STUDY OF CONDITIONS FOR QUALITATIVE ANALYSIS OF FLAVONOIDS OF THE HERB ASTRAGALUS GLYCYPHYLLUS L

Full Text

Введение В настоящее время во всем мире наблюдается рост заболеваний, связанных с ухудшением экологической обстановки, в том числе, с увеличением ионизирующего излучения. Повышенный радиоактивный фон негативно действует на живые организмы и может спровоцировать развитие патологий кровеносной системы, поражения кожи, глаз, нарушения формирования и развития плода, различные онкологические заболевания. Перекисное окисление липидов, что чревато развитием хронического панкреатита [2]. Однако природа, как заботливая мать, дарит людям биологически активные соединения, способные защитить нас от вредоносных факторов. Некоторые вещества, содержащиеся в растениях, способны нейтрализовать свободные радикалы, остановить перекисное окисление липидов и защитить клетки от повреждений. Многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных ученых доказано, что таким действием обладают фенольные соединения, в частности, флавоноиды. Благодаря высокому окислительно-восстановительному потенциалу эти вещества проявляют антиоксидантную активность, первыми вступают в реакции со свободными радикалами, образующимися в процессе жизнедеятельности организма, и переводят их в неактивные соединения [12, 13, 16]. Вследствие мембраностабилизирующего действия на клетки флавоноиды замедляют их старение, оптимизируют обменные процессы в организме, укрепляют иммунную систему, повышают резистентность к воздействию неблагоприятных факторов. Благодаря такому комплексному воздействию на клетки и ткани природные антиоксиданты снижают риск развития патологий сердечно-сосудистой, нервной системы, печени и даже онкологических заболеваний [14, 15]. Источником природных антиоксидантов служат растения, в частности, многие представители многочисленного рода Астрагал (Astragalus) содержат флавоноиды [5, 7]. Тем более, что опыт народной медицины свидетельствует об эффективности применения различных видов астрагала в качестве противовоспалительных, мочегонных, гастропротекторных и гиполипидемических средств при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта [1, 3, 9, 10]. При всем многообразии рода астрагал не все его представители могут быть использованы с целью промышленной заготовки лекарственного растительного сырья, поскольку многие виды имеют небольшой ареал произрастания и, как следствие, ограниченную сырьевую базу [5, 7]. На территории Центрального федерального округа достаточно широко распространен астрагал солодколистный (Astragalus glycyphyllus L.), который может служить источником для получения флавоноидов. Целью работы явилась разработка методики качественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала солодколистного. Методика Для проведения исследования в летний период 2023-2024 гг. на территории Курской и Орловской областей была заготовлена трава астрагала солодколистного. Сырье заготавливали самостоятельно в фазу массового цветения растения. Высушенную естественным путем траву измельчали и использовали для проведения исследований. В частные фармакопейные статьи на лекарственное растительное сырье обязательно включен раздел «Определение основных групп биологически активных веществ», где приводятся качественные реакции и хроматографические методы анализа для идентификации основных биологически активных соединений [6]. Установление наличия флавоноидов в исследуемом сырье проводили в водном остатке спирто-водного извлечения из травы астрагала солодколистного, а также фракциях, полученных с помощью органических растворителей (этилацетат и бутанол), с помощью общеизвестных качественных реакций: цианидиновой (с кислотой хлористоводородной концентрированной и магниевой стружкой), цианидиновой по Брианту, со спиртовым раствором алюминия хлорида 2%, с раствором натрия гидроксида 10%, с реактивом Вильсона, с раствором ацетата свинца основным, с раствором хлорида железа (III), реакции азосочетания [8, 11]. Для разделения и идентификации индивидуальных флавоноидов был использован метод тонкослойной хроматографии на пластинках «Сорбфил». Опытным путем выясняли оптимальные условия проведения эксперимента: способ экстракции сырья, выбор хроматографических пластинок, систему растворителей, объем пробы для проведения анализа, вещества-стандарты и проявляющий агент. Для выбора способа экстракции изучили соотношения сырья к экстрагенту и природу экстрагента в фармакопейных методиках на другие виды растительного сырья, содержащего флавоноиды [6]. Таким образом, экстракция травы астрагала солодколистного была проведена пятью способами: способ 1 - 1,0 г сырья и 10 мл 96% спирта этилового (1:10), экстракция 10 минут; способ 2 - 1,0 г сырья и 30 мл 90% спирта этилового (1:30), экстракция 30 минут; способ 3 - 1,0 г сырья и 50 мл 70% спирта этилового (1:50), экстракция 60 минут; способ 4 - 1,0 г сырья и 10 мл 70% спирта этилового (1:10), экстракция 30 минут; способ 5 - 1,0 г сырья и 100 мл 70% спирта этилового (1:100), экстракция 60 минут. Аналогичным путем были выбраны системы растворителей, для чего изначально использовали следующие смеси: хлороформ - спирт этиловый 96% - вода (26:16:3); муравьиная кислота безводная - вода - этилацетат (2:3:10); уксусная кислота - вода - бутанол (1:2:4); этилацетат - толуол - уксусная кислота ледяная (25:70:5); этилацетат - кислота уксусная безводная - вода (65:15:20). Анализ проводили на хроматографических пластинках марки «Sorbfil ПТCX-AФ-A-УФ» на алюминиевой и полимерной основе. В качестве веществ-свидетелей были выбраны флавоноиды, которые, как показывает анализ литературных данных, чаще всего встречаются в растениях рода Астрагал - гиперозид и астрагалин. Полученные извлечения наносили на хроматографическую пластику с использованием микропипетки в объемах 10, 20, 30 и 40 мкл. Стандарты наносили в объеме 10 мкл. После извлечения хроматографической пластинки из камеры и высушивания отмечали пятна флавоноидов на хроматограммах в УФ-свете, затем обрабатывали специфическими проявляющими реактивами (пары аммиака, спиртовый раствор алюминия хлорида 2%, метанольный раствор циркония хлорокиси 2%) и далее снова рассматривали в УФ-свете. Критерием выбора того или иного условия проведения опыта было полное разделение на хроматограмме зон флавоноидов и визуальное обнаружение на пластинке флуоресцирующих ярких пятен. Каждое исследование было повторено 5 раз. Результаты исследования и их обсуждение С помощью качественных реакций в извлечениях из травы астрагала солодколистного было установлено наличие флавоноидов, причем их результаты указывают на наличие в изучаемом растении как флавоноидных гликозидов, так и агликонов. Экспериментальным путем были определены оптимальные условия качественного анализа флавоноидов в траве исследуемого растения методом тонкослойной хроматографии. 1,0 г сырья залить 100 мл 70% спирта этилового и экстрагировать на водяной бане 60 минут, после очистки раствора нанести на пластинку «Sorbfil ПТCX-AФ-A-УФ» с алюминиевой основой 10 мкл извлечения. Хроматографирование проводить восходящим способом, поместив пластинку в насыщенную камеру с системой растворителей хлороформ-спирт 96%-вода (26:16:3), в качестве веществ-свидетелей использовать СО гиперозид и астрагалин ООО «Фитопанацея». После высушивания обработать хроматограмму 5% раствором алюминия хлорида в спирте этиловом и рассматривать в УФ-свете. В результате опыта при параллельном нанесении стандартных образцов астрагалина и гиперозида были обнаружены пять соединений, принадлежащие флавоноидам, в том числе астрагалин и гиперозид (рис.). Рис. Схема хроматограммы качественного анализа флавоноидов в траве астрагала солодколистного в системе хлороформ - спирт 96% - вода (26:16:3). А - спирто-водное извлечение астрагала солодколистного, Б - гиперозид, В - астрагалин В рамках валидации разработанной методики оценивали специфичность, прецизионность и робастность. Определение специфичности методики осуществляли путем сравнения хроматографических данных зон флавоноидов в анализируемом растворе с зонами стандартных образцов. Было установлено, что видимые пятна веществ-свидетелей и соответствующие пятна извлечения характеризуются идентичными расположением на хроматограмме и цветом - гиперозид имеет желто-оранжевое свечение, астрагалин - желто-зеленое. Таким образом, взятые для опыта вещества-свидетели могут быть использованы для идентификации флавоноидов в траве астрагала солодколистного. Прецизионность оценивали путем повторяемости полученных результатов при проведении опыта одним исследователем с использованием одного оборудования и реактивов. Таким образом, по результатам трех опытов были получены абсолютно идентичные результаты - обнаружено 5 зон флуоресценции с идентификацией гиперозида и астрагалина. Также изучили внутрилабораторную прецизионность при проведении опыта двумя аналитиками с использованием пластинок разной серии, индивидуальным изготовлением реактивов и проведением эксперимента в разные дни. Таким образом выяснили, что хроматографические профили независимых испытаний схожи по степени окраски, расположению и размеру зон. Робастность методики оценивали по влиянию на ход эксперимента насыщенности хроматографической камеры парами растворителя. Хроматограмму помещали в ненасыщенную камеру, также спустя 30, 45 и 60 мин. после внесения системы растворителей. Было выяснено, что после предварительного насыщения хроматографической камеры парами растворителя наблюдается четкое разделение флуоресцирующих зон на пластинке, при этом время насыщения на ход эксперимента не оказывает влияния. Таким образом, результаты валидации позволяют сделать вывод, что разработанная методика пригодна для качественного анализа флавоноидов в траве астрагала солодколистного. Заключение На основе требований Государственной Фармакопеи 15 издания разработана методика качественного определения флавоноидов в траве астрагала солодколистного. Установлены оптимальные условия экстрагирования флавоноидов из сырья и проведения тонкослойной хроматографии. Разработанная методика валидирована по показателям: специфичность, прецизионность и робастность. Наличие флавоноидных соединений в исследуемом растении указывает на возможность использования травы астрагала солодколистного в качестве источника природных антиоксидантов.

About the authors

T. A Pozdnyakova

Orel State University

Author for correspondence.
Email: pozdnyakova.tatyana.72@mail.ru
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фармации ФГБОУ ВО «Орловский государственный университет им. И.С. Тургенева». I.S. Turgenev, 95, Komsomolskaya St, 302026, Orel, Russia

References

Supplementary files