Физико-химические и антигенные свойства извлекаемых мочевиной поверхностных структур Yersinia pseudotuberculosis O:1b

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

К важным методам диагностики псевдотуберкулеза относятся иммуносерологические исследования, в частности, направленные на выявление антигенов возбудителя. Практический интерес представляют основные иммунодоминантные и видоспецифические антигены, расположенные в поверхностных структурах бактериальной клетки. В связи с этим целью работы явилось выделение и характеристика биологически активных поверхностных структур псевдотуберкулезного микроба. В работе проведен лизис живых клеток Y. pseudotuberculosis 3704 (O:1b) путем обработки их 9 M раствором мочевины с целью извлечения антигенов, локализованных в поверхностных структурах микроорганизма. Полученные субклеточные фракции — наружные мембраны (НМ), мочевинный экстракт (МЭ) и изолированный из него белковолипополисахаридный комплекс (БЛПК) — охарактеризованы по физико-химическим параметрам. Содержание белка в препаратах составило от 42 до 53%. Полипептидный спектр препарата НМ псевдотуберкулезного микроба представлен 14 мажорными полипептидами с молекулярными массами от 13,9 до 131,5 kDa, спектр МЭ — 16 полипептидами с молекулярными массами от 13,5 до 101,6 kDa, спектр препарата БЛПК — 9 полипептидами с молекулярными массами от 20,7 до 66,6 kDa. В изолированных субклеточных фракциях (НМ и МЭ) с помощью теста радиальной энзимодиффузии и субстратного электрофореза выявлены протеолитически активные белки и полипептиды. В препарате НМ таковыми явились 4 полипептида с молекулярными массами от 28,0 до 118,0 kDa, в препарате МЭ — 7 полипептидов с молекулярными массами от 29,2 до 97,7 kDa. Полученные субклеточные фракции способны проявлять иммуногенную активность при введении экспериментальным животным и антигенную активность при взаимодействии со специфическими антителами в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) и антителами, меченными наночастицами коллоидного серебра в дот-иммуноанализе (ДИА). Препараты НМ и БЛПК в ДИА с иммуноглобулинами, выделенными из экспериментальных антисывороток и меченные наночастицами коллоидного серебра, обнаруживались в концентрации ≥ 0,12 мкг/мл (по сухому весу), клетки штамма Y. pseudotuberculosis 3704 — в концентрации ≥ 3,9 × 106 м.к./мл, что аналогично результатам ДИА с иммуноглобулинами, выделенными из коммерческой псевдотуберкулезной антисыворотки (Санкт-Петербург) и меченными наночастицами коллоидного серебра. Таким образом, изолированные при использовании мочевины в качестве лизирующего и обеззараживающего агента субклеточные фракции псевдотуберкулезного микроба сохраняют свои антигенные и иммуногенные свойства, ферментативную активность, что указывает на перспективность их использования для совершенствования ранней диагностики псевдотуберкулеза.

Об авторах

Анна Витальевна Крюкова

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: adm@chumin.irkutsk.ru
ORCID iD: 0000-0002-4850-0886

младший научный сотрудник биохимического отдела

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Е. Ю. Марков

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

д.б.н., старший научный сотрудник, зав. биохимическим отделом

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

В. Б. Николаев

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

к.м.н., старший научный сотрудник биохимического отдела

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Ю. О. Попова

Федеральное казенное учреждение здравоохранения Иркутский ордена трудового Красного знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

лаборант биохимического отдела

Россия

В. Т. Климов

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

к.м.н., старший научный сотрудник эпидемиологического отдела

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

С. В. Игумнова

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

врач эпидемиологического отдела

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Н. М. Андреевская

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории диагностических сывороток

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

А. В. Уланская

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

ветеринарный врач лаборатории диагностических сывороток

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Т. Ю. Загоскина

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

д.м.н., с.н.с, зав. отделом подготовки и усовершенствования специалистов

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

М. В. Чеснокова

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

д.м.н., профессор, зав. отделом научного и учебно-методического обеспечения

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Список литературы

  1. Загоскина Т.Ю., Чеснокова М.В., Климов В.Т., Попова Ю.О., Марков Е.Ю., Старикова О.А. Конструирование тест-системы с наночастицами коллоидного серебра для обнаружения возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в дот-иммуноанализе // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017. № 1. С. 55–61. [Zagoskina T.Yu., Chesnokova M.V., Klimov V.T., Popova Yu.O., Markov E.Yu., Starikova O.A. Construction of a test-system with nanoparticles of colloid silver for detection of pseudotuberculosis and intestinal yersiniosis for causative agents in dot-immunoassay. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2017, no. 1, pp. 55–61. (In Russ.)] doi: 10.36233/0372-9311-2017-1-55-61
  2. Каримова Т.В., Климов В.Т., Чеснокова М.В. Молекулярно-биологическая характеристика Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке // Acta Biomedica Scientifica. 2016. Т. 1, № 3 (1). С. 60–64. [Karimova T.V., Klimov V.T., Chesnokova M.V. Biomolecular characteristics of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica isolated in Siberia and in the Far East. Acta Biomedica Scientifica = Acta Biomedica Scientifica. 2016, vol. 1, no. 3 (1), pp. 60–64. (In Russ.)] doi: 10.12737/21612
  3. Корнева А.В., Николаев В.Б., Половинкина В.С., Марков Е.Ю., Козлов С.Н., Мазепа А.В., Дубровина В.И., Загоскина Т.Ю., Урбанович Л.Я., Иванова Т.А., Балахонов С.В. Получение, характеристика и вакцинный потенциал поверхностных структур бактериальных возбудителей особо опасных инфекций // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2019. № 37. С. 91–92. [Korneva A.V., Nikolaev V.B., Polovinkina V.S., Markov E.Yu., Kozlov S.N., Mazepa A.V., Dubrovina V.I., Zagoskina T.Yu., Urbanovich L.Ya., Ivanova T.A., Balakhonov S.V. Purification, characteristics and vaccine potential of the surface structures of bacterial agents of especially dangerous infections. Dal’nevostochnyy zhurnal infektsionnoy patologii = The Far Eastern Journal of Infectious Pathology. 2019, no. 37, pp. 91–92. (In Russ.)]
  4. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Голубинский Е.П., Каретникова Э.С., Иванова Т.А., Николаев В.Б., Завезенов Н.П., Субычева Е.Н. Получение высокоиммуногенного препарата наружных мембран Vibrio cholerae eltor // Журнал инфекционной патологии (Иркутск). 1998. Т. 5, № 4. С. 42–48. [Markov E.Yu., Urbanovich L.Ya., Golubinsky E.P., Karetnikova E.S., Ivanova T.A., Nikolaev V.B., Zavezenov N.P., Subycheva E. N. Obtaining highly immunogenic preparation of the outer membranes of Vibrio cholerae eltor. Zhurnal infektsionnoy patologii = Journal of Infectious Pathology (Irkutsk), 1998, vol. 5, no. 4, pp. 42–48. (In Russ.)]
  5. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Голубинский Е.П., Чернов А.Б., Каретникова Э.С., Иванова Т.А., Пакулев Н.А. Наружные мембраны холерного вибриона как потенциальный компонент химической вакцины // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1995. № 2. Приложение. С. 86–89. [Markov E.Yu., Urbanovich L.Ya., Golubinsky E.P., Chernov A.B., Karetnikova E. S., Ivanova T.A., Pakulev N. A. Outer membranes of the Vibrio cholerae as a potential component of a chemical vaccine. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1995. no. 2, suppl., pp. 86–89. (In Russ.)]
  6. Патент № 2051969 C1 Российская Федерация, МПК6 С 12 Р 19/04. Способ получения бактериальных липополисахаридов; заявлено 1992.07.31: опубликовано 1996.01.10 / Марков Е.Ю., Николаев В.Б. / Патентообладатель: Иркут. н-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. 3 с. [Patent No. 2051969 C1 Russian Federation, Int. Cl.6 С l2 Р 19/04. Method of bacterial lipopolysaccharide preparing; application 1992.07.31: date of publication 10.01.1996 / Markov E.Ju., Nikolaev V.B. Proprietors: Irkutskij nauchno-issledovatel’skij protivochumnyj institut Sibiri i Dal’nego Vostoka. 3 p.]
  7. Патент № 2114436 C1 Российская Федерация, МПК6 G01N 33/52. Способ определения бактериальных липополисахаридов; заявлено 1996.05.06: опубликовано 1998.06.27 / Чернов А.Б., Марков Е.Ю. / Патентообладатель: Иркут. н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. 5 с. [Patent No. 2051969 C1 Russian Federation, Int. Cl.6 G01N 33/52. Method of assay of bacterial lipopolysaccharides; application 1996.05.06: date of publication 1998.06.27 / Chernov A.B., Markov E.Ju. Proprietors: Irkutskij nauchno-issledovatel’skij protivochumnyj institut Sibiri i Dal’nego Vostoka. 5 p.]
  8. Помогаева А.П., Уразова О.И., Ковширина Ю.В., Перевозчикова Т.В., Бармина С.Э. Клинико-иммунологические особенности псевдотуберкулеза у детей // Бюллетень сибирской медицины. 2006. № 4. С. 103–111. [Pomogayeva A.P., Ourazova O.I., Kovshirina Yu.V., Perevozchikova T.V., Barmina S.E. Clinical and immunological peculiarities of pseudotuberculosis at children. Byulleten’ sibirskoy meditsiny = Bulletin of Siberian Medicine, 2006, no. 4, pp. 103–111. (In Russ.)]
  9. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»; утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 28 января 2008 г. № 4. [Sanitary and epidemiological rules SR 1.3.2322-08 “Safety of work with microorganisms of the III–IV pathogenicity (danger) groups and pathogens of parasitological diseases”; approved by the decision of the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation approved on January 28, 2008. no. 4. (In Russ.)]
  10. Тимченко Н.Ф., Попов А.Ф. Псевдотуберкулез — прошлое и настоящее // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2014. № 4 (9). С. 51–56. [Timchenko N.F., Popov A.F. Pseudotuberculosis — past and present. Infektsionnyye bolezni: novosti, mneniya, obucheniye = Infection Diseases: News, Opinions, Training. 2014, no. 4 (9), pp. 51–56. (In Russ.)]
  11. Derbise A., Guillas C., Gerke C., Carniel E., Pizarro-Cerda J., Demeure C.E. Subcutaneous vaccination with a live attenuated Yersinia pseudotuberculosis plague vaccine. Vaccine, 2020, vol. 38, no. 8, p. 1888–1892. doi: 10.1016/j.vaccine.2020.01.014
  12. Dong W., Wang F., Zhang J., Zhou Y., Zhang L., Wang T. A simple, time-saving dye staining of proteins in sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel using Coomassie blue. Protein Gel Detection and Imaging, 2018, pp. 31–35. doi: 10.1007/978-1-4939-8745-0_5
  13. Fishman J.B., Berg E.A. Antibody purification and storage. Cold Spring Harbor Protocols, 2019, vol. 2019, no. 5, pp. 331–344. doi: 10.1101/pdb.top099101
  14. Gallagher S.R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Curr. Protoc. Cell Biol., 2007, vol. 37, no. 1, pp. 6.1.1–6.1.38. doi: 10.1002/0471143030.cb0601s37
  15. Hornbeck P. Double-immunodiffusion assay for detecting specific antibodies (Ouchterlony). Curr. Protoc. Immunol., 2017, vol. 116, pp. 2.3.1–2.3.4. doi: 10.1002/cpim.18
  16. Hu Y.F., Zhao D., Yu X.L., Hu Y.L., Li R.C., Ge M., Xu T.Q., Liu X.B., Liao H.Y. Identification of bacterial surface antigens by screening peptide phage libraries using whole bacteria cell-purified antisera. Front. Microbiol., 2017, vol. 8: 82. doi: 10.3389/fmicb.2017.00082
  17. Li H., Benghezal M. Crude preparation of lipopolysaccharide from Helicobacter pylori for silver staining and Western blot. Bio Protoc., 2017, vol. 7, no. 20: e2585. doi: 10.1094/MPMI-08-13-0248-R
  18. Tajhya R.B., Patel R.S., Beeton C. Detection of matrix metalloproteinases by zymography. Methods Mol. Biol., 2017, vol. 1579, pp. 231–244. doi: 10.1007/978-1-4939-6863-3_12
  19. Wang X., Zhang C., Shi F., Hu X. Purification and characterization of lipopolysaccharides. Subcell. Biochem., 2010, vol. 53, pp. 27–51. doi: 10.1007/978-90-481-9078-2_2
  20. Waterborg J.H. The lowry method for protein quantitation. In: Walker J.M. (ed.) The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. Third Edition. Totowa, NJ: Humana Press, 2009, pp. 7–10. doi: 10.1007/978-1-59745-198-7_2
  21. Zubova S.V., Prokhorenko I.R. Use of colorimetric method for evaluation of LPS of different structure. Bull. Exp. Biol. Med., 2006, vol. 141, no. 6, pp. 765–767. doi: 10.1007/s10517-006-0274-1

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Электрофоретическое разделение в 12% полиакриламидном геле препаратов, полученных мочевинной экстракцией из Y. pseudotuberculosis 3704. Примечание. 1 — маркер молекулярных масс, 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат мочевинного экстракта. Окраска Кумасси ярко-синим R-250.

Скачать (172KB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Электрофоретическое разделение в 12% полиакриламидном геле препарата белковолипополисахаридного комплекса, полученного из мочевинного экстракта Y. pseudotuberculosis 3704. Примечание. 1 — маркер молекулярных масс, 2 — препарат белковолипополисахаридного комплекса. Окраска ионами серебра.

Скачать (30KB)
Метаданные
4. Рисунок 3. Тест радиальной энзимодиффузии полученных препаратов из Y. pseudotuberculosis 3704 в 1% агарозном геле с использованием в качестве субстрата желатина. Примечание. 1, 2, 3, 4 — препарат наружных мембран в концентрации 8, 6, 4, 2 мг/мл, соответственно; 5, 6, 7, 8 — препарат мочевинного экстракта в концентрации 2, 4, 6, 8 мг/мл соответственно; (K+) — положительный контроль (трипсин), (K–) — отрицательный контроль (контроль растворителя).

Скачать (25KB)
Метаданные
5. Рисунок 4. Субстратный электрофорез препаратов субклеточных фракций из Y. pseudotuberculosis 3704 в 12% полиакриламидном геле с использованием в качестве субстрата раствора желатина. Примечание. 1 — положительный контроль (трипсин), 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат мочевинного экстракта. Слева указано положение маркера молекулярных масс. Окраска Кумасси ярко-синим R-250.

Скачать (51KB)
Метаданные
6. Рисунок 5. Реакция иммунодиффузии антигенных препаратов, полученных из Y. pseudotuberculosis 3704 в 1% агарозном геле с коммерческой псевдотуберкулезной антисывороткой. Примечание. 1 — липополисахарид из водной фракции, 2 — препарат мочевинного экстракта, 3 — липополисахарид из фенольной фракции, 4 — препарат наружных мембран, 5 — коммерческая поливалентная псевдотуберкулезная антисыворотка (СПб). Окраска Кумасси ярко-синим R-250.

Скачать (38KB)
Метаданные
7. Рисунок 6. Реакция иммунодиффузии антигенных препаратов Y. pseudotuberculosis 3704 и микробных взвесей в 1% агарозном геле с экспериментальной кроличьей антисывороткой, полученной против препарата белковолипополисахаридного комплекса. Примечание. 1 — препарат наружных мембран, 2 — препарат белковолипополисахаридного комплекса, 3 — микробная взвесь Y. pseudotuberculosis 3704, 4 — микробная взвесь Y. enterocolitica 628, 5 — микробная взвесь S. typhi 21, 6 — микробная взвесь S. flexneri 1964, 7 — экспериментальная псевдотуберкулезная кроличья антисыворотка.

Скачать (36KB)
Метаданные
8. Рисунок 7. Дот-иммуноанализ препаратов и микробной взвеси Y. pseudotuberculosis 3704 с изолированными из экспериментальной антисыворотки антителами, полученными против препарата белковолипополисахаридного комплекса и меченными наночастицами коллоидного серебра. Примечание. 1 — микробная взвесь Y. pseudotuberculosis 3704, 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат белковолипополисахаридного комплекса.

Скачать (71KB)
Метаданные

© Крюкова А.В., Марков Е.Ю., Николаев В.Б., Попова Ю.О., Климов В.Т., Игумнова С.В., Андреевская Н.М., Уланская А.В., Загоскина Т.Ю., Чеснокова М.В., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».