РАСТИТЕЛЬНЫЕ ИСТОЧНИКИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ - ОСНОВА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЧЕПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ

Полный текст

Введение В последние годы отмечается рост заболеваний мочеполовой системы (МПС). В России заболеваниями МПС страдает каждый 10-ый житель [1, 6]. Заболевания МПС относятся к распространенным и социально значимым. Так, мочекаменная болезнь в 70% случаев встречается у трудоспособного населения, часто предполагает длительный срок реабилитации, имеет высокий риск рецидива и осложнений [7]. Наряду с хирургическими методами и синтетическими препаратами при патологиях данной сферы используются растительные фенолосодержащие средства. Основными действующими веществами таких средств являются простые фенолы (арбутин), флавоноиды (авикулярин, рутин, тилирозид и др.), фенолкарбоновые кислоты, антраценпроизводные (руберитриновая кислота). Эти соединения обеспечивают основные противовоспалительный, диуретический, камнерастоворяющий эффекты. Народная медицина с древних времен оценила положительные свойства фенольных соелинений, их доступность и безопасность, в том числе для лечения и профилактики заболеваний МПС. Многие растения изучены и внедрены в научную медицину, включены в Государственную Фармакопею, имеют подтвержденные виды фармакологического действия [5, 9, 10]. Достижения фармакогнозии и фармакологии позволяют расширить ассортимент лекарственных средств для лечения и профилактики заболеваний МПС на основе растительных источников фенольных соединений. В официнальной медицине для лечения и профилактики заболеваний применяются лекарственные растения, сырьё которых разрешено для производства лекарственных средств на территории Российской Федерации и включено в Государственный реестр лекарственных средств. Одной из наиболее актуальных лекарственных форм является сбор. Составляющие компоненты сбора обеспечивают комплексное воздействие на патологический процесс благодаря сумме и разнообразию биологически активных соединений. При попадании в организм они взаимодействуют синергетически, либо предупреждают нежелательные эффекты, в том числе, проявляемые синтетическими препаратами [8]. Растительное сырье, используемое для приготовления сборов, должны соответствовать требованиям соответствующих фармакопейных статей или нормативной документации [12]. Разработка сборов носит научно-обоснованный характер и включает подбор компонентов; стандартизацию сбора; выявление и подтверждение фармакологических эффектов, установление условий хранения и т.д. Официнальная медицина имеет в своем арсенале небольшое количество сборов, используемых при заболеваниях МПС - Сбор мочегонный №2; Урологический (мочегонный) сбор, Фитонефрол. Учитывая распространенность и социальную значимость заболеваний МПС, и, в частности, мочекаменной болезни, разработка средств для лечения и профилактики данной патологии является актуальной задачей. Цель исследования - разработать сбор мочегонный для лечения и профилактики мочекаменной болезни, провести исследование по его стандартизации. Методика Объекты исследования - реализуемые через аптечные сети официнальные виды лекарственного сырья, соответствующие требованиям фармакопейных статей (ФС) - Equiseti arvensis herba (ФС.2.5.0045) [12], Polygoni avicalaris herba (ФС.2.5.0069.18), Vaccinii vitis-idaeae folia (ФС.2.5.0063.18), Zeae maydis styli cum stigmatis (ФС.2.5.0079.18) [11], а также перспективное для внедрения в медицинскую практику сырье Solidaginis dahuricae herba, стандартизованное согласно проекту ФС [2]. Исследования по стандартизации сбора проводили согласно требованиям общей фармакопейной статьи ОФС.1.4.1.0020 «Сборы» [12]. Для идентификации основных действующих веществ - флавоноидов и простых фенолов - применяли качественные аналитические реакции, принятые в фармакогностическом анализе, а также метод тонкослойной хроматографии (ОФС.1.2.1.2.0001) [12]. Для идентификации состава сбора и определения результатов испытаний устанавливали внешние и микроскопические признаки (ОФС.1.4.1.0020), содержание суммы экстрактивных веществ (ОФС.1.5.3.0006), фенольных соединений (перманганатометрическое титрования на основании методики, разработанной Федосеевой Г.М. [4]. Установление содержания суммы флавоноидов и суммы простых фенолов проводили спектрофотометрическим методом на приборах - спектрофотометрах СФ-2000 (Эконова, Россия) и Leki SS1207 (Mediora OY, Финляндия). При этом для оценки содержания суммы флавоноидов использовали вариант дифференциальной спектрофотометрии на основе реакции комплексообразования с 2% раствором алюминия хлорида (ФС.2.5.0034 «Пустырника траваИ) [12]. Для определения суммы простых фенолов применили вариант прямой спектрофотометрии (ФС.2.5.0099 Толокнянки обыкновенной листья) [11]. Статистическую обработку полученных результатов химического исследования проводена в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента», валидацию предложенных методик - ОФС.1.1.0012.15 [12]. Результаты исследования и их обсуждение Учитывая патогенез уролитиаза при разработке состава сбора мочегонного подбирали компоненты, обеспечивающие следующие эффекты - уменьшение и предотвращение образования конгломератов, разрыхление камней и повышение их растворимости, восстановление коллоидной структуры мочи, а также антимикробное и антигипоксическое действия [8]. В состав разрабатываемого сбора включили сырье, обладающее необходимыми видами биологического действия, представленные в таблице 1. Таблица 1. Характеристика компонентов разрабатываемого сбора мочегонного (при мочекаменной болезни) № Компонент сбора Химический состав Биологическое действие 1 Solidaginis dahuricae herba Кумарин, умбеллиферон, герниарин, эскулетин, изокверцитрин, нарциссин, рутин, кемпферол-3-О-рутинозид, хлорогеновая кислота, 3,5-дикофеилхинная кислота, 4,5-дикофеилхинная кислота Противовоспалительное, антиоксидантное, мочегонное 2 Equiseti arvensis herba Апигенин, лютеолин, изокверцитрин, эквизетрин, нарингенин, генкванин, 6-хлорапигенин, эквизетонин, производные кремниевой кислоты Мочегонное и способ-ствующий растворению конкрементов, противовоспалительное 3 Polygoni avicalaris herba Авикулярин, кверцитрин, гиперозид, витамин К1, аскорбиновая кислота, дубильные вещества, каротиноиды, соединения кремниевой кислоты Мочегонное, растворяющее конкременты, болеутоляющее, кровоостанавливающее 4 Vaccinii vitis-idaeae folia Арбутин, гидрохинон, дубильные вещества, кемпферол, гиперозид, кверцитрин, изокверцитрин, рутин, эллаговая, хинная, урсоловая кислоты Мочегонное, антисептическое, противовоспалительное 5 Zeae maydis styli cum stigmatis Лютеолин, апигенин, ориентин, кофейная, хлорогеновая кислоты, 1,3,6-торигаллоилглюкоза, галловая кислота, витамин К1, аскорбиновая и пантоте-новая кислота, каротиноиды (крипто-ксантин), b-сито-, стигмастерин, сапонины, жирное и эфирное масло Желчегонное, кровоостанавливающее, мочегонное при мочекаменной болезни Растения, включенные в сбор, обладают: противовоспалительным, антисептическим действием - компоненты 1, 2, 3 (здесь и дальше в этом абзаце нумерация соответствует порядковым номерам в табл. 1); увеличивают растворимость конгломератов - 2, 3, 5; тормозят синтез уратов и мочевой кислоты - 5; восстанавливают коллоидную структуру мочи (растения, содержащие производные кремниевой кислоты) - 2, 3. Растения с антигипоксическим действием - 1, 2, 3 и с выраженным антиоксидантным действием - 1. При этом все компоненты - 1-5 - обладают умеренным мочегонным действием [11, 12]. Основными действующими веществами, обеспечивающими фармакотерапевтическое действие разрабатываемого сбора, являются фенольные соединения - флавоноиды и простые фенолы. Для установления рационального соотношения компонентов исследовали 6 вариантов сбора и каждый оценили по содержанию суммы фенольных соединений, флавоноидов, простых фенолов и экстрактивных веществ (табл. 2). Таблица 2. Содержание суммы биологически активных соединений и экстрактивных веществ в вариантах сбора мочегонного (при мочекаменной болезни), % Вариант сбора* Cоотношение компонентов-1:2:3:4:5* Сумма фенольных соединений Сумма флавоноидов Сумма простых фенолов Экстрактивные вещества 1 20:20:20:20:20 6,12± 0,16 1,98± 0,02 0,94± 0,04 29,88± 1,30 2 30:10:30:10:20 5,17± 0,08 0,67± 0,02 0,76± 0,01 28,12± 1,43 3 40:10:20:10:20 4,41± 0,17 0,59± 0,01 0,59± 0,01 28,12± 1,56 4 20:10:30:30:10 5,86± 0,20 0,44± 0,01 0,94± 0,02 29,02± 0,98 5 20:20:40:10:10 5,43± 0,09 1,36± 0,02 0,43± 0,01 28,72± 0,96 6 10:20:30:20:20 4,77± 0,18 1,24± 0,01 0,88± 0,02 29,32± 1,24 Примечание * - нумерация соответствует описанию в табл. 1 Вариант 1 сбора содержит максимальное количество суммы фенольных соединений, флавоноидов, простых фенолов и экстрактивных веществ. Далее была проведена стандартизация предлагаемого варианта сбора, предложены испытания, показатели идентификации и определение количественного содержания биологически активных соединений. Показатели идентификации включают внешние и микроскопические признаки. Внешние признаки: при рассмотрении сбора видна смесь кусочков красноватых или зеленых гладких стеблей, листьев зеленого, серо-зеленого цвета и мелких золотисто-желтых цветков с семенами-летучками, а также отдельных мелких корзинок с частично высыпавшимися цветками (Solidaginis dahuricae herba); кусочков стеблей и ветвей частично с узлами и влагалищами, серовато-зеленого цвета (Equiseti arvensis herba); кусочков стеблей, листьев и цветков различной формы серовато-зеленого цвета (Polygoni avicularis herba); кусочков кожистых светло- и темно-зеленых листьев (Vaccinii vitis-idaeae folia); нитевидных кусочков коричневых, красновато-коричневых или светло желтых (Zeae maydis stili cum stigmatis). Микроскопические признаки: в микропрепаратах обнаруживаются клетки эпидермиса многоугольные, практически прямостенные, с выраженной складчатостью кутикулы, устьица аномоцитного типа, волоски 2-х типов: простые, толстостенные, 2-5 клеточные, на пьедестале из 5-7 клеток, крупно щетинистые, либо слегка зазубренные; простые, тонкостенные, 2-5 клеточные с овальными клетками и с длинной конечной узкой клеткой (Solidaginis dahuricae herba); клетки эпидермиса с утолщенными прямыми или слегка извилистыми, пористыми стенками, длинные и короткие, извилистые (угловато и округло зазубренные), на коротких стенках (стыках) клеток эпидермиса, расположенных на вершине ребер (гребнях), видны выросты, иногда видны сглаженные (закругленные) зубцы, устьица расположены в основании ребер обычно в 2-3 ряда (реже в 4 и 1 ряд) с характерной лучистой складчатостью кутикулы (Equiseti arvensis herba); клетки эпидермиса с прямыми утолщенными стенками и нередко с бурым содержимым, часто имеющие четковидные утолщения, устьица окружены чаще 3 клетками эпидермиса, из которых одна значительно меньше других (анизоцитный тип), по краю листочка имеются сосочки, в мезофилле видно много друз оксалата кальция (Polygoni avicularis herba); клетки со слегка извилистыми боковыми стенками и четковидным утолщением, устьица мелкие, сопровождаются двумя околоустьичными клетками, смежные клетки которых расположены параллельно устьичной щели (диацитного), встречаются железки, состоящие из многоклеточной ножки и овальной многоклеточной головки с бурым содержимым, редко встречаются волоски - одноклеточные толстостенные прямые или изогнутые с гладкой или слабобородавчатой поверхностью (Vaccinii vitis-idaeae folia); клетки эпидермиса удлиненной формы с прямыми стенками, редкие простые волоски двух типов: продольноспаянные многоклеточные с заостренной или конической верхушкой, состоящие из 2-3 ярусов клеток в длину, и многоклеточные тонкостенные, изогнутые (Zeae maydis stili cum stigmatis) (рис. 1). Рис. 1 - Микроскопические признаки сбора мочегонного (при мочекаменной болезни): 1 - эпидермис с устьицами (а) и волосок простой толстостенный 4-5 клеточный с грубобородавчатой поверхностью (б) (×40), 2 - толстостенные с бородавчатой поверхностью (×40) Solidaginis dahuricae herba; 3 - эпидермис извилистый (а) и устьица со складчатостью (б) (×100) Equiseti arvensis herba; 4 - многочисленные друзы (а) (×100), клетки с бурым содержимым и сосочки по краю листа (б) (×40) Polygoni avicularis herba; 5 - эпидермальные клетки с четковидным утолщением и мелкие устьица (а), железка (б)( ×100) Vaccinii vitis-idaeae folia; 6 - волоски продольно-спаянные и простые (×100) Zeae maydis styli cum stigmatis. Определение основных групп активных веществ в сборе мочегонном (при мочекаменной болезни) подтверждали методом тонкослойной хроматографии на пластинке со слоем фракционированного широкопористого силикагеля на алюминиевой подложке. Использовали пластинку 1 и пластинку 2. Подвижная фаза смесь 1: бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:2. Подвижная фаза смесь 2: этилацетат-ацетон-кислота уксусная ледяная-вода 75:45:15:30. Раствор стандартного образца 1: рутина (около 10 мг СО рутина растворяют в 10 мл 96% спирта этилового). Раствор стандартного образца 2: арбутина (около 10 мг СО арбутина растворяют в 10 мл 70% спирта этилового при нагревании на водяной бане). Реактив для детектирования 1: спиртовый раствор алюминия хлорида 2% в 96% спирте этиловом. Реактив для детектирования 2: 10% раствор фосфорномолибденовой кислоты в 96% спирте этиловом. Получение извлечения. Около 1,0 г сбора помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл спирта 50%, колбу присоединяют к обратному холодильнику, доводят до кипения и кипятят в течение 30 минут. Извлечение охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр. На линию старта хроматографической пластинки 1 наносят 10 мкл извлечения и 5 мкл стандартного образца 1, пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, помещают в камеру, предварительно насыщенную смесью 1 и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт подвижной фазы пройдет 80-90% длины пластинки от линии старта, её вынимают, высушивают на воздухе до удаления следов растворителя и опрыскивают реактивом для детектирования 1. Высушивают и просматривают под лучами УФ-света (254 нм). В результате обнаруживаются на старте пятна голубого и зеленого цвета; по середине прохождения фронта - пятно буро-желтое (зона рутина), которое соответствует значению Rf СО рутина, допускается выше зоны рутина наличие пятен буроватых, желтых, желто-зеленых. На пластинку 2 наносят 50 мкл испытуемого раствора (см. «Сумма фенологликозидов в пересчёте на арбутин» в ФС.2.5.0099) и 3 мкл стандартного образца 2. Пластинку сушат на воздухе. Хроматографирование проводят в системе растворителей 2. Когда фронт растворителя пройдет 80-90% длины пластинки от линии старта, её вынимают, высушивают на воздухе до удаления следов растворителя и обрабатывают реагентом для детектирования 2. Далее выдерживают в сушильном шкафу при 100-1050С в течение 10 мин. Просматривают при дневном свете. Результат: обнаруживается зона арбутина в виде синего пятна с RfЕ0,22-0,24, расположенная на уровне адсорбции СО арбутина. Допускается обнаружение дополнительных зон адсорбции. Для количественного определения предварительно изучили электронные спектры спиртовых извлечений. При добавлении 2% раствора алюминия хлорида в спектре спиртового извлечения из сбора обнаруживается максимум при 406 нм, который близок к СО рутина [3]; а испытуемый раствор (см. «Сумма фенологликозидов в пересчёте на арбутин» в ФС.2.5.0099) характеризуется УФ-спектром с максимумом поглощения при 280 нм, характерным для СО арбутина (рис. 2). Дополнительно установили оптимальные условия выделения максимальных количеств флавоноидов, простых фенолов и экстрактивных веществ (табл. 3). Рис. 2/ - Электронные спектры спиртового извлечения: А: 1 - из сбора мочегонного (при мочекаменной болезни), 2 - СО рутина; Б: 3 - испытуемый раствор из сбора мочегонного (при мочекаменной болезни), 4 - СО арбутина Таблица 3 - Условия экстракции и содержание суммы флавоноидов, простых фенолов и экстрактивных веществ в сборе мочегонном (при мочекаменной болезни) Условия Флаво-ноиды, % Простые фенолы, % Экстрактивные вещества, % Условия Флавоноиды, % Простые фенолы, % Экстрактивные вещества, % Экстрагент Время экстракции, мин Вода 1,11 0,59 29,97 Спирт этиловый %: 20 30 40 50 60 70 80 90 96 1,22 1,62 1,73 1,98 1,31 1,12 0,77 0,80 0,68 0,64 0,75 0,85 0,89 0,94 0,92 0,83 0,61 0,38 27,54 26,98 26,71 26,87 29,76 28,56 26,12 25,12 24,07 15 30 40 60 90 1,26 1,98 1,88 1,93 1,34 0,81 0,91 0,94 0,91 0,51 22,32 29,88 29,36 28,54 28,12 Размер частиц сырья, мм 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 1,91 1,97 1,88 1,46 1,27 1,10 0,83 0,86 0,94 0,90 0,82 0,78 0,71 0,53 28,77 29,85 29,36 28.17 26,64 25,29 22,09 Соотношение сырьё: экстрагент Кратность (×) 1:50 1:100 1:150 1,97 1,51 1,38 0,86 0,94 0,69 29,57 23,54 29,09 ×2 ×3 2,17 2,28 1,11 1,37 30,07 31,18 Оптимальными условиями выделения, количественной оценки биологически активных соединений и экстрактивных веществ являются: степень измельчения сырья 2 мм; для флавоноидов экстрагент 50% спирт этиловый при соотношении сырье:экстрагент 1:50; для суммы простых фенолов экстрагент 60% спирт этиловый при соотношении сырье:экстрагент 1:100; для экстрактивных веществ экстрагент вода очищенная и соотношение сырье:экстрагент 1:50. Продолжительность полной экстракции во всех случаях - 30 минут троекратно. Результаты определения количественного содержания суммы флавоноидов, простых фенолов и экстрактивных веществ, метрологические и валидационные характеристики определения суммы биологически активных соединений представлены в табл. 4 и 5. Таблица 4. Результаты определения суммы биологически активных соединений в сборе мочегонном (при мочекаменной болезни) (f=5, P 95 %, t(P,f) =2,57) Определяемая группа Содержание, % Метрологические характеристики Норма, не менее, % Сумма флавоноидов 2,15 S2=0,078846, S=0,0006217, Ж=0,08, =4,03 2,00 Сумма простых фенолов 0,94 S2=0,0037771, S=0,001427, Ж=0,04, ==4,25 0,60 Сумма экстрактивных веществ, извлекаемых водой очищенной 31,1 S2=1,272787, S=1,619987, Ж=1,34, =4,29 25,0 Таблица 5. Валидационные характеристики методик количественного определения биологически активных соединений в сборе мочегонном (при мочекаменной болезни) Параметры Сумма флавоноидов Сумма простых фенолов Специфичность λmax спектра: а) 406; б) 406; в) 408 λmax спектра: а) 280; б) 280; в) 281 Правильность Средний процент восстановление 99,42% Средний процент восстановление 103,19% Повторяемость RSD=0,98 RSD=2,26 Сходимость Расхождение результатов составило 2% Расхождение результатов составило 3% Линейность r = 0,9992 r = 0,9987 Предложенные количественные методики для определения суммы флавоноидов и суммы простых фенолов в сборе имеют относительную ошибку отдельного результата не выше 5%, а валидационные характеристики соотвествуют критериям валидации. На основании анализа 6 серий сбора установлены требования, нормирующие качество сбора мочегонного (при мочекаменной болезни) (табл. 6). Таблица 6. Испытания и рекомендуемые нормы сбора мочегонного (при мочекаменной болезни) Испытания Фармакопейная статья Нормы, не более, % Влажность ОФС.1.5.3.0007 10,0 Общая зола ОФС.1.2.2.2.0013 12,0 Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте ОФС.1.5.3.0005 2,0 Частиц сырья, побуревших и почерневших ОФС.1.5.3.0004 3,0 Органической примеси ОФС.1.5.3.0004 5,0 Минеральная примесь ОФС.1.5.3.0004 3,0 Частиц, не проходящих сквозь сито диаметром 7 мм ОФС.1.5.3.0004 3,5 Заключение Таким образом, на осовании проведенных исследований предложены компоненты, изучен качественный состав и количественное содержание основных биологически активных соединений сбора и проведена его стандартизация.

Об авторах

Елена Геннадьевна Привалова

Иркутский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: eleprivalova@yandex.ru
доцент, кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 664003, Иркутск, ул.Красного восстания, 1

Вера Михайловна Мирович

Иркутский государственный медицинский университет

Email: mirko02@yandex.ru
профессор, доктор фармацевтических наук, заведующая кафедрой фармакогнозии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 664003, Иркутск, ул.Красного восстания, 1

Светлана Андреевна Петухова

Иркутский государственный медицинский университет

Email: lanapetukhova@gmail.com
кандидат фармацевтических наук, старший преподаватель кафедры фармакогнозии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 664003, Иркутск, ул.Красного восстания, 1

Список литературы

Дополнительные файлы