СТАБИЛЬНОСТЬ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА ВОДНЫХ РАСТВОРОВ КАЛЬЦИЯ ХЛОРИДА ЭКСТЕМПОРАЛЬНОГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ

Полный текст

Введение Экстемпоральные лекарственные препараты, в том числе нестерильные водные растворы различных солей (кальция хлорида, магния сульфата, новокаина гидрохлорида и др.), изготавливаются производственными аптеками Республики Беларусь. Их качество до утверждения в 2007 г. национальных фармакопейных стандартов должно было соответствовать фармакопейным нормам ГФ СССР X и XI. Микробиологическая чистота лекарственных средств определялась общей фармакопейной статьей «Методы микробиологического контроля лекарственных средств», которая впервые была введена в ГФ СССР XI (1990 г.) с последующими изменениями [4, 5]. На данный момент качество лекарственных средств ex tempore регламентируется разделом #6.3 Государственной фармакопеи Республики Беларусь (ГФ РБ), который определяет критерии «годной» и «забракованной» аптечной продукции. Кроме того, все нестерильные экстемпоральные препараты должны соответствовать требованиям ст. 5.1.4. ГФ РБ «Микробиологическая чистота нестерильных лекарственных средств и фармацевтических субстанций». Республика Беларусь является также членом Евразийского экономического союза. Фармакопея ЕАЭС имеет статус региональной фармакопеи и регулирует качество лекарственных средств на фармацевтическом рынке Союза. Ст. 2.3.1.2 Фармакопеи ЕАЭС устанавливает критерии приемлемости микробиологической чистоты лекарственных препаратов, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ. Нестерильные лекарственные средства могут быть контаминированы лимитированным количеством бактерий и грибов при отсутствии определенных опасных для здоровья видов микроорганизмов. Для жидких препаратов для приема внутрь не допускается контаминация E. coli. В таблице 1 приведены критерии приемлемости обсемененности лекарственных препаратов и особенности испытаний по показателю «Микробиологическая чистота» согласно ГФ СССР XI, ГФ РБ II, ГФ РФ XIV и Фармакопеи ЕАЭС. Таблица 1. Сравнение испытаний микробиологической чистоты водных лекарственных средств для приема внутрь согласно ГФ СССР XI, фармакопеи ЕАЭСи национальным фармакопейным стандартам Параметр или условие ГФ СССР XI (1990 г.) ГФ РБ II ( 2012 г.) ГФ РФ XIV (2018 г.) Фармакопея ЕАЭС (2020 г.) Тест-микроорганизм[1] B. subtilis; P. aeruginosa; S. aureus; C. albicans E. coli; (из Каталога штаммов Всесоюзного музея патогенных бактерий ГИСК им. Л.А. Тарасевича) B. subtilis; P. aeruginosa; S. aureus; C. albicans; A. brasiliensis; (из зарубежных каталогов штаммов - ATCC, NCIMB, CIP, NBRC) B. subtilis или B. cereus P. aeruginosa; S. aureus; S. epidermidis; C. albicans A. brasiliensis или А.niger; E. coli; Salmonella abony (тест-штаммы микроорганизмов, депонированные в любых официальных коллекциях) B. subtilis или B. cereus P. aeruginosa; S. aureus; C. albicans; A. brasiliensis или А.niger; E. coli; (тест-штаммы микроорганизмов, депонированные в любых официальных коллекциях) Питательные среды для выявления микроорганизмов МПА (для B. subtilis); ПС ГРМ №8 (для P. аeruginosa и S. aureus); Среда №2 агар Сабуро (для C. albicans); МПБ (накопление E. coli) и МПА с калия нитритом или Среда №7 (идентификации E. coli) ТСА (для S. аureus, P. aeruginosa, B. subtilis); декстрозный агар Сабуро (для C. аlbicans и A. brasiliensis); ТСА или Среда №1 для выращивания бактерий; Агар Сабуро с глюкозой или Среда №2 для выращивания грибов; ТСА или Среда №1 для выращивания бактерий; Агар Сабуро с глюкозой или Среда №2 для выращивания грибов; Среда №8 для выращивания бактерий Метод обнаружения микроорганизмов в испытуемом продукте Двуслойный агаровый метод в чашках Петри Мембранная фильтрация, методы чашечного посева, метод наиболее вероятного числа Чашечные агаровые методы (глубинный, двухслойный, поверхностный), мембранная фильтрация, метод наиболее вероятного числа Чашечные агаровые методы (глубинный, двухслойный, поверхностный), мембранная фильтрация, метод наиболее вероятного числа Критерии приемлемости для микробиологической чистоты для водных ЛС для внутреннего применения ОКА не более 103 в 1 мл (не более 1000 КОЕ/мл); ОКГ не более 102 в 1мл (не более 100 КОЕ/мл); Отсутствие E. Coli ОКА 102 (не более 200 КОЕ/мл); ОКГ 101 (не более 20 КОЕ/мл); Отсутствие E. Coli ОКА 102 (не более 200 КОЕ/мл); ОКГ 101 (не более 20 КОЕ/мл); Отсутствие E. Coli ОКА 102 (не более 200 КОЕ/мл); ОКГ 101 (не более 20 КОЕ/мл); Отсутствие E. Coli Испытания на наличие специфических микроорганизмов - E. coli E. coli E. coli Как видно из таблицы, требования к микробиологической чистоте водных растворов лекарственных средств для перорального применения одинаковы в Российской Федерации и в Республике Беларусь и соответствуют требованиям европейского уровня. Такие же критерии установлены Фармакопеей ЕАЭС. Современные фармакопейные требования к микробиологической чистоте нестерильных пероральных лекарственных препаратов строже по сравнению с нормами Фармакопеи СССР XI. Поэтому испытания микробиологической чистоты лекарственных препаратов становятся особенно актуальными для выяснения соответствия производимой аптеками продукции фармакопейным нормам. Так, коллективом авторов статьи была исследована микробиологическая стабильность нестерильных растворов натрия тиосульфата 5% и 30% аптечного изготовления. По результатам испытаний показатели микробиологической чистоты растворов соответствовали нормам ГФ РБ II в течение 20 суток хранения [1]. Микробиологическая стабильность растворов натрия тиосульфата аптечного изготовления объясняется антибактериальными свойствами самой субстанции, что было подтверждено последующими исследованиями и установлением минимальной подавляющей и минимальной бактерицидной концентрацией натрия тиосульфата [2]. Фармацевтическая промышленность производит стерильные растворы кальция хлорида 5% и 10% для внутривенного введения в ампулах по 5 мл и 10 мл. Нестерильные растворы кальция хлорида в концентрации до 10% изготавливаются аптеками из 50%-го концентрированного водного раствора, который в свою очередь готовят как аптечный полуфабрикат (заготовку) из субстанции кальция хлорида. Аптечное изготовление нестерильных растворов осуществляется в ассистентской комнате с использованием воды очищенной и является несерийным (кроме изготовления лекарственных средств по требованиям отделений больниц и внутриаптечной заготовки). Несмотря на значительное сокращение номенклатуры используемых концентрированных растворов, растворы кальция хлорида 1:2 имеются в любой производственной аптеке. Растворы кальция хлорида для внутреннего применения используются в комплексной десенсибилизирующей терапии различных простудных, а также кожных заболеваний (аллергический зуд, экзема, псориаз, питириаз) [3]. Цель исследования - установить микробиологическую и химическую стабильность экстемпоральных растворов кальция хлорида 1% и 10% для перорального применения до вскрытия флаконов в соответствии с требованиями Фармакопеи Евразийского экономического союза. Методика Объектами исследования служили препараты нестерильных водных растворов кальция хлорида, изготовленные в условиях производственной аптеки: серии 5, 6, 7 - 1% раствор по 50 мл, серии 8, 9, 10 - 10% раствор по 50 мл. Изготовление осуществлялось в ассистентской с использованием аптечной заготовки концентрированного раствора кальция хлорида 1:2 и воды очищенной. Тара - стеклянный флакон. Качество аптечной продукции подтверждается стандартными испытаниями, включающими органолептический, качественный и количественный контроли. Определение подлинности (идентификация) образцов лекарственных препаратов проводили в соответствии с ГФ РБ II, Т. 1, с. 1028. Содержание кальция хлорида оценивали согласно ГФ РБ #6.2. Экспресс-анализ лекарственных средств. Для 1%-го раствора применяли комплексонометрическое титрование. К 1,0 мл анализируемого раствора прибавляли 5,0 мл аммиачного буферного раствора (pH 10,0), металлоиндикатор эриохром черный Т, титровали 0,0500 М раствором натрия эдетата до синего окрашивания. Раствор титранта динатрия эдетата 0,0500 М готовили из точной навески натрия эдетата (1,8750 г), растворяли в воде очищенной и доводили объем до 100 мл. Содержание кальция хлорида рассчитывали по формуле m=CVfэквM10-250, где С - концентрация титранта натрия эдетата, моль/л; V - объем титранта, мл; М - молярная масса кальция хлорида гексагидрата 219,1 г/моль. Содержание кальция хлорида в 10%-ом растворе оценивали рефрактометрически (рефрактометр Abbe NAR-1T, Япония). Градуировка прибора осуществлялась по воде очищенной с показателем преломления 1,3330. Содержание кальция хлорида рассчитывали по формуле m=(n-no/F)×0,5, где F - фактор прироста показателя преломления при увеличении концентрации кальция хлорида на 1% равный 0,00116. Микробиологическую стабильность растворов устанавливали следующим образом: в каждом образце определяли общее количество аэробов (ОКА), общее количество грибов (ОКГ) и E. coli в день вскрытия флакона (нулевая точка) и через каждые 5 суток хранения. До вскрытия флаконов готовые препараты хранились в климатической камере (Мemmert, Германия) при температуре 25±0,1°С и относительной влажности воздуха 60±0,5%. В работе использовали следующие питательные среды (ПС): триптон-соевый агар (ТСА) и триптон-соевый бульон (ТСБ) (Великобритания), агар Сабуро (РФ), бульон МакКонки-ГРМ (РФ), агар МакКонки (Индия). Все ПС прошли обязательный контроль на ростовые свойства и на стерильность (отрицательный контроль). В качестве типовых тест-культур использовали Staphylococcus aureus АТСС 6538, Pseudomonas aeruginosa АТСС 15442, Bacillus subtilis АТСС 6051, Candida albicans АТСС 10831, Aspergillus brasiliensis АТСС 16404. Оценку возможного ингибирующего влияния кальция хлорида на рост микроорганизмов проводили инокулируя взвесью микробных клеток тест-штаммов чашки с ТСА и с агаром Сабуро в присутствии испытуемых образцов и без них (контроль). Инокуляты получали последовательными десятикратными разведениями культур тест-штаммов изотоническим раствором натрия хлорида до содержания в инокуляте не более 100 микробных клеток. Испытания микробиологической чистоты растворов кальция хлорида проводили методом поверхностного посева: 0,1 мл исследуемого образца наносили на поверхность агаризованной среды (ТСА для выявления бактерий, агара Сабуро без хлорамфеникола - для выявления грибов). Для каждого образца процедуру выполняли в двух повторностях. Чашки с ТСА инкубировали при температуре 30-35 °С в течение 3-5 суток, а чашки с агаром Сабуро при температуре 20-25 °С в течение 5-7 суток. Общее количество аэробов и общее количество грибов в 1 мл испытуемого раствора определяли по формуле: N=∑c/n×10, где c - сумма колоний на двух чашках, n - число чашек, 10 - коэффициент при посеве 100 мкл образца раствора. Выявление E. сoli проводили следующим образом. В 50 мл ТСБ вносили 5 мл испытуемого образца, инкубировали в термостате при температуре 30-35°С в течение 24 ч. Тщательно перемешивали и пересевали по 0,5 мл в 50 мл бульона МакКонки, инкубировали при температуре 42-44°С в течение 48 ч. Тщательно перемешивали и 0,1 мл пересевали на агар МакКонки, инкубировали при температуре 30-35°С в течение 18-72 ч. Рост колоний на чашках свидетельствовал о присутствии E. coli в образце. Все работы по оценке микробиологической чистоты исследуемых образцов проводили в асептических условиях, в помещении для выполнения стерильных работ с использованием ламинарного бокса второго класса микробиологической безопасности типа 2A «Lambox». Результаты исследования и их обсуждение Каждый испытуемый препарат всех серий представлял собой прозрачную бесцветную жидкость и давал положительные реакции на катион кальция и хлорид-анион. Результаты содержания кальция хлорида в растворах приведены в табл. 2 и 3. Таблица 2. Значения объемов титранта натрия эдетата и расчетные значения массы навесок кальция хлорида в растворах кальция хлорида 1% 50 мл Серия Период хранения 0 суток 5 суток 10 суток 15 суток 20 суток V, мл m, г V, мл m, г V, мл m, г V, мл m, г V, мл m, г 5 0,90 0,4930 0,89 0,4875 0,89 0,4875 0,93 0,5094 0,91 0,4985 6 0,89 0,4875 0,89 0,4875 0,90 0,4930 0,91 0,4985 0,90 0,4930 7 0,89 0,4875 0,89 0,4875 0,90 0,4930 0,89 0,4875 0,90 0,4930 Таблица 3. Значения показателей преломления и расчетные значения массы навесок кальция хлорида в растворах кальция хлорида 10% Серия Период хранения 0 суток 5 суток 10 суток 15 суток 20 суток n m, г n m, г n m, г n m, г n m, г 8 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 9 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 1,3448 5,0862 1,3448 5,0862 1,3447 5,0431 10 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 1,3447 5,0431 Раздел #6.3.1. ГФ РБ устанавливает отклонения, допустимые в массе навески отдельных фармацевтических субстанций в жидких лекарственных средствах при изготовлении массо-объемным методом с использованием как концентрированных растворов, так и фармацевтических субстанций. Во всех анализируемых образцах содержание кальция хлорида находилось в пределах фармакопейных норм (табл. 4). Химическая стабильность анализируемых препаратов не ухудшалась в течение всего времени хранения. Таблица 4. Значения среднего содержания кальция хлорида в образцах за период хранения 20 суток Конц. СаСl2 Серия образца Период хранения Отклонения, допустимые в массе навески отдельной фармацевтической субстанции в ЖЛС согласно #6.3.1. ГФ РБ II 20 суток Содержания кальция хлорида, г x̅±∆x̅ (ɑ=0,05) 1% 5 0,495 ± 0,009 ±8% [0, 460-0, 540] 6 0,492 ± 0,005 7 0,490 ± 0,003 10% 8 5,043 ± 0,000 ±4% [4, 800-5, 200] 9 5,060 ± 0,024 10 5,043 ± 0,000 В ходе анализа микробиологической стабильности исследуемых образцов выявлено, что кальция хлорид приводит к осаждению компонентов жидких и агаризованных ПС. Это может ухудшить ростовые свойства ПС. Для выявления негативного влияния кальция хлорида на рост микроорганизмов и свойства ПС была проведена оценка роста типовых тест-штаммов в контроле (суспензия тест-штаммов в растворе натрия хлорида 0,9%) и в присутствии испытуемых растворов кальция хлорида. Результаты учета посевов представлены в таблице 5. ГФ РБ устанавливает, что рост микроорганизмов на ПС в контроле и в присутствии продукта не должен отличаться более чем в два раза. Уменьшение роста на коэффициент более 2 свидетельствует об ингибировании роста микроорганизмов испытуемым продуктом. В таблице 6 представлены расчетные значения коэффициента ингибирования. По результатам учета посевов тест-штаммов установлено, что растворы кальция хлорида 1% и 10% не ухудшают ростовые свойства ПС и не ингибируют рост микроорганизмов. Таблица 5. Число колониеобразующих единиц (КОЕ) на ПС в контроле и на ПС в присутствии растворов кальция хлорида Среда Результат Число КОЕ тест-штаммов S. аureus P.aeruginosa B. subtilis C.аlbicans A.brasiliensis Контроль (No) I 242 196 20 143 12 II 182 220 38 175 5 Ср. знач. 212 208 29 159 9 CaCl2 1% (N1) I 224 225 14 196 4 II 208 213 43 220 9 Ср. знач. 216 219 29 208 7 CaCl2 10% (N2) I 164 234 23 122 4 II 153 217 43 178 6 Ср. знач. 159 226 33 150 5 Примечание: No - среднее число колоний на ПС в контроле, N1 - среднее число колоний на ПС в присутствии раствора кальция хлорида 1%, N2 - среднее число колоний на ПС в присутствии раствора кальция хлорида 10% Таблица 6. Значения коэффициентов ингибирования роста тест-штаммов микроорганизмов Коэффициент Тест-штамм S. аureus P. aeruginosa B. subtilis C. аlbicans A. brasiliensis No/N1 1,0 0,9 1,0 0,8 1,1 No/N2 1,4 0,9 0,9 1,3 1,8 Примечание: No - среднее число колоний на ПС в контроле, N1 - среднее число колоний на ПС в присутствии раствора кальция хлорида 1%, N2 - среднее число колоний на ПС в присутствии раствора кальция хлорида 10% Ст. 2.3.1.2. Фармакопеи ЕАЭС устанавливает критерии приемлемости для нестерильных водных лекарственных средств для внутреннего применения: допустимый уровень обсемененности аэробными микроорганизмами составляет 102 КОЕ/мл, грибами 101 КОЕ/мл, при отсутствии E. сoli. Для всех лекарственных средств критерии приемлемости интерпретируют с учетом коэффициента 2, то есть максимальная обсемененность аэробами не должна превышать 200 КОЕ/мл, грибами - 20 КОЕ/мл. Показатели микробиологической чистоты водных растворов для приема внутрь согласно ГФ СССР XI отличаются в пять раз: обсемененность аэробами до 1000 КОЕ/мл, грибами - до 100 КОЕ/мл. Согласно фармакопеи ЕАЭС для нестерильных продуктов при учете и интерпретации результатов, полученных чашечными агаровыми методами, при отсутствии роста на питательной среде принимают обсемененность менее 10 КОЕ/мл. В таблице 7 представлены результаты микробиологических испытаний нестерильных растворов кальция хлорида 1% (серии 5-7) и 10% (серии 8-10). Таблица 7. Микробиологические испытания растворов кальция хлорида 1% и 10%: общее количество жизнеспособных аэробов (ОКА/мл) и общее количество грибов (ОКГ/мл) Конц. СаСl2 Серия образца Период хранения Допустимые критерии приемлемости микробиологической чистоты, согласно ст. 2.3.1.2. Фармакопеи ЕАЭС 0 суток 5 суток 10 суток 15 суток 20 суток ОКА среднее значение, КОЕ/мл 1% 5 <10 <10 10 <10 2280 102 КОЕ/мл = 200 КОЕ/мл, отсутствии E. сoli 6 <10 <10 2845 3150 65 7 <10 <10 885 1780 50 10% 8 <10 <10 <10 <10 <10 9 55 195 415 345 2035 10 10 0 0 0 0 ОКГ среднее значение, КОЕ/мл 101 КОЕ/мл = 20 КОЕ/мл, отсутствии E. сoli 1% 5 <10 <10 30 <10 <10 6 <10 <10 20 3355 <10 7 <10 <10 <10 1000 <10 10% 8 <10 <10 <10 <10 <10 9 <10 5 95 55 1995 10 <10 <10 <10 <10 50 При изготовлении фармацевтических растворов в нестерильных условиях микробиологическая чистота готового экстемпорального лекарственного препарата зависит от качества нестерильной субстанции и растворителя, а также условий изготовления. Внутриаптечная заготовка концентрированный раствор кальция хлорида изготавливается в асептических условиях с использованием воды очищенной свежеперегнанной и хранится не более 30 суток при температуре не выше 25°С. Растворы кальция хлорида 5% и 10% получают разбавлением концентрированного раствора водой очищенной. В качестве первичной упаковки используются стерильные аптечные флаконы, которые обрабатываются и хранятся согласно санитарно-эпидемиологическим требованиям для аптек [7]. В день изготовления и по истечении пяти суток хранения микробиологическая чистота всех образцов растворов соответствовала нормам Фармакопеи ЕАЭС. Посев на 10-е сутки хранения выявил, что 4 из 6 образцов являлись негодными к применению, так как превышали показатели ОКА или ОКГ в 1 мл раствора. В тоже время часть проанализированных образцов сохранили нулевые показатели микробиологической нагрузки даже после 20 суток хранения. Актуальная редакция Надлежащей аптечной практики Республики Беларусь определяет срок реализации любого экстемпорального препарата в течение 5 суток и не оговаривает конкретные сроки годности лекарственных средств [6]. В Российской Федерации для нестерильных жидких лекарственных форм, за исключением, настоек капель, эмульсий и суспензий срок годности составляет 14 суток [8]. Водные растворы без консервантов имеют ограниченные сроки хранения. И даже введение в состав комбинированных консервантов не всегда позволяет значительно увеличить срок годности продукта. Например, экстемпоральная рецептура США включает раствор неомицина сульфата 2,5% для приема внутрь, изготавливаемый на воде очищенной и содержащий в качестве консервантов бензойную кислоту и парабены. Срок годности раствора составляет 14 суток в прохладном месте [9]. В тоже время раствор кофеина цитрата 1% для перорального приема, который содержит консервант калия сорбат, но изготавливается на стерильной воде и подвергается стерилизующему фильтрованию, хранится в течение 6 месяцев при комнатной температуре [10]. Как видно из результатов испытаний, даже при строгом соблюдении санитарно-гигиенических норм и технологии изготовления обеспечить показатели микробиологической чистоты на более-менее длительный период для всех единиц продукции не получилось. Выводы 1. Проанализированные экстемпоральные растворы кальция хлорида 1% и 5% для приема внутрь являлись годными в день изготовления и на протяжении всего периода хранения 20 суток по показателям описание, подлинность и содержание кальция хлорида. 2. По показателю микробиологическая чистота растворы кальция хлорида 1% и 5% для приема внутрь являлись годными в день изготовления и через пять суток хранения. На 10-е сутки хранения микробная обсемененность четырех из шести образцов превысила фармакопейные нормы ЕАЭС и составила по показателю ОКА 4,2×102 КОЕ/мл; 8,9×102 КОЕ/мл; 2,9×103 КОЕ/мл, по показателю ОКГ 3,0×101КОЕ/мл. 3. По результатам проведенных испытаний микробиологической и химической стабильности шести серий лекарственного препарата раствор кальция хлорида 1% и 5% установлена годность растворов в течение пяти суток хранения.

Об авторах

Светлана Степановна Мальчёнкова

УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Email: email@example.com
старший преподаватель кафедры фармацевтической технологии Республика Беларусь, 220116, Минск, пр-т Дзержинского, 83

Наталья Степановна Голяк

УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой фармацевтической технологии Республика Беларусь, 220116, Минск, пр-т Дзержинского, 83

Наталья Николаевна Бердник

УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Email: email@example.com
научный сотрудник лаборатории внутрибольничных инфекций научно-исследовательской части научно-исследовательского института экспериментальной и клинической медицины Республика Беларусь, 220116, Минск, пр-т Дзержинского, 83

Жанна Федоровна Циркунова

УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Email: email@example.com
кандидат биологических наук, заведующий лаборатории внутрибольничных инфекций научно-исследовательской части научно-исследовательского института экспериментальной и клинической медицины Республика Беларусь, 220116, Минск, пр-т Дзержинского, 83

Список литературы

Дополнительные файлы