Two Key Substitutions in the Chromophore Environment of mKate2 Produce an Enhanced FusionRed-like Red Fluorescent Protein

D. A. Ruchkin; Ручкин Д. А.; A. S. Gavrikov; Гавриков А. С.; D. V. Kolesov; Колесов Д. В.; A. Yu. Gorokhovatsky; Гороховатский А. Ю.; T. V. Chepurnykh; Чепурных Т. В.; A. S. Mishin; Мишин А. С.; Eugene G. Maximov; Максимов Е. Г.; N. V. Pletneva; Плетнева Н. В.; V. Z. Pletnev; Плетнев В. З.; A. M. Pavlova; Павлова А. М.; V. A. Nikitin; Никитин В. А.; A. M. Bogdanov; Богданов А. М.

doi:10.32607/actanaturae.27545

Две ключевые замены в хромофорном окружении белка mKate2 для получения улучшенного FusionRed-подобного красного флуоресцентного белка

Авторы: Ручкин Д.А.¹, Гавриков А.С.¹, Колесов Д.В.¹, Гороховатский А.Ю.¹, Чепурных Т.В.¹, Мишин А.С.¹, Максимов Е.Г.², Плетнева Н.В.¹, Плетнев В.З.¹, Павлова А.М.¹^,3, Никитин В.А.¹^,2, Богданов А.М.¹^,4
Учреждения:
1. Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
2. Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
3. Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова
4. Измирский институт технологий
Выпуск: Том 17, № 2 (2025)
Страницы: 118-131
Раздел: Экспериментальные статьи
URL: https://bakhtiniada.ru/2075-8251/article/view/309593
DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.27545
ID: 309593

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Красные флуоресцентные белки (RFP) часто используются в качестве предпочтительных флуоресцентных меток в микроскопии живых тканей и визуализации целого организма. При выборе конкретного варианта RFP приоритетными могут быть такие характеристики, как молекулярная яркость флуоресценции, скорость созревания хромофора, мономерность, длины волн возбуждения/эмиссии флуоресценции и низкая токсичность, которые в конкретном белке редко сочетаются оптимальным образом. Если же к метке предъявляются дополнительные требования, такие как продолжительное время жизни флуоресценции и/или мигание (blinking), то доступный набор вариантов может существенно сузиться. Поскольку все разнообразие традиционных моногенных RFP относится лишь к нескольким филогенетическим линиям (основные из которых – производные DsRed, eqFP578 и eqFP611), их практически значимые свойства ожидаемо распределены между близкими гомологами. В таких случаях систематический мутационный анализ, ориентированный на вариант-специфичные аминокислотные остатки, может пролить свет на происхождение различий между родственными RFP и быть полезным для объединения их преимуществ в новых вариантах RFP. Так, белок FusionRed, эффективный для флуоресцентного мечения благодаря высокой степени мономерности и низкой цитотоксичности, имеет значительно сниженные яркость и время жизни флуоресценции по сравнению с предковым mKate2. Нами охарактеризован новый быстро созревающий мономерный RFP, полученный на основе mKate2 и FusionRed, превосходящий оба родительских белка по молекулярной яркости, обладающий увеличенным временем жизни флуоресценции и спонтанным миганием, перспективным для наноскопии.

Ключевые слова

RFP, FusionRed, mKate2, флуоресцентный белок, время жизни флуоресценции

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФБ – флуоресцентные белки; RFP – Red fluorescent protein, красные флуоресцентные белки; FLIM – Fluorescence lifetime imaging microscopy, микроскопия времени жизни флуоресценции; BALM – Bleaching/Blinking Assisted Localization Microscopy, локализационная микроскопия с использованием фотообесцвечивания и мигания; OSER – Organised smooth endoplasmic reticulum, организованный гладкий эндоплазматический ретикулум; NE – nuclear envelope, ядерная оболочка; PEI – полиэтиленимин; SMLM – single molecule localization microscopy, микроскопия одиночных молекул.

ВВЕДЕНИЕ

Современные методы биологической визуализации используют огромное разнообразие флуоресцентных меток, среди которых предпочтение часто отдается генетически кодируемым флуорофорам, таким как флуоресцентные белки (ФБ). ФБ обеспечивают высокоспецифичное внутриклеточное мечение и позволяют реализовать продвинутые модальности флуоресцентной визуализации, микроскопию сверхвысокого разрешения и времени жизни флуоресценции (FLIM) на уровне живых клеток [1, 2]. В свою очередь, красные флуоресцентные белки (RFP), полифилетическая группа [3–6] ФБ из кораллов (Anthozoa), флуоресцирующие в красной области спектра, широко применяются для визуализации мишеней в целом организме и/или в глубине биологической ткани. Красные и дальнекрасные ФБ зачастую оказываются оптимальным вариантом выбора в таких исследованиях благодаря сниженному поглощению биологическими тканями света на длинах волн ~ 600–1200 нм (в так называемом «диагностическом окне») [7–9].

FusionRed – один из существующих вариантов RFP [10], часто используется как метка для визуализации живых клеток (включая визуализацию тонких внутриклеточных структур). Способность FusionRed поддерживать высоко мономерное состояние даже при высоких локальных концентрациях (характерных для некоторых локализаций в клетках млекопитающих [11, 12]) называется «супермономерностью» и сочетается в этом белке с низкой токсичностью и низкой чувствительностью к рН среды. Благодаря такому набору свойств, FusionRed подходит в качестве флуоресцентного ядра для генетически кодируемых индикаторов, а мечение им других белков не влияет на их функциональную активность и пространственную структуру [13–16]. В то же время у FusionRed есть ряд выраженных недостатков, снижающих его практическую ценность как многоцелевого маркера и создающих предпосылки для дальнейшей оптимизации этого RFP. Так, изящные исследования лаборатории Хименеса позволили с помощью направленной белковой эволюции [17] и полурационального дизайна [18] получить более яркие варианты FusionRed (в частности, FusionRed-MQV [19] показал примерно четырехкратный прирост молекулярной яркости относительно родительского белка, хотя и ценой 20 нм гипсохромного сдвига максимума эмиссии). Кроме того, результаты рентгеноструктурного анализа показали, что примерно половина молекул FusionRed несет хромофор в незрелой форме [20]. Эта особенность значительно снижает эффективную яркость FusionRed как флуоресцентной метки (относительно ожидаемой на основании измеренной молекулярной яркости флуоресцентного белка) и становится еще одним направлением структурно-обоснованного дизайна новых вариантов RFP.

Важно отметить, что FusionRed (λ_em = 608 нм) – дочерний вариант наиболее яркого на данный момент мономерного дальнекрасного ФБ mKate2 (λ_em = 633 нм) [21], от которого он отличается 17 аминокислотными заменами, введенными полурационально при помощи нескольких раундов сайт-направленного и случайного мутагенеза [10]. При этом структурные основы спектральных различий (в коэффициентах экстинкции, квантовых выходах и временах жизни флуоресценции, положениях максимумов поглощения/испускания) между белками FusionRed и mKate2 не установлены. Основываясь на анализе пространственной структуры FusionRed [20], мы сделали предположение о ключевой роли трех остатков в окружении хромофора, Arg-67, Cys-158 и His-197 (Lys-67, Ala-158 и Arg-197 для mKate2 соответственно) как детерминант описанных спектральных различий. В настоящем исследовании мы систематически изучили влияние указанных положений на свойства обоих белков методом сайт-направленного мутагенеза. Среди представителей полученной библиотеки обнаружен вариант, обладающий повышенной яркостью и высоким спектральным сходством с FusionRed – mKate2-K67R/R197H. Этот RFP наследует достоинства обоих родственных белков: моноэкспоненциальное затухание флуоресценции, как у mKate2, и способность эффективно функционировать в составе белков слияния, как у FusionRed. Очищенный mKate2-K67R/R197H продемонстрировал способность к выраженному спонтанному миганию флуоресценции (blinking), открывающую перспективу использования этого белка в микроскопии сверхвысокого разрешения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Сайт-направленный мутагенез

Сайт-направленные аминокислотные замены в mKate2 и FusionRed вносили с использованием модифицированной процедуры IVA-клонирования [22]. Гены исходных RFP клонировали в векторную основу pQE-30 (Qiagen, США) по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII и использовали в качестве матриц для ПЦР. Прямые праймеры содержали 5’-концевую область длиной 15–20 нуклеотидов, гомологичную матричной ДНК, необходимую для бактериальной рекомбинации. За ней следовал триплет с целевой заменой и 3’-концевая область с расчетной температурой отжига 60°C. Обратные праймеры включали аналогичную последовательность для рекомбинации длиной 15–20 нуклеотидов на 5’-конце и 3’-концевую последовательность, вместе составляющие олигонуклеотид с расчетной температурой отжига 60°C. Если расчетные температуры отжига оказывались выше, то 5’-концевой фрагмент отжигался частично. 3’- и 5’-Концевые нуклеотиды обоих праймеров подбирали так, чтобы избегать комплементарного спаривания и минимизировать гомо- и гетеродимеризацию. 3’-Концы праймеров образовывали сильную комплементарную пару с матричной последовательностью. Олигонуклеотиды не образовывали тупых концов при гомо- и гетеродимеризации. В ПЦР использовали полимеразу Phusion (ThermoFisher, США), протокол, рекомендованный производителем, 35 циклов элонгации. Концентрация матричной ДНК составляла 50 нг на реакцию. Последовательности использованных праймеров:

a) FusionRed-R67K:

Прямой – 5’-agcttcatgtacggcagcaaaaccttcatcaagcaccctccgg-3’

Обратный – 5’-gctgccgtacatgaagctggtag-3’

b) FusionRed-C158A: описан в предыдущем исследовании [20]

Прямой – 5’-cggcggcctggaaggcgcagcagacatggccctgaagctcg-3’

Обратный – 5’-tgcgccttccaggccgccgtcagcggggtacatcgtctcg-3’

c) FusionRed-H197R:

Прямой – 5’-ggcgtctacaacgtggacagaagactggaaagaatcaaggaggc-3’

Обратный – 5’-gtccacgttgtagacgccgggcatcttgaggttcgtagcg-3’

d) mKate2-K67R:

Прямой – 5’-agcttcatgtacggcagcagaaccttcatcaaccacacccaggg-3’

Обратный – 5’-tgctgccgtacatgaagctggtag-3’

e) mKate2-А158С:

Мутантный вариант получен ранее [21]

Прямой – 5’-ggcctggaaggcagatgcgacatggccctgaagctcg-3’

Обратный – 5’-tctgccttccaggccgccgtcagcggggtacag-3’

f) mKate2-R197H:

Прямой – 5’-ggcgtctactatgtggaccacagactggaaagaatcaaggaggc-3’

Обратный – 5’-gtccacatagtagacgccgggcatcttgaggttcttagcg-3’.

Преципитированные продукты ПЦР обрабатывали эндонуклеазой рестрикции DpnI для удаления матриц. При трансформации 100 мкл компетентных клеток E. coli XL1-Blue (Evrogen, Россия) брали 700 нг продукта ПЦР.

Выделение и очистка белка

Варианты ФБ экспрессировали в штамме E. coli XL1-Blue в течение 72 ч при 37°C. После центрифугирования бактериальную биомассу ресуспендировали в PBS (GIBCO, ThermoFisher Scientific, США, pH 7.4) и обрабатывали ультразвуком на Sonics Dismembrator (Fisher Scientific, США). Очистку белков проводили на металл-аффинной смоле TALON (Clontech, США), предварительно промытой PBS в соответствии с протоколом производителя. Для элюции использовали 0.3 М раствор имидазола (pH 8.0). Элюаты белков обессоливали и концентрировали методом ультрафильтрации на колонках Amicon Ultra 0.5 10K (Merck Millipore, США). Обессоленный раствор белка (обычно с концентрацией ~ 5 мг/мл) анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) или спектроскопически, либо кратковременно хранили при 4°C до использования.

Абсорбционная и флуоресцентная спектроскопия

Спектры поглощения и флуоресценции получали с помощью спектрофотометра Cary100 UV/VIS и спектрофлуориметра Cary Eclipse (Agilent Technologies, США) соответственно. Во всех случаях использовали раствор белка в PBS (pH 7.4). Квантовые выходы флуоресценции и молярные коэффициенты экстинкции определяли как описано ранее [20].

Исследование мономерности

Гель-фильтрация. Колонку Superdex® 200 Increase 10/300 GL (Cytiva, Швеция), уравновешенную 20 мМ натрий-фосфатным буфером (pH 7.4) с концентрацией NaCl 150 мМ, использовали в составе хроматографической системы Agilent 1260 Bio-Inert LC, оснащенной встроенным детектором поглощения и флуоресценции на базе светодиодов (diode array detector) Agilent 1260 и детектором флуоресценции Agilent 1260 при 24°C и со скоростью потока 0.75 мл/мин. Для калибровки использовали цитохром c (12.4 кДа), карбоангидразу (29 кДа), бычий сывороточный альбумин (66 кДа), алкогольдегидрогеназу (150 кДа), β-амилазу (200 кДа) и ферритин (450 кДа). Подробности калибровки представлены на рис. S6 и в табл. S1. Оборудованием управляли с помощью программного обеспечения Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition C.01.07 SR3.

OSER-тест. OSER-тест проводили в двух вариантах. Первый, на клетках HeLa, был аналогичен описанному в [12]. Клетки трансфицировали FuGENE® HD Transfection Reagent (Promega, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Микрофотографии получали с помощью флуоресцентной широкопольной микроскопии на модифицированном инвертированном микроскопе Leica 6000LX, оснащенном флуоресцентным фильтр-кубом для mCherry (см. раздел «Широкопольная флуоресцентная микроскопия»). Изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения Fiji ImageJ (версия 2.9.0/1.54b). «Завитки» (whorl-like structures [23]) обнаруживали в соответствии с рекомендациями Constantini и соавт. [23]. Из-за отсутствия этих структур более чем в 80% трансфицированных клеток HeLa и связанной с этим сложности обнаружения достаточного для статистического анализа количества клеток с такими структурами, расчет соотношений интенсивности флуоресценции структур организованного гладкого эндоплазматического ретикулума (organised smooth endoplasmic reticulum, OSER) и ядерных оболочек (nuclear envelope, NE) не проводился.

Второй вариант теста OSER был аналогичен варианту, описанному в [23]. Клетки U2OS трансфицировали с помощью полиэтиленимина (PEI, Sigma-Aldrich, США) и наблюдали спустя 18 ч после трансфекции; изображения анализировали с использованием программного обеспечения Fiji ImageJ для получения средних значений сигналов NE и OSER. Линейные целевые области (ROI) выбирали инструментом обводки «straight»; для ROI OSER использовали инструмент «freehand». Для NE выбирали не менее трех ROI в различных локализациях для каждой клетки. Расчеты проводили в GraphPad Prism10.

Инженерия конструкций для экспрессии в клетках млекопитающих. Плазмиды для экспрессии в клетках млекопитающих кодировали слитые белки Diogenes с виментином (Vimentin-Diogenes), лайфактом (lifeact-Diogenes), энсконсином (ensconsin-Diogenes) и цитокератином (Diogenes-cytokeratin), а также с сигнальной последовательностью мембранного якоря белка эндоплазматического ретикулума СytERM (используемого для OSER). Конструкции получали с помощью методики Golden Gate в соответствии со стандартной процедурой MoClo [24–26]. Для обеспечения экспрессии в клетках млекопитающих каждая транскрипционная единица находилась под контролем цитомегаловирусного (CMV) промотора, содержала последовательность, кодирующую белок слияния, и терминатор SV40. Для Golden Gate использовали T4-лигазный буфер (SibEnzyme, Россия). Каждая реакция включала 10 U T4-лигазы и 20 U эндонуклеаз рестрикции BsaI либо BpiI (ThermoFisher) и 100–200 нг ДНК каждого фрагмента. Условия реакции включали 30 циклов инкубации при 37°C и 16°C (90 с при 37°C, 180 с при 16°C).

Широкопольная флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентную микроскопию проводили на инвертированном микроскопе Leica 6000LX с масляным иммерсионным объективом Leica HCX PL APO 100X/1.40–0.70NA, камерой Zyla sCMOS (Andor, Великобритания) и источником света CoolLED pE-300, оснащенным кубическим фильтром для mCherry (Leica, Германия) (фильтр возбуждения: 560/40 нм, фильтр эмиссии: 630/75 нм). Мощность освещения варьировали от 1 до 5 Вт/см², время экспозиции составляло от 50 до 150 мс.

Измерение pH-стабильности

При подготовке образцов использовали ряд готовых буферных растворов с pH 3–10.55; растворы содержали (мМ): 130 KCl, 30 NaCl, 0.5 MgCl₂, 0.2 EGTA и 30 HCl–NaH₂C₆H₅O₇ (pH 3.0–4.5) или 15 KH₂PO₄-Na₂HPO₄ (pH 5.0–7.5) или 20 Na₂B₄O₇-HCl/NaOH (pH 8.0–11.0) [27]. Концентрация очищенного и обессоленного RFP в каждом образце составляла 5 мкг/мл. Спектры эмиссии измеряли на флуоресцентном спектрометре Cary Eclipse дважды в трех временных точках (немедленно, 3 и 5 мин спустя, всего 6 измерений на образец) в спектральном диапазоне от 560 до 700 нм при λ_ex = 540 нм и ширине щелей возбуждения/эмиссии 5 нм, при одинаковом напряжении на фотоумножителе и скорости сканирования. Значения интенсивности флуоресценции в максимумах эмиссии усредняли по 6 измерениям. Усредненные данные при всех значениях pH для каждого RFP нормировали на максимальное значение и отображали на графике со стандартными отклонениями. Для сигмоидных участков графиков строили кривые аппроксимаций в GraphPad Prism10 (логистическая кривая 4PL, 95% доверительный интервал, n = 6). pKa определяли по значению pH, при котором показатель нормированной флуоресценции на аппроксимирующей кривой достигал половины от максимального.

Измерение времени жизни флуоресценции

Наносекундный и пикосекундный источники возбуждения. Коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов (TCSPC) проводили на флуоресцентном спектрометре miniTau (Edinburgh Instruments, Великобритания) в окне 20 нс, разделенном на 2048 временных каналов. Флуоресценцию возбуждали с помощью: (i) пикосекундного лазера EPL-450 (Edinburgh Instruments, Великобритания) с центральной длиной волны эмиссии 445.6 нм и шириной импульса (FWHM) примерно 90 пс при частоте повторения 20 МГц; (ii) наносекундного импульсного светодиода EPLED-590 (Edinburgh Instruments, Великобритания) с центральной длиной волны эмиссии 590 нм, шириной импульса (FWHM) примерно 1.3 нс при частоте повторения 20 МГц.

Фотоны регистрировали в спектральном диапазоне 575–625 нм. Обработку данных, визуализацию и определение χ² (тест Пирсона) проводили с использованием программного обеспечения Fluoracle 2.5.1 (Edinburgh Instruments, Великобритания).

Фемтосекундный источник возбуждения. Кинетика затухания флуоресценции RFP была записана с использованием детектора единичных фотонов (SPC) с ультранизким уровнем темнового счета (HPM-100-07C, Becker & Hickl, Германия) в спектральном окне 620/10, настроенном с помощью монохроматора ML-44 (Solar, Беларусь). Флуоресценцию возбуждали при 590 нм (частота повторения 80 МГц, ширина импульса 150 фс, оптическая мощность 5 мВт) с использованием второй гармоники (ASG-O, Avesta Project LTD., Россия) фемтосекундного оптического параметрического осциллятора (TOPOL-1050-C, Avesta Project LTD.), накачиваемого фемтосекундным лазером Yb (TEMA-150, Avesta Project LTD.). Сигнал эмиссии собирался перпендикулярно лучу возбуждения. Температуру образца поддерживали на уровне 25°C в течение эксперимента с помощью держателя кюветы (Qpod 2e) с магнитной мешалкой (Quantum Northwest, США). Данные собирали при помощи программного обеспечения SPCM Data Acquisition Software v. 9.89 (Becker & Hickl, Германия). Для экспоненциальной аппроксимации затухания флуоресценции с учетом неполного угасания RFP на высокой частоте повторения использовали ПО SPCImage (Becker & Hickl, Германия). Проводили постобработку и визуализировали данные в Origin Pro 2018 (OriginLab Corporation, США).

Измерения фотостабильности

Очищенные белки, низкая интенсивность возбуждения. Измерения проводили для RFP, иммобилизованных на металл-аффинной смоле TALON, с использованием лазерного сканирующего конфокального инвертированного микроскопа Leica DMIRE2 TCS SP2 (Leica Microsystems, Германия), оснащенного масляным иммерсионным объективом HCX PL APO lbd.BL 63× 1.4NA и HeNe-лазером мощностью 1.2 мВт. Флуоресценцию возбуждали лазером с линией испускания 543 нм и детектировали в спектральном диапазоне 560–670 нм. Выбранное поле зрения (при увеличении 16×) непрерывно сканировали в режиме time-lapse (between the frames), количество изображений в серии 500–1500. Красный сигнал детектировали при мощности лазера 10–20% и напряжении фотоумножителя (ФЭУ, PMT) 700–800 В. Для фотообесцвечивания флуорофоров применяли максимальную мощность лазера (что обеспечивало плотность мощности около 2 Вт/см²). Измерения флуоресценции корректировали на фоновый сигнал, усредняли (n = 5) и нормировали по максимальному значению. Общую мощность возбуждающего света на выходе из объектива микроскопа измеряли с использованием измерителя мощности LaserCheck (Coherent, США). Плотность мощности излучения (Вт/см²) определяли как частное общей мощности и площади сканируемой области.

Измерения фотостабильности in cellulo, высокая интенсивность возбуждения. RFP транзиентно экспрессировали в клетках линии HeLa без сигнала специфической внутриклеточной локализации. Кинетику фотообесцвечивания измеряли на микроскопе Nanoimager S (ONI, Великобритания), оснащенном масляным иммерсионным объективом Olympus UPlanSApo 100× NA 1.40, лазером с длиной волны 561 нм, дихроическим делителем луча 560 нм и камерой Scope8 sCMOS. Плотность мощности при облучении составляла 800 Вт/см². Сигнал записывали непрерывно с минимальными задержками между кадрами. Данные анализировали с использованием Fiji ImageJ версии 1.53f51 [28].

Микроскопия локализации одиночных молекул

Непосредственно перед визуализацией культуральную среду заменяли на минимальную среду (MEM, Sigma-Aldrich, США), содержащую 20 мМ HEPES. Для локализационной микроскопии с использованием фотообесцвечивания/мигания (BALM) использовали микроскоп Nanoimager S (ONI, Великобритания), оснащенный масляным иммерсионным объективом Olympus UPlanSApo ×100 NA 1.40, лазером 561 нм, дихроическим делителем луча 560 нм и камерой Scope8 sCMOS. Визуализацию выполняли при следующих условиях: лазер 561 нм с мощностью 2 кВт/см², временем регистрации кадра 16.7 мс и скоростью захвата 60 кадров в секунду. Съемку с использованием вспышек лазера 405 нм проводили при следующих условиях: лазер 561 нм с мощностью 2 кВт/см² с 0.4-секундными вспышками лазера 405 нм с плотностью мощности ~ 215 Вт/см² каждые 22 с, временем регистрации кадра 16.7 мс и скоростью захвата 60 кадров/с. Различие между отношением сигнал/шум локализаций mKate2-K67R/R197H, TagRFP-T и mKate2 проверяли с использованием теста Колмогорова–Смирнова. Мигания одиночных молекул и реконструкцию сверхразрешенных изображений осуществляли с использованием программного обеспечения NimOS 490 версии 1.18.3.15066 (ONI, Великобритания). Для реконструкции изображения использовали стандартные параметры. Данные анализировали с использованием Fiji ImageJ версии 1.53f51 [29] и пользовательских скриптов на Python 3.9.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Положения 67, 158 и 197 ранее были идентифицированы как ключевые, регулирующие поведение хромофора FusionRed [20]. Чтобы конкретизировать вклад отдельных аминокислотных замен в окружении хромофоров FusionRed и mKate2, определяющих различия между физико-химическими свойствами этих белков, мы провели систематический мутационный анализ. Мутантные варианты в полученном наборе отличались от родительских белков по одному, двум либо трем указанным аминокислотным положениям (рис. S1).

Характеристика мутантных вариантов FusionRed и mKate2

Варианты, несущие одиночные аминокислотные замены. Показаны различия в эффектах замены в положении 67 (Arg ↔ Lys) в исходных белках. Так, вариант mKate2-K67R практически не поглощал и не излучал в видимом диапазоне спектра. Эта аминокислотная замена, вероятно, существенно повлияла на сворачивание белка и/или созревание его хромофора. Напротив, обнаружено несколько спектральных форм FusionRed-R67K, которые, вероятно, соответствуют различным структурам хромофора (табл. 1, рис. S2). Пики поглощения FusionRed-R67K совпадали с пиками возбуждения флуоресценции: 389, 514 и 580 нм. Красная флуоресцентная форма (λ_abs/ex = 580 нм, λ_em = 610 нм) была близка к таковой в исходном FusionRed, в то время как обе коротковолновые спектральные популяции, предположительно, соответствовали интермедиатам «созревания» хромофора.

Таблица 1. Спектральные свойства и особенности созревания хромофора, наблюдаемые в наборе одиночных, двойных и тройных реципрокных мутантных вариантов FusionRed и mKate2

Белок	Максимум поглощения, нм	λ_ex / λ_em, нм	EC^а (M^-1см^-1)	FQY^б	Молекулярная яркость (EC × QY / 1000)	Комментарий
FusionRed- R67K/C158A/H197R	376; 488; 583	376/409; 488/508; 583/616	н/о	<0.05	н/о	Плохое созревание*
FusionRed- C158А/H197R	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о	Плохое созревание*
FusionRed- R67K/H197R	380; 488; 584	380/449; 488/511; 584/616	н/о	0.62	н/о
FusionRed- R67K/C158A	386; 513; 580	н/о	н/о	н/о	н/о	Плохое созревание*
FusionRed-H197R	н/о	570/607	н/о	<0.01	н/о	Плохое созревание*
FusionRed-С158A	571	571/598	91 000	0.24	21.84	[20]
FusionRed-R67K	389; 514; 580	389/450; 514/522; 580/610	н/о	0.3	н/о
FusionRed	580	580/608	94 500	0.19	17.9	[10]
mKate2	586	588/633	62 500	0.4	25	[21, 33]
mKate2-K67R	405; 588	н/о	н/о	н/о	н/о	Плохое созревание*
mKate2-A158C	380; 590	590/624	47 300	0.47	22.2	[20]
mKate2-R197H	385; 510; 582	510/520; 582/612	н/о	0.26	н/о
mKate2-K67R/A158C	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о	Плохое созревание*
mKate2-K67R/R197H	579	579/603	90 000	0.44	39.6
mKate2-A158C/R197H	380; 513; 583	380/435; 583/611	н/о	0.39	н/о
mKate2-K67R/A158C/R197H	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о	Плохое созревание*

Примечание. н/о – не определен.

^аКоэффициент молярной экстинкции; не определялся для вариантов с несколькими спектральными формами.
^бКвантовый выход флуоресценции; измерялся только для красной спектральной формы.

*Пометка применялась в случаях, если через 48 ч после трансформации наблюдалась слабая или не детектируемая флуоресценция биомассы бактерий и/или низкое относительное поглощение в спектральном диапазоне, связанном с поглощением хромофора (например, A280/A580 > 10).

Мы предполагаем, что синяя спектральная форма (λ_abs/ex = 389 нм, λ_em = 450 нм) соответствует нейтральному GFP-подобному хромофору – хорошо описанному промежуточному продукту созревания DsRed-подобного хромофора [30, 31]. Желтая флуоресцентная форма (λ_abs_/_ex = 514 нм, λ_em = 522 нм) FusionRed-R67K, спектрально схожая с классическими желтыми флуоресцентными белками (EYFP, TagYFP) с GFP-подобным хромофором, формирующим π-стекинг-взаимодействие с остатком тирозина-203 [32], менее типична для RFP. Возможно, замена R67K привела к частичному «замораживанию» созревания хромофора FusionRed на предпоследнем этапе окисления, где GFP-подобный интермедиат хромофора в анионной форме (обычно поглощающий на 470–500 нм) мог сформировать стекинг-взаимодействие с имидазольным кольцом гистидина-197, претерпев батохромный спектральный сдвиг.

Влияние замены в позиции 158 (Cys↔Ala) на спектральные свойства FusionRed и mKate2 было описано ранее [20]. Хотя эта замена не привела к образованию новых спектральных форм или сильному ингибированию созревания хромофора (или заметным изменениям молекулярной яркости), мы включаем данные о соответствующих мутантах (FusionRed-C158A и mKate2-A158C) в табл. 1 для единообразия.

Замены в положении 197 (His↔Arg) вызывали изменения физико-химических свойств белков, противоположные вызванным заменой R67K/K67R. Подобно mKate2-K67R, FusionRed-H197R практически не поглощал в видимом спектральном диапазоне и почти не флуоресцировал в силу нарушенного созревания хромофора. Максимумы поглощения mKate2-R197H располагались на длинах волн 385, 510 и 582 нм. Последние две соответствовали также максимумам возбуждения флуоресценции с λ_em = 520 и 612 нм соответственно (табл. 1, рис. S3). Идентичность и происхождение этих спектральных форм предположительно совпадают с таковыми для FusionRed-R67K. Выраженный гипсохромный сдвиг максимумов поглощения/эмиссии красной формы mKate2-R197H по сравнению с исходным белком mKate2 (582/612 нм против 588/633 нм) подтверждает ключевую роль His-197 в детерминировании спектрального своеобразия FusionRed.

Варианты, содержащие комбинации из двух аминокислотных замен. Введение двух аминокислотных замен в оба белка в целом снижало эффективность созревания хромофора. Три из шести полученных вариантов с двумя заменами имели либо чрезвычайно слабые, либо не детектируемые полосы поглощения и эмиссии флуоресценции в видимом диапазоне (см. табл. 1). У сравнительно яркого варианта FusionRed-R67K/H197R замены в позициях 67 и 197 компенсировали эффекты друг друга. В этом белке замена R67K, по-видимому, способствует «разблокированию» созревания хромофора, которое ингибируется заменой H197R. У FusionRed-R67K/H197R обнаружены три флуоресцентные формы (табл. 1, рис. S4): нейтральная синяя GFP-подобная (λ_abs/ex = 380 нм, λ_em = 449 нм), анионная зеленая GFP-подобная (λ_abs/ex = 488 нм, λ_em = 511 нм) и красная DsRed-подобная (λ_abs/ex = 584 нм, λ_em = 616 нм). Красная флуоресцентная форма FusionRed-R67K/H197R показала выраженный батохромный сдвиг как спектра поглощения, так и спектра эмиссии флуоресценции (на 4 и 8 нм соответственно) по сравнению с исходным FusionRed, что дополнительно указывает на роль заместителя в позиции 197 в детерминировании спектрального своеобразия красных флуоресцентных белков.

Вариант mKate2-A158C/R197H показал сложное спектральное поведение (табл. 1, рис. S5), схожее с наблюдаемым у белков FusionRed R67K и mKate2 R197H. Замена R197H в mKate2-A158C/R197H, вероятно, привела к гипсохромному сдвигу спектра флуоресценции красной формы и вовлечению незрелой «зеленой» формы хромофора в стекинг-взаимодействие, приводящее к образованию «желтой» нефлуоресцентной спектральной формы с максимумом поглощения при 513 нм. Среди всех полученных реципрокных вариантов только mKate2-K67R/R197H показал высокую скорость созревания хромофора и молекулярную яркость. Квантовый выход флуоресценции 0.44 и коэффициент экстинкции 90 000 делают его в 1.6 раза ярче, чем mKate2, и в 2.2 раза ярче, чем FusionRed. В отличие от исходного белка этот вариант не имел дополнительных коротковолновых пиков поглощения на ~ 390 и ~ 450 нм, которые мы приписываем незрелым формам хромофора. У смещенной в синюю область основной полосы поглощения mKate2-K67R/R197H присутствовало ярко выраженное плечо при ~ 540 нм, характерное для FusionRed (табл. 1 и 2, рис. 1).

Таблица 2. Спектральные характеристики mKate2, FusionRed и mKate2-K67R/R197H (Diogenes)

Белок	λ_ex, нм	λ_em, нм	EC (M^-1· см^-1)	FQY	Молекулярная яркость (EC · FQY/1000)	Время жизни флуоресценции, нс^#
mKate2	588	633	62500	0.4	25	2.4¹/2.05¹
FusionRed	580	608	94500	0.19	17.955	1.6²
mKate2-K67R/R197H	579	603	90000	0.44	39.6	2.2¹

^#Взвешенное по интенсивностям среднее время жизни флуоресценции. Показаны два времени жизни mKate2, полученные при разных режимах съемки (см. раздел «Измерение времени жизни флуоресценции»).

¹Моноэкспоненциальное затухание с χ² ≤ 1.3.

²Биэкспоненциальное затухание с χ² ≤ 1.3.

Рис. 1. Сравнение спектров поглощения (A) и флуоресценции (Б) mKate2-K67R/R197H, mKate2 и FusionRed (только поглощение). Длины волн максимумов основных полос показаны в пузырьках. На панели Б пунктирные линии соответствуют возбуждению флуоресценции, а сплошные линии – эмиссии флуоресценции

Варианты, содержащие комбинации из трех аминокислотных замен. Введение полного набора замен в положениях 67/158/197 значительно повлияло на созревание белков. Полосы поглощения и эмиссии флуоресценции в видимом диапазоне обоих вариантов, содержащих замены по трем положениям (mKate2-K67R/A158C/R197H и FusionRed-C158A/H197R/R67K), не детектировались либо были чрезвычайно слабыми (см. табл. 1), что указывает на «замораживание» созревания хромофора на ранних стадиях. Эти варианты оказались малоинформативными для определения молекулярных детерминант спектрального своеобразия FusionRed/mKate2.

Наш фенотипический анализ указывает на вероятное смещение хромофора внутри β-бочонка в результате внесения замены в положение 67, так как спектроскопические признаки π-стекингового взаимодействия хромофора с гистидином-197 (если обнаруживались) отличались у мутантов по этому положению от родительских белков. Замены в обоих этих положениях (67 и 197) во всех случаях, кроме mKate2-K67R/R197H, либо значительно влияли на созревание хромофора, либо приводили к возникновению коротковолновых спектральных форм, соответствующих промежуточным стадиям созревания хромофора. Замены в положении 197 вызывали спектральные сдвиги: батохромный сдвиг поглощения/эмиссии у производных FusionRed и гипсохромный сдвиг у производных mKate2. Мы предполагаем, что причиной этого может быть π-стекинговое взаимодействие между хромофором и гистидином-197, которое включается/выключается за счет внесенных мутаций. Кроме того, эти мутации оказывают заметное влияние на процесс созревания хромофора.

Физико-химические свойства mKate2-K67R/R197H и его применение в микроскопии

Далее мы детально охарактеризовали физико-химические свойства мутанта mKate2-K67R/R197H, который назвали Diogenes, с акцентом на его применение в клеточной флуоресцентной микроскопии.

Олигомерное состояние и флуоресцентное мечение. Так как олигомеризация значительно влияет на инвазивность и эффективность мечения внутриклеточных мишеней, мы в первую очередь проанализировали олигомерный статус Diogenes. При гель-фильтрации (рис. S6, рис. S7) очищенный белок элюировался в виде одного пика с молекулярной массой около 38 кДа (при концентрации по крайней мере до 5 мг/мл). Поскольку эта молекулярная масса не соответствовала ни мономеру (~ 25 кДа), ни димеру (~ 50 кДа), результат гель-фильтрации нельзя было однозначно интерпретировать. Предполагается, что в водном растворе концентрированный Diogenes либо строго мономерен, либо формирует исключительно димерную форму – с аномальной хроматографической подвижностью в обоих случаях. Возможно, Diogenes формирует равновесную смесь мономерных и димерных форм.

mKate2 изначально был описан как мономер [21], но в дальнейшем была показана некоторая его склонность к олигомеризации в водных растворах при высокой концентрации [10] и in cellulo [12]. Так как Diogenes получен из mKate2, предположили, что он обладает подобной склонностью. Важно было также сравнить Diogenes с его спектральным аналогом FusionRed, который в ходе разработки подвергся значительной оптимизации внешней поверхности β-бочонка, направленной на устранение остатков, потенциально важных для димеризации [10]. Действительно, очищенный FusionRed ведет себя как строгий мономер [10] и показывает более высокий ранг мономерности, чем mKate2, при исследовании в живых клетках (91.5 ± 3.0% против 81.1 ± 6.1% в анализе OSER [12]). Однако причинно-следственная связь между улучшенными показателями FusionRed in cellulo и введенными мутациями остается неясной, поскольку рациональный дизайн этих замен опирался на пространственную структуру mKate [34], а не mKate2. Более того, сворачивание белка и молекулярные взаимодействия в кристаллах могут не полностью соответствовать наблюдаемым в водной фазе [35, 36]. В любом случае неоднозначная хроматографическая картина Diogenes побудила нас оценить его олигомерное состояние также in cellulo.

С этой целью мы применили анализ структур организованного гладкого эндоплазматического ретикулума (OSER) [23], который стал фактическим стандартом оценки мономерности флуоресцентных белков при экспрессии в клетках млекопитающих [12, 37]. Мы провели OSER-анализ двумя способами. В клетках линии HeLa применяли широко используемую упрощенную фенотипическую оценку частотности клеточных OSER-фенотипов. В клетках линии U2OS в соответствии с оригинальной методикой, предложенной Costantini и соавт., определяли соотношение флуоресцентных сигналов OSER:NE в каждой клетке. В клетках HeLa выявлено ~ 87% клеток без завитков (рис. 2А), что указывает на относительно высокую мономерность. Полученное значение упрощенной оценки Diogenes находится между значениями для FusionRed и mKate2, опубликованными ранее [12]. Следует отметить, что помимо очевидных OSER- и не-OSER-фенотипов мы наблюдали фракцию клеток, обладающую фенотипическими признаками, которые, вероятно, не следует относить к типичному фенотипу гладкого ЭР (мелкие точки, гранулы, локальные области с повышенной яркостью). Мы обозначили эту группу, составляющую ~ 23% от всей популяции клеток, как «смешанный фенотип» (рис. 2Б). Обнаруженные нетипичные структуры могут указывать на агрегацию белка или его неспецифические взаимодействия с внутриклеточной средой, что, возможно, ограничивает его применимость для решения некоторых специфических задач. Cреднее отношение OSER:NE Diogenes, выявленное при анализе OSER в U2OS, составило 2.175 с медианой 1.986 и стандартным отклонением 0.9299 (рис. 2В). Несмотря на относительно большое стандартное отклонение как среднее OSER : NE, так и медиана позволяют нам считать Diogenes мономерным белком при установленном ранее пороговом значении OSER : NE ≤2.3 ± 0.6 [23]. Наконец, мы подготовили несколько экспрессионных конструкций для визуальной оценки эффективности Diogenes в качестве флуоресцентного ядра в слитых белках в клетках млекопитающих. В качестве мишеней были выбраны белки цитоскелета, качество визуализации которых, согласно нашему опыту, существенно зависит от степени олигомеризации метки (рис. 3). Субъективно мы оцениваем качество мечения как очень высокое.

Рис. 2. Результаты OSER-анализа Diogenes. A – гистограмма, показывающая общее количество клеток (HeLa) и распределение трех фенотипов между ними. Столбец «Whorl-структуры» характеризует клетки, в которых гомоолигомеризация метки привела к образованию типичных структур организованного гладкого эндоплазматического ретикулума (OSER) («завитков», whorls), как они были описаны [12, 23]. Строка «Смешанный фенотип» представляет случаи, где наблюдаются артефакты, отличные от типичных «завитков» (мелкие точки, гранулы, области с локально повышенной яркостью). Строка «Нормальный фенотип» иллюстрирует клетки с равномерно окрашенной трубчатой сетью ЭР. Б – иллюстрация фенотипов, наблюдаемых в живых клетках HeLa при OSER-анализе. В – количественный анализ соотношения интенсивности OSER : NE в живых клетках U2OS. Красный прямоугольник обозначает 25–75 процентиль; усы обозначают минимальное и максимальное значение выборки. Горизонтальная линия внутри прямоугольника обозначает медиану; штрихпунктирная линия на уровне 2.3 обозначает пороговое значение OSER : NE для мономера [23]. Описательная статистика данных показана на вставке

Рис. 3. Флуоресцентные изображения внутриклеточных структур, меченных Diogenes в живых HeLa Kyoto. Виментин (A), лайфакт (Б), энсконсин (В), цитокератин (Г)

pH-стабильность Diogenes. Сравнение интенсивностей флуоресценции Diogenes и родственных ему mKate2 и FusionRed в диапазоне pH 3–11 (рис. S8, S9) продемонстрировало высокую pH-стабильность Diogenes, аналогичную стабильности mKate2, одного из наиболее pH-стабильных RFP. В частности, Diogenes поддерживает уровень флуоресценции ≥ 80% от максимального в наиболее физиологически и биохимически значимом диапазоне (pH 6.5–9.5). В кислом диапазоне (pH 3–6) Diogenes показал худшую относительную яркость, чем FusionRed, но немного превзошел mKate2. Значения pKa у Diogenes, FusionRed и mKate2 составили 6.1, 5.76 и 6.16 соответственно (рис. S9). В отличие от обоих родственных белков, у Diogenes интенсивность флуоресценции резко снижалась в щелочном диапазоне (pH 10–11), не имеющем, однако, большого биологического значения.

Время жизни флуоресценции. Мы измерили кинетику затухания флуоресценции очищенного mKate2-K67R/R197H в водном растворе, используя метод коррелированного по времени счета отдельных фотонов (TCSPC) в трех различных аппаратных конфигурациях (рис. S10–S12). Во всех случаях затухание флуоресценции Diogenes было моноэкспоненциальным со значением времени жизни ~ 2.2 нс. Аналогично, во всех аппаратных конфигурациях наблюдалось биэкспоненциальное затухание флуоресценции FusionRed со средним (взвешенным по интенсивности) временем жизни ~ 1.6 нс. Время жизни флуоресценции mKate2, однако, зависело от оборудования. Так, при возбуждении пикосекундным лазером 450 нм (FWHM ~ 100 пс, 20 МГц) и наносекундным импульсным светодиодом 590 нм (FWHM ~ 1.5 нс, 20 МГц) его время жизни составило 2.4 нс (см. рис. S10 и рис. S12), тогда как при возбуждении фемтосекундным лазером 590 нм (FWHM ~ 150 фс, 80 МГц) – 2.05 нс (рис. S11). Причины этого явления остаются неясными. Оно может быть следствием процессов, происходящих в mKate2 и родственных белках в возбужденном состоянии [30, 38]. Принимая во внимание длины волн возбуждения/эмиссии флуоресценции Diogenes, mRuby [39] или mRuby2 [40] можно рассматривать как его близких конкурентов с точки зрения яркости/времени жизни флуоресценции.

Фотостабильность Diogenes. При выборе метки для традиционной флуоресцентной визуализации и микроскопии с высоким пространственным и временным разрешением [41] важно учитывать ее высокую фотостабильность. Однако известно, что динамика фотообесцвечивания метки может нелинейно зависеть от мощности источника возбуждения [12, 41]. Поэтому мы измерили фотостабильность Diogenes в двух различных модельных системах (см. рис. 4). Очищенный Diogenes в водной среде (иммобилизованный на микрочастицах) оказался несколько стабильнее FusionRed при плотности мощности, типичной для широкопольного флуоресцентного микроскопа (~ 2 Вт/см²) (время полуобесцвечивания t_1/2 составило 215 с у Diogenes против 165 с у FusionRed). При этом Diogenes оказался значительно менее фотостабильным, чем mKate2 (t_1/2 ~ 590 с, рис. 4A). Однако при высокоинтенсивном (~ 1 кВт/см²) возбуждении, типичном для микроскопии одиночных молекул (single molecule localization microscopy, SMLM) в живых клетках HeLa, новый RFP показал примерно в 2 раза более высокую фотостабильность, чем mKate2 (рис. 4Б), и мало отличался от FusionRed, обладающего значительно меньшей молекулярной яркостью, что позволяло ожидать большую фотостабильность.

Рис. 4. Кинетика фотообесцвечивания RFP mKate2-K67R/R197H (Diogenes), mKate2 и FusionRed в водном растворе очищенного белка при плотности мощности возбуждения ~ 2 Вт/см² (A) и живых клетках HeLa при ~ 1 кВт/см² (Б). Сплошные линии указывают среднюю интенсивность флуоресценции во время фотообесцвечивания. Прозрачные области показывают стандартное отклонение (пять покрытых белком частиц металл-аффинной смолы либо 20 клеток для каждого флуоресцентного белка)

Поведение mKate2-K67R/R197H в режиме детекции одиночных молекул

Увеличенная фотостабильность Diogenes при высокой мощности возбуждения, аналогичной применяемой в SMLM, побудила нас исследовать Diogenes на уровне одиночных молекул. Предварительные измерения, выполненные с использованием настроек флуоресцентного микроскопа сверхвысокого разрешения, подобных dSTORM, на каплях очищенного белка, выявили выраженное стохастическое мигание (blinking) Diogenes (данные не показаны). Важно, что красные и дальнекрасные FP, включая mScarlet, mKate2, TagRFP, FusionRed и FusionRed-MQ, хотя и демонстрируют мигание [28, 42, 43], в основном уступают зеленым флуоресцентным белкам [42] в режиме визуализации одиночных молекул. Поэтому в методах SMLM, в которых спонтанное мигание используется для уточнения локализации меченых молекул, эта способность имеет важное значение для оценки новых вариантов RFP.

Мы изучили спонтанное мигание Diogenes in cellulo и его применимость для визуализации внутриклеточных структур с улучшенным разрешением с помощью микроскопии одиночных молекул (SMLM). Для сравнения мы использовали родительский белок mKate2 и обладающий самым выраженным миганием среди исследованных RFP TagRFP-T [42]. Сравнение поведения одиночных молекул Diogenes, TagRFP-T и mKate2, слитых с виментином, проводили в модельной системе, где они временно экспрессировались в живых клетках HeLa (рис. 5).

Рис. 5. Сравнение результатов микроскопии сверхвысокого разрешения при визуализации живых клеток HeLa, экспрессирующих Diogenes, TagRFP-T и mKate2, слитые с виментином (лазер 2 кВт/см² 561 нм, время кадра 16.7 мс, 20 000 кадров). Сверхразрешенные изображения HeLa, временно экспрессирующих виментин-Diogenes, виментин-TagRFP-T и виментин-mKate2 соответственно (А, Б, В). Стабильность плотности локализации Diogenes, TagRFP-T и mKate2 (Г). Гистограмма изменений числа обнаруженных фотонов на событие с одиночной молекулой Diogenes, TagRFP-T и mKate2 соответственно; вертикальные линии представляют собой медианные значения (Д, Е, Ж). 2D-гистограммы точности локализации на событие с одиночной молекулой Diogenes, TagRFP-T и mKate2 соответственно (З, И, К); медианные значения показаны как вертикальные линии на 1D-гистограммах. Отношение сигнал/шум обнаруженных локализаций (Л); усы показывают стандартное отклонение, оранжевые горизонтальные линии указывают медианные значения

При плотности мощности лазерного излучения 2 кВт/см² при 561 нм и времени кадра 16.7 мс все белки мигали на уровне одиночных молекул, позволяя получить изображения волокон виментина сверхвысокого разрешения в живых клетках HeLa (рис. 5А–В). Согласно результатам сравнительного анализа, стабильность плотности локализаций была сходной у всех трех белков (рис. 5Г). Кроме того, разница в медианном значении яркости одиночной молекулы сравниваемых белков не была значимой (рис. 5Д–Ж). Точность локализаций Diogenes оказалась выше, чем у mKate2 и TagRFP-T (20.5 нм против 24 нм и 25 нм соответственно, рис. 5З–К), в то время как медианное значение отношения сигнал/шум у Diogenes было примерно в 1.5 раза выше, чем у mKate2, хотя статистически значимые различия в общих наборах значений сигнал/шум отсутствовали (рис. 5Л). Таким образом, эффективность Diogenes в SMLM живых клеток находится на одном уровне или превышает эффективность TagRFP-T, показанную ранее для этого метода микроскопии [42]. Однако он уступает по стабильности плотности локализаций, молекулярной яркости и точности локализаций зеленым флуоресцентным белкам, способным к спонтанному миганию (например, mNeonGreen [44] и mBaoJin [45]). Интересно, что дополнительное облучение лазером с длиной волны 405 нм во время визуализации повлияло на плотность локализаций всех трех белков (рис. S13). Короткие импульсы фиолетового лазера (плотность мощности около 200 Вт/см²) значительно увеличили количество зарегистрированных локализаций для всех трех белков. Хотя этих экспериментальных данных недостаточно для однозначного вывода о природе этого явления, можно предположить, что коротковолновое излучение дополнительно влияет на созревание хромофора и/или переключает хромофор из долгоживущего темнового во флуоресцентное состояние (например, путем цис-транс-изомеризации хромофора).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этом исследовании мы систематически проанализировали библиотеку реципрокных мутантов дальнекрасного флуоресцентного белка mKate2 и дочернего FusionRed для определения влияния трех остатков в окружении хромофора (Arg/Lys-67, Cys/Ala-158, His/Arg-197) на фотофизические идентичности этих широко используемых генетически кодируемых меток.

Один из представителей полученной библиотеки, mKate2-K67R/R197H, который мы назвали Diogenes, показал хорошее сочетание физико-химических и спектральных свойств и, по нашему мнению, представляет собой перспективную метку как для традиционных методов флуоресцентной микроскопии, так и для более новых модальностей с высоким временным (FLIM) и пространственным (SMLM) разрешением. Он наследует преимущества обоих родительских RFP, в частности, моноэкспоненциальное затухание флуоресценции, как mKate2, хорошую эффективность в белках слияния, как FusionRed, и высокую молекулярную яркость, превосходящую яркость обоих упомянутых RFP. По мономерности Diogenes превосходит родительский mKate2 и, возможно, приближается к уровню FusionRed. Стоит отметить относительно высокую фотостабильность Diogenes (особенно при нормировке на молекулярную яркость белка) в условиях интенсивного облучения, а также его способность к фотоактивации, индуцированной облучением (405 нм) и потенциально применимой для модуляции его поведения на уровне одиночных молекул в условиях многофотонной микроскопии живых клеток. Наши результаты косвенно указывают на присутствие в популяции молекул Diogenes некоторого количества молекул в переходных темновых состояниях (рис. S10). Вместе с данными абсорбционной спектроскопии (рис. 1A) это может свидетельствовать о более высоком качестве созревания хромофора и его стерической адаптации внутри молекулы белка по сравнению с родственными RFP.

Отметим, что по сравнению со своим спектральным аналогом (FusionRed) Diogenes несет минимальное количество мутаций относительно родительского mKate2. Более того, комбинация замен (K67R/R197H), обнаруженная при анализе реципрокной библиотеки, ранее была независимо перенесена из яркого, но склонного к олигомеризации белка TagRFP, в практически нефлуоресцентный мономер mKate2.5 для получения FusionRed [10]. Как и FusionRed [18, 46], Diogenes может стать отправной точкой дальнейших полурациональных улучшений красных флуоресцентных белков, в частности, использующих современные высокопроизводительные подходы.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (РНФ) № 23-24-00011.

Приложения доступны на сайте https://doi.org/10.32607/actanaturae.27545.