ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ЛИСТЬЕВ СВИДИНЫ ЮЖНОЙ

Полный текст

Введение Повреждение клеточных мембран, представляющих собой двойной липидный слой, лежит в основе множества патологических процессов в организме. Одним из главных факторов, вызывающих такое повреждение, является свободнорадикальное окисление липидов (пероксидация липидов), приводящее к перекисному окислению липидов (ПОЛ) [5]. Это способствует образованию перекисей липидов, альдегидов и других токсичных продуктов, влияющих на клеточные структуры и нарушающих их функции. В результате могут развиваться различные заболевания, от сердечно-сосудистых патологий и нейродегенеративных расстройств до онкологических заболеваний и воспалительных процессов. Поэтому поиск эффективных антиоксидантов, способных подавлять ПОЛ, является крайне важной задачей современной медицины [10]. Свидина южная (Cornus australis C.A. Mey.) - перспективное растение для разработки таких антиоксидантных препаратов [4]. Этот кустарник или небольшое дерево семейства кизиловых (Cornaceae) распространен на Кавказе, в Крыму, южных регионах европейской части России [1], в Турции и в некоторых регионах Европы [9]. Его высота достигает до 4 метров. Интерес к свидине южной обусловлен наличием в её составе биологически активных веществ, обладающих выраженными антиоксидантными свойствами. Литературные данные показали, что листья свидины южной содержат значительные количества розмариновой кислоты (2,86%), кофейной кислоты (2,55%) и флавоноидов (1,37%) [6]. Кроме того, анализ древесины свидины южной методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) выявил наличие холоцеллюлозы (72,27 ± 0,27%), α-целлюлозы (43,24 ± 0,17%), лигнина (16,32 ± 0,09%), а также различных сахаров: сахарозы (25,53%), фруктозы (17,10%), глюкозы (16,63%), галактозы (1,21%) и арабинозы (0,61%) [7]. Настои и отвары из листьев и цветков растения находят применение в народной медицине некоторых стран как мощное антиоксидантное средство [8]. Для обоснования перспективы фармацевтического использования растительного сырья свидины южной представляет интерес провести изучение фенольных соединений растения, которые, предположительно, вносят существенный вклад в антиоксидантную активность растения. Методика Объект исследования - листья свидины южной, заготовленные во время цветения в окрестностях г. Пятигорска Ставропольского края в июне 2022-2024 гг. Предварительный скрининг фенольных соединений водно-спиртовых извлечений изучаемого сырья осуществляли методом ТСХ [2] на пластинках «Sorbfil» марки ПТСХ-АФ-А-УФ, Россия, в системах растворителей: бутанол-кислота уксусная-вода (БУВ) в пропорциях 4:1:2 и кислота уксусная 15% [3]. Идентификацию фенольных соединений проводили в УФ-свете (365 нм) по специфической флюоресценции фенольных соединений до и после обработки хроматограмм в парах аммиака. Дальнейшее изучение качественного и количественного состава фенольных соединений проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ [2] с использованием хроматографа Dionex Ultimate 3000, снабженного УФ-детектором VWD-3000 (Thermo Scientific, США) и хроматографической колонкой Luna C18 размером 250×4,6 мм, заполненной октадецилсиликагелем с зернением 5мкм (Phenomenex, США). В работе использовали стандартные образцы (СО) кислоты галловой, хлорогеновой, кофейной, феруловой, розмариновой, коричной кислот, а также рутина лютеолина, лютеолин-7-О-гликозида, гиперозида, умбеллиферона (Sigma-Aldrich, США) с содержанием действующих веществ не менее 99,0%. Для ВЭЖХ-анализа использовали извлечения спиртом этиловым 70%-м из листьев свидины южной (1:100), полученные в режиме двукратной экстракции. Далее 2,0 мл извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки водой очищенной, перемешивали и центрифугировали при 8000 мин-1 в течении 3 минут. Хроматографировали 20 мкл полученного раствора в градиентном режиме при скорости потока 1 мл/мин. Температура образца составляла 200оС, температура колонки - 300оС. Подвижная фаза А - 1% водный раствор муравьиной кислоты, подвижная фаза В - ацетонитрил. Детектирование осуществляли спектрофотометрически при 254 нм. Программа градиента представлена в табл. 1. В этих же условиях проводили хроматографическое определение растворов стандартных образцов (СО) галловой, хлорогеновой, кофейной, феруловой, розмариновой, коричной кислот, а также лютеолина, лютеолин-7-О-гликозида, умбеллиферона. Исходные растворы СО готовили следующим образом: «Около 10 мг СО (точные навески) раздельно помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл и растворяли при перемешивании в 15-20 мл спирта этилового 70%, после чего объем раствора доводили до метки тем же растворителем». Таблица 1. Программа градиента обращенно-фазовой ВЭЖХ Время (мин.) Подвижная фаза А, % Подвижная фаза В, % 0-20 5 20 95 80 20-50 20 80 50-60 20 40 80 60 60-65 40 5 40 5 При установлении количественного содержания фенольных веществ в водном извлечении свидины южной проводили разведение исходных растворов СО и последующее их хроматографирование с получением площадей пиков, сопоставимых с площадями пиков на хроматограммах испытуемых растворов. Кроме того, проводили дальнейшие разведения с хроматографированием стандартных растворов с целью подтверждения линейной зависимости площади пиков СО от их концентрации. Идентификацию проводили по соответствию времени удерживания пиков на хроматограммах испытуемого и стандартного растворов. Расчет количественного содержания проводили по формуле: , где: S - площадь пика на хроматограмме испытуемого раствора, mAU×мин; S0 - площадь пика вещества на хроматограмме раствора СО, mAU×мин; a - навеска листьев свидины южной, г; a0 - навеска стандартного образца вещества, г: N - фактор разведения исходного раствора СО; Р - содержание вещества в СО, %; В - содержание влаги, %. Результаты исследования и их обсуждение Результаты ТСХ-анализа (табл. 2) показали наличие зон адсорбции 8 веществ в системе растворителей БУВ (4:1:2), из которых было идентифицировано 6 (рутин, лютеолин-7-О-гликозид, галловая, феруловая, хлорогеновая и кофейная кислоты). При использовании в качестве элюента кислоты уксусной 15% проявились зоны адсорбции 7 веществ, из которых идентифицировано 5 соединений (рутин, лютеолин-7-О-гликозид, галловая, феруловая и кофейная кислоты). Таблица 2. ТСХ-анализ листьев свидины южной на наличие фенольных соединений № п/п Rf Цвет зоны адсорбции Результаты идентификации УФ-свет УФ-свет и конц. NH3 Система БУВ (4:1:2) 1 0,37±0,02 светло-коричневый лимонно-желтый рутин 2 0,53±0,02 желто-зеленый желто-зеленый лютеолин-7-О-гликозид 3 0,58±0,02 коричневый коричнево-голубой кислота хлорогеновая 4 0,67±0,02 зеленый желтый кислота галловая 5 0,71±0,02 бурый бурый не идентифицирован 6 0,82±0,02 светло-голубой светло-голубой кислота кофейная 7 0,89±0,02 фиолетовый фиолетовый кислота феруловая 8 0,94±0,02 зеленый лимонно-желтый не идентифицирован Кислота уксусная 15% 1 0,05±0,02 светло-коричневый лимонно-желтый не идентифицирован 2 0,11±0,02 коричневый коричневый не идентифицирован 3 0,32±0,02 коричневый желто-зеленый лютеолин-7-О-гликозид 4 0,44±0,02 светло-фиолетовый фиолетовый кислота феруловая 5 0,49±0,02 светло-голубой светло-голубой кислота кофейная 6 0,55±0,02 светло-коричневый лимонно-желтый рутин 7 0,60±0,02 зеленый желтый кислота галловая Следует отметить, что зона адсорбции галловой кислоты характеризовалась наибольшей интенсивностью свечения, что позволило сделать вывод о доминировании в исследуемом сырье данного соединения. ВЭЖХ-хроматограмма водно-спиртового извлечения листьев свидины южной представлена на рис. 1. Рис. 1. Хроматограмма водного извлечения листьев свидины южной Методом ВЭЖХ по соответствию временам удерживания пиков на хроматограммах стандартных образцов были идентифицированы следующие фенольные соединения: фенолкарбоновые кислоты (галловая, кофейная, хлорогеновая, феруловая), флавоноиды (рутин, лютеолин-7-О-гликозид) и кумарин умбеллиферон. Результаты качественного и количественного определения фенольных соединений водного извлечения сырья представлены в табл. 3. Таблица 3. Идентифицированные фенольные соединения листьев свидины южной № п/п Вещество Время удерживания, мин Площадь пика на хроматограм-ме испытуемого раствора (S), mAU × мин Навеска СО, г Фактор разведения исходного раствора СО Площадь пика на хроматограмме раствора СО (S0), mAU × мин Содер-жание, % 1 Галловая кислота 6,287 28,723 0,0100 0,01 2,568 1,40 2 Хлорогеновая кислота 15,253 7,694 0,0112 0,01 1,694 0,62 3 Кофейная кислота 18,120 18,664 0,0125 0,0025 1,221 0,58 4 Рутин 24,513 19,766 0,0100 0,5 49,625 2,44 5 Умбеллиферон 24,927 13,414 0,0100 0,5 50,941 1,61 6 Феруловая кислота 25,527 6,257 0,0101 0,06 14,962 0,31 7 Лютеолин-7-О-гликозид 26,394 19,974 0,0120 0,04 15,870 0,74 Данные, приведенные в табл. 3, иллюстрируют, что доминантными фенольными соединениями в листьях свидины южной являются рутин (2,44%), умбеллиферон (1,61%) и кислота галловая (1,40%). Заключение В ходе представленного химического анализа листьев свидины южной, проведенного с использованием тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии, было обнаружено значительное количество биологически активных веществ фенольной природы. Эти соединения представляют собой обширный класс вторичных метаболитов растений, обладающих разнообразной фармакологической активностью, в том числе выраженными антиоксидантными свойствами. Среди идентифицированных фенольных соединений выявлены фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды и кумарины - группы веществ, известные своими мощными антиоксидантными и противовоспалительными действиями. Более детальное исследование показало, что преобладающими компонентами фенольного профиля листьев свидины южной являются рутин, галловая кислота и умбеллиферон. Количественное определение концентраций этих доминантных соединений, которое может быть проведено с помощью ВЭЖХ с УФ-детектированием или другими подходящими методами, с разработкой методик стандартизации станет важным следующим шагом в исследовании. Кроме того, перспективным направлением является выявление и идентификация других, менее распространенных фенольных соединений в листьях свидины южной, что может существенно расширить понимание фармакологического потенциала этого растения. Полученные результаты позволяют заключить, что листья свидины южной представляют собой ценный источник природных антиоксидантов и являются перспективным сырьем для разработки новых фитопрепаратов, обладающих антиоксидантным, противовоспалительным и, возможно, другими биологически значимыми свойствами. Дальнейшие исследования, включающие in vitro и in vivo эксперименты, необходимы для подтверждения биологической активности выявленных соединений и определения оптимальных методов извлечения и стандартизации фитопрепаратов на основе листьев свидины южной.

Об авторах

Христина Николаевна Гюльбякова

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: xristnik@yandex.ru
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России. Россия, 357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11

Виктория Владимировна Федотова

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России

Email: bergenya@yandex.ru
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии, ботаники и технологии фитопрепаратов Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ФГБОУ ВО «Волгоградская государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11

Список литературы

Дополнительные файлы