Разработка метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения вирусов Хендра и Нипах

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Статья посвящена разработке способа обнаружения вирусной РНК двух высокопатогенных зоонозных вирусов из рода Henipavirus — Хендра и Нипах с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. В естественной среде эти вирусы переносятся летучими лисицами из семейства Pteropodidae. Заражению подвержены лошади и свиньи соответственно. Заболевания также передаются человеку через контакт с больными животными, их биологическими выделениями и от человека к человеку. У инфицированных людей и животных клинические признаки инфекции могут протекать бессимптомно, либо проявляющимися грипподобными симптомами на начальном этапе болезни и переходящие в неврологические заболевания и острую респираторную инфекцию с последующим летальным исходом. На сегодняшний день не разработано лечение против этих инфекций. Изученную субъединичную вакцину HeV-sG (Equivac®HeV, Zoetis Australia Pty Ltd.) используют в Австралии для лошадей против инфекции Хендра. Однако эта вакцина не используется для людей, и в настоящее время нет коммерчески доступных вакцин против вируса Нипах ни для человека, ни для животных. Необходимость разработки новых методов детекции и поиск новых вирусных мишеней по-прежнему остаются актуальным задачами в связи с большим ареалом распространения описанных вирусов, высокой контагиозностью и смертностью животных и людей. В исследовании описываются оригинальные разработанные праймеры и зонды на консервативные регионы геномов двух вирусов: гена, кодирующего нуклеокапсидный белок вируса Хендра и гена, кодирующего гликопротеин вируса Нипах. Созданы синтетические контроли прохождения этапов экстракции проб и постановки ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени, подтверждающие качество разработанного метода. Биологические образцы от здоровых людей (плазма крови, мазки со слизистых рото- и носоглотки, спинномозговая жидкость) с добавлением искусственных контролей проходили этапы выделения и постановку ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени, тем самым подтверждая качество контрольных образцов. Предел обнаружения описанных способов идентификации вирусной РНК определен как 100 копий/мл для вируса Хендра и 1000 копий/мл для вируса Нипах. Время прохождения амплификации составляет менее 90 минут. Разработанный способ поможет в эпидемиологическом контроле по распространениям данных инфекций, может применяться в диагностике вирусов Хендра и Нипах и для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств данных патогенов.

Об авторах

Светлана Алексеевна Широбокова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Автор, ответственный за переписку.
Email: schirobokova.s@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов

Россия, Санкт-Петербург

Анна Вячеславовна Шабалина

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: shabalina@pasteurorg.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов

Россия, Санкт-Петербург

Игорь Сергеевич Сухих

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: igor3419@gmail.com

к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов

Россия, Санкт-Петербург

Вера Абденнасеровна Шайеб

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: shaieb@pasteurorg.ru

к.б.н., младший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов

Россия, Санкт-Петербург

Анна Сергеевна Долгова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: dolgova@pasteurorg.ru

к.б.н., старший научный сотрудник, зав. лабораторией молекулярной генетики патогенных микроорганизмов

Россия, Санкт-Петербург

Владимир Георгиевич Дедков

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера; Институт медицинской паразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний им. Е.И. Марциновского

Email: vgdedkov@yandex.ru

к.м.н., зам. директора по научной работе, ведущий научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург; Москва

Список литературы

  1. Aljofan M. Hendra and Nipah infection: Emerging paramyxoviruses. Virus Res., 2013, vol. 177, no. 2, pp. 119–126. doi: 10.1016/j.virusres.2013.08.002
  2. Annand E.J., Horsburgh B.A., Xu K., Reid P.A., Poole B., de Kantzow M.C., Brown N., Tweedie A., Michie M., Grewar J.D., Jackson A.E., Singanallur N.B., Plain K.M., Kim K., Tachedjian M., van der Heide B., Crameri S., Williams D.T., Secombe C., Laing E.D., Sterling S., Yan L., Jackson L., Jones C., Plowright R.K., Peel A.J., Breed A.C., Diallo I., Dhand N.K., Britton P.N., Broder C.C., Smith I., Eden J.-S. Novel Hendra Virus Variant Detected by Sentinel Surveillance of Horses in Australia. Emerg. Infect. Dis., 2022, vol. 28, no. 3, pp. 693–704. doi: 10.3201/eid2803.211245
  3. Askari M.R.A., Menezes G.A., Omran H.H., Ejaz A., Ejaz H., Hameed S.S. Nipah Virus: A Threatening Outbreak. J. Clin. Diagn. Res., 2023, vol. 17, no. 2, pp. DE01–DE07. doi: 10.7860/jcdr/2023/52734.17504
  4. Bangladesh reports two Nipah deaths in 2024 to date. URL: https://open.substack.com/pub/outbreaknewstoday/p/bangladesh-reports-two-nipah-deaths?utm_campaign=post&utm_medium=web
  5. Bossart K.N., Rockx B., Feldmann F., Brining D., Scott D., LaCasse R., Geisbert J.B., Feng Y.-R., Chan Y.-P., Hickey A.C., Broder C.C., Feldmann H., Geisbert T.W. A Hendra virus G glycoprotein subunit vaccine protects African green monkeys from Nipah virus challenge. Sci. Transl. Med., 2012, vol. 4, no. 146: 146ra107. doi: 10.1126/scitranslmed.3004241
  6. Business Queensland. Summary of Hendra virus incidents in horses. URL: https://www.business.qld.gov.au/industries/service-industries-professionals/service-industries/veterinary-surgeons/guidelines-hendra/incident-summary
  7. Chakraborty S., Deb B., Barbhuiya P.A., Uddin A. Analysis of codon usage patterns and influencing factors in Nipah virus. Virus Res., 2019, vol. 263, pp. 129–138. doi: 10.1016/j.virusres.2019.01.011
  8. Daniels P., Ksiazek T., Eaton B.T. Laboratory diagnosis of Nipah and Hendra virus infections. Microbes Infect., 2001, vol. 3, no. 4, pp. 289–295. doi: 10.1016/s1286-4579(01)01382-x
  9. Dolgova A.S., Kanaeva O.I., Antonov S.A., Shabalina A.V., Klyuchnikova E.O., Sbarzaglia V.A., Gladkikh A.S., Ivanova O.E., Kozlovskaya L.I., Dedkov V.G. Qualitative real-time RT-PCR assay for nOPV2 poliovirus detection. J. Virol. Methods., 2024, vol. 329: 114984. doi: 10.1016/j.jviromet.2024.114984
  10. Eaton B.T., Broder C.C., Middleton D., Wang L.-F. Hendra and Nipah viruses: different and dangerous. Nat. Rev. Microbiol., 2006, vol. 4, no. 1, pp. 23–35. doi: 10.1038/nrmicro1323
  11. Eaton B.T., Wang L.-F. Henipaviruses. Encycl. Virol., 2008, pp. 321–327. doi: 10.1016/b978-012374410-4.00653-1
  12. Gazal S., Sharma N., Gazal S., Tikoo M., Shikha D., Badroo G.A., Rashid M., Lee S.-J. Nipah and Hendra Viruses: Deadly Zoonotic Paramyxoviruses with the Potential to Cause the Next Pandemic. Pathogens, 2022, vol. 11, no. 12: 1419. doi: 10.3390/pathogens11121419
  13. Goncharova E.A., Dedkov V.G., Dolgova A.S., Kassirov I.S., Safonova M.V., Voytsekhovskaya Y., Totolian A.A. One‐step quantitative RT‐PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. J. Med. Virol., 2020, vol. 93, no. 3, pp. 1694–1701. doi: 10.1002/jmv.26540
  14. Guillaume V., Lefeuvre A., Faure C., Marianneau P., Buckland R., Lam S.K., Wild T.F., Deubel V. Specific detection of Nipah virus using real-time RT-PCR (TaqMan). J. Virol. Methods., 2004, vol. 120, no. 2, pp. 229–237. doi: 10.1016/j.jviromet.2004.05.018
  15. Hotard A.L., He B., Nichol S.T., Spiropoulou C.F., Lo M.K. 4′-Azidocytidine (R1479) inhibits henipaviruses and other paramyxoviruses with high potency. Antivir. Res., 2017, vol. 144, pp. 147–152. doi: 10.1016/j.antiviral.2017.06.011
  16. International Committee on Taxonomy of Viruses. URL: https://ictv.global/report/chapter/paramyxoviridae/paramyxoviridae/henipavirus
  17. Jang M., Kim S. Inhibition of Non-specific Amplification in Loop-Mediated Isothermal Amplification via Tetramethylammonium Chloride. BioChip J., 2022, vol. 16, no. 3, pp. 326–333. doi: 10.1007/s13206-022-00070-3
  18. Luo G.-C., Yi T.-T., Jiang B., Guo X., Zhang G.-Y. Betaine-assisted recombinase polymerase assay with enhanced specificity. Anal. Biochem., 2019, vol. 575, pp. 36–39. doi: 10.1016/j.ab.2019.03.018
  19. Mire C.E., Satterfield B.A., Geisbert J.B., Agans K.N., Borisevich V., Yan L., Chan Y.-P., Cross R.W., Fenton K.A., Broder C.C., Geisbert T.W. Pathogenic Differences between Nipah Virus Bangladesh and Malaysia Strains in Primates: Implications for Antibody Therapy. Sci. Rep., 2016, vol. 6: 30916. doi: 10.1038/srep30916
  20. Mungall B.A., Middleton D., Crameri G., Bingham J., Halpin K., Russell G., Broder C.C. Feline model of acute nipah virus infection and protection with a soluble glycoprotein-based subunit vaccine. J. Virol., 2006, vol. 80, no. 24, pp. 12293–12302. doi: 10.1128/JVI.01619-06
  21. Murray K., Selleck P., Hooper P., Hyatt A., Gould A., Gleeson L., Westbury H., Hiley L., Selvey L., Rodwell B., Ketterer P. A Morbillivirus that Caused Fatal Disease in Horses and Humans. Science, 1995, vol. 268, no. 5207, pp. 94–97. doi: 10.1126/science.7701348
  22. Nipah virus infection – Bangladesh. URL: https://www.who.int/emergencies/disease-outbreak-news/item/2024-DON508
  23. O’Sullivan J., Allworth A., Paterson D., Snow T., Boots R., Gleeson L., Gould A., Hyatt A., Bradfield J. Fatal encephalitis due to novel paramyxovirus transmitted from horses. Lancet, 1997, vol. 349, no. 9045, pp. 93–95. doi: 10.1016/s0140-6736(96)06162-4
  24. Oliveira B.B., Veigas B., Baptista P.V. Isothermal Amplification of Nucleic Acids: The Race for the Next “Gold Standard”. Front. Sens., 2021, vol. 2: 752600. doi: 10.3389/fsens.2021.752600
  25. One dies of Nipah virus at DMCH. URL: https://www.thedailystar.net/health/disease/news/one-dies-nipah-virus-dmch-3246971
  26. Pollak N.M., Olsson M., Marsh G.A., Macdonald J., McMillan D. Evaluation of three rapid low-resource molecular tests for Nipah virus. Front. Microbiol., 2023, vol. 13: 1101914. doi: 10.3389/fmicb.2022.1101914
  27. Rota P.A., Lo M.K. Molecular Virology of the Henipaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2012, vol. 359, pp. 41–58. doi: 10.1007/82_2012_211
  28. Satterfield B.A., Dawes B.E., Milligan G.N. Status of vaccine research and development of vaccines for Nipah virus. Vaccine, 2016, vol. 34, no. 26, pp. 2971–2975. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.12.075
  29. Skowron K., Bauza-Kaszewska J., Grudlewska-Buda K., Wiktorczyk-Kapischke N., Zacharski M., Bernaciak Z., Gospodarek-Komkowska E. Nipah Virus — Another Threat From the World of Zoonotic Viruses. Front. Microbiol., 2022, vol. 12: 811157. doi: 10.3389/fmicb.2021.811157
  30. Smith I.L., Halpin K., Warrilow D., Smith G.A. Development of a fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for the detection of Hendra virus. J. Virol. Methods., 2001, vol. 98, no. 1, pp. 33–40. doi: 10.1016/s0166-0934(01)00354-8
  31. Soman Pillai V., Krishna G., Valiya Veettil M. Nipah Virus: Past Outbreaks and Future Containment. Viruses, 2020, vol. 12, no. 4: 465. doi: 10.3390/v12040465
  32. Srivastava P., Prasad D. Isothermal nucleic acid amplification and its uses in modern diagnostic technologies. 3 Biotech., 2023, vol. 13, no. 6: 3628. doi: 10.1007/s13205-023-03628-6
  33. Taylor J., Thompson K., Annand E.J., Massey P.D., Bennett J., Eden J.-S., Horsburgh B.A., Hodgson E., Wood K., Kerr J., Kirkland P., Finlaison D., Peel A.J., Eby P., Durrheim D.N. Novel variant Hendra virus genotype 2 infection in a horse in the greater Newcastle region, New South Wales, Australia. One Health., 2022, vol. 15: 100423. doi: 10.1016/j.onehlt.2022.100423
  34. Thakur N., Bailey D. Advances in diagnostics, vaccines and therapeutics for Nipah virus. Microbes Infect., 2019, vol. 21, no. 7, pp. 278–286. doi: 10.1016/j.micinf.2019.02.002
  35. Wacharapluesadee S., Hemachudha T. Duplex nested RT-PCR for detection of Nipah virus RNA from urine specimens of bats. J. Virol. Methods, 2007, vol. 141, no. 1, pp. 97–101. doi: 10.1016/j.jviromet.2006.11.023
  36. Wang J., Anderson D.E., Halpin K., Hong X., Chen H., Walker S., Valdeter S., van der Heide B., Neave M.J., Bingham J., O’Brien D., Eagles D., Wang L.-F., Williams D.T. A new Hendra virus genotype found in Australian flying foxes. Virol. J., 2021, vol. 18, no. 1, pp. 1–13. doi: 10.1186/s12985-021-01652-7
  37. WHO R&D Blueprint: Priority diagnostics for Nipah use cases and target product profiles. URL: https://www.who.int/docs/default-source/blue-print/call-for-comments/who-nipah-dx-tpps-d.pdf?sfvrsn=8a856311_4
  38. World Health Organization. Nipah Virus. URL: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/nipah-virus
  39. Yang M., Zhu W., Truong T., Pickering B., Babiuk S., Kobasa D., Banadyga L. Detection of Nipah and Hendra Viruses Using Recombinant Human Ephrin B2 Capture Virus in Immunoassays. Viruses, 2022, vol. 14, no. 8: 1657. doi: 10.3390/v14081657
  40. Yuen K.Y., Fraser N.S., Henning J., Halpin K., Gibson J.S., Betzien L., Stewart A.J. Hendra virus: epidemiology dynamics in relation to climate change, diagnostic tests and control measures. One Health, 2021, vol. 12: 100207. doi: 10.1016/j.onehlt.2020.100207

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей области-мишени

Скачать (1MB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Шестигранные кривые флуоресценции контрольных образцов вирусов Hendra (А) и Nipah (Б)

Скачать (240KB)
Метаданные

© Широбокова С.А., Шабалина А.В., Сухих И.С., Шайеб В.А., Долгова А.С., Дедков В.Г., 2025

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».