebedeva St., 194044, St. Petersburg, Russia

E. A Pogozhaya

Medical Center for Premorbid and Emergency Conditions of the P.V. Mandryka Central Military Clinical Hospital

Email: email@example.com
старший врач-специалист медицинского отдела (диагностики и диспансеризации) медицинского центра преморбидных и неотложных состояний ФКУ «Центральный военный клинический госпиталь им. П.В. Мандрыка» МО РФ 4, lane Serebryany, 119002, Moscow, Russia

References

Supplementary files