Идентификация генов халконсинтаз чеснока (Allium sativum L.) и уровень их экспрессии в ответ на стрессовые факторы

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CHS – халконсинтаза; АБК – абсцизовая кислота; MeJA – метилжасмонат; ПЦР-РВ – ПЦР в реальном времени.

ВВЕДЕНИЕ

Защитный ответ растений ассоциирован с накоплением флавоноидов – класса растительных полифенолов, состоящего более чем из 6900 вторичных метаболитов с широким спектром функций в развитии растения [1, 2]. Обладая антиоксидантной активностью [3, 4], флавоноиды играют важную роль в защите растений от биотических и абиотических стрессовых факторов [5, 6], а также способны оказывать на организм человека антиоксидантное, иммуномодулирующее, антибактериальное и другие действия [7].

Путь биосинтеза флавоноидов высококонсервативен, и у многих видов растений к настоящему времени идентифицированы как структурные (ферменты) гены, определяющие разные стадии биосинтеза, так и гены, координирующие активность структурных генов [8–12]. Ключевыми ферментами пути являются халконсинтазы (CHS; [К.Ф. 2.3.1.74]), с которых начинается биосинтез флавоноидов и которые структурно консервативны у растений [7, 13–15]. На примере множества видов растений показано, что гены CHS представлены в геноме семейством паралогичных копий, возникших в результате эволюционных дупликаций и мутаций генов-предшественников [16–21]. Количество членов семейства CHS значительно варьирует у разных видов растений, что объясняется эволюционными событиями дупликации и мутациями генов CHS с последующей функциональной диверсификацией паралогов [10, 22, 23].

Один из экономически значимых видов однодольных растений – чеснок Allium sativum L. (семейство Amaryllidaceae, порядок Asparagales), является не только важной овощной культурой, но и используется в медицине, благодаря своим антиоксидантным свойствам [24]. Луковицы чеснока богаты, в числе прочих антиоксидантов, флавоноидами (особенно кверцитином) [24].

Уникальность вида A. sativum заключается в свойственном ему бесполом размножении; редкие фертильные образцы, собранные в Центральной Азии, при искусственном культивировании быстро теряют репродуктивную способность [25]. Новые генотипы чеснока возникают как результат мутаций в вегетативных клонах, приводящих к фенотипическим изменениям [26]. Успеху отбора способствует свойственная A. sativum высокая скорость изменчивости морфофизиологических признаков [25, 27], в том числе при адаптации к различным неблагоприятным условиям [25], что связывают с эволюцией флавоноидного пути [28].

Таким образом, изучение генов пути биосинтеза флавоноидов у A. sativum, в частности, генов семейства халконсинтаз, CHS, может стать вкладом в понимание регуляции данного метаболического пути, а также эволюции и особенностей онтогенеза этого вида. Кроме того, это откроет новые возможности в характеристике мировых коллекций чеснока и отборе стрессоустойчивых генотипов с одновременно улучшенной диетической составляющей для создания сортов. Гены CHS у чеснока ранее не изучались. Если рассматривать другие виды Allium, то только у лука репчатого (A. cepa) идентифицированы гомологи CHS-A и CHS-B, ассоциированные с окраской луковицы [29], и выявлена активация экспрессии гена CHS в ответ на грибную инфекцию [30]. Полное семейство CHS (шесть генов) идентифицировано только у одного из видов, наиболее близких к роду Allium – Asparagus officinalis (порядок Asparagales) [18]. В то же время в 2020 г. был секвенирован и собран геном A. sativum, а также секвенированы транскриптомы отдельных органов растения чеснока [31], что делает возможной идентификацию и характеристику генных семейств.

В представленной работе идентифицировано и охарактеризовано семейство генов CHS, кодирующих халконсинтазы чеснока, а также изучена динамика экспрессии этих генов в ответ на воздействие абиотических стрессоров (засуха, засоление, холод) и обработку фитогормонами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Идентификация и структурная характеристика генов CHS чеснока

Поиск генов проводили в геноме и транскриптомах A. sativum сорта Ershuizao (PRJNA606385, Garlic.V2.fa; AlliumDB, https://allium.qau.edu.cn/). В качестве референсных использовали халконсинтазы Arabidopsis thaliana L. (AT1G02050, AT4G00040, AT4G34850 и AT5G13930).

Выравнивание последовательностей выполняли в MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net/). Экзон-интронную структуру генов AsCHS определяли, сравнивая геномные и транскриптомные данные (PRJNA606385, Garlic.V2.fa), цис-регуляторные элементы в промоторах генов AsCHS (2 т.п.н. до старт-кодона) – с помощью PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/). Для характеристики белков AsCHS определяли: консервативные домены и мотивы (NCBI-CDD, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi; Multiple Expectation maximizations for Motif Elicitation (MEME) 5.5.7, http://meme-suite.org/tools/meme; опубликованные данные [10]); молекулярную массу (Mw), изоэлектрическую точку (pI) и индекс гидропатичности (grand average of hydrophobicity index, GRAVY) (ExPASy, https://web.expasy.org/protparam/); функции AsCHS (PANNZER, http://ekhidna2.biocenter.helsinki.fi/sanspanz/). Филогенетический анализ халконсинтаз проводили (MEGA 7.0, Neighbor-Joining, бутстреп 1000), используя сравнение аминокислотных последовательностей AsCHS с гомологами из A. thaliana, Solanum lycopersicum L. (томат), Capsicum annuum L. (перец) (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), A. cepa (лук репчатый) и A. fistulosum (лук-батун) (AlliumDB, https://allium.qau.edu.cn/).

Анализ профиля экспрессии генов CHS в различных органах растения чеснока

Экспрессию идентифицированных генов AsCHS в органах чеснока определяли in silico на основе доступных транскриптомных данных A. sativum сорта Ershuizao [31] и визуализировали в виде тепловой карты (Heatmapper, http://www.heatmapper.ca/expression/). Экспрессию выражали в значениях FPKM (Fragments per kilo base of transcript per million mapped fragments).

Профиль экспрессии генов AsCHS методом ПЦР-РВ анализировали в корнях, донце, луковице, ложном стебле и листьях растений чеснока сорта Сармат, выращенных в открытом грунте в 2024 г. (Федеральный научный центр овощеводства, Московская область). Материал растирали в жидком азоте и использовали для получения суммарной РНК (RNeasy Plant Mini Kit, RNase free DNasy set; QIAGEN, Германия) и кДНК (GoScript^тм Reverse Transcription System, Promega, США). На основе идентифицированных последовательностей AsCHS разрабатывали специфичные праймеры (табл. 1). В качестве референсных генов использовали GAPDH и UBQ [32, 33]. Реакционная смесь включала 3 нг кДНК и набор «Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR GreenI и ROX» (ООО «Синтол», Россия). Реакцию проводили в системе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США), в двух биологических и трех технических повторах; программа: 95°C 5 мин; 40 циклов (95°C 15 с, 62°C 50 с). Данные статистически обрабатывали (Two-way ANOVA) и визуализировали в GraphPad Prism v. 8 (https://www.graphpad.com).

 

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров для проведения ПЦР-РВ

Ген	Последовательности праймеров (5´ → 3´)*
AsCHS1	F-CGAAGGCCCAGCCACCATT R-CGGTCATGTGCTCGCTGTTG
AsCHS2	F-CACCAACTGCAACAACCTTGAC R-CTCCGGGTATGTGGCCAGT
AsCHS3	F-CAAGACGAATACCCAGACTACTAT R-GATGTCTTCGGACAGGTGCATA
AsCHS4	F-GTACCCAGACTACTACTTCCGT R-ATCTTCGGACAGGTGCATGTAC
AsCHS5	F-GTACCCAGACTACTACTTCCGT R-CAGGTGCATGTAGCGTTTTCTG
AsCHS6	F-CTCTTCTGGATTCCGCATCCT R-CTGCCATTGACCTCTTCCTCA
AsCHS7	F-GCACCGATCTCGCCATGAG R-TAAGCGCTGTTTGATGGTCGG
AsCHS8	F-CTATCGGTACAGCCGTGCCT R-CATGTAGGCCGTCATGTTTGG
GAPDH	F-CCATGTTTGTTGTTGGTGTGAATGAG R-TGGTGCAGCTAGCGTTGGAGAC
UBQ	F-AAGCCAAGATACAGGACAAG R-GCATACCACCTCTCAATCTC

^*F – прямой праймер, R – обратный праймер.

 

Симуляция стрессовых условий (засуха, засоление, холод, абсцизовая кислота, метилжасмонат, затемнение) для растений чеснока и анализ ответной динамики экспрессии генов AsCHS

В эксперименте использовали 10-дневные растения сорта Сармат, выращенные (ЭУИК, ФИЦ Биотехнологии РАН; день/ночь – 16/8 ч, 22/16°С; освещенность 190 мкМ/(м² · с)) в прозрачных стеклянных стаканах в воде; зубки луковицы закрепляли так, чтобы в воде находилась только зона корней. Опытные растения помещали в растворы, соответствующие моделируемым стрессам (100 мМ NaCl – засоление; 10% PEG-6000 – засуха) и экзогенному воздействию фитогормонов (100 мкМ АБК; 100 мкМ MeJA). Контрольные растения оставались в воде. Холодовой стресс имитировали, помещая растения в холодильную камеру (4°С, без освещения); контроль – в темноте при 22°С. Через 6 и 24 ч воздействия стресса/гормона отбирали корни и побеги с трех случайно выбранных растений в опыте и контроле; хранили при -80°С.

В опыте с отсутствием освещения растения накрывали светонепроницаемой коробкой (опыт) (10:00); контроль находился при освещении 190 мкМ/(м² · с) (ЭУИК, день/ночь – 16/8 ч). Через 6 ч (16:00) и 24 ч (10:00 следующих суток) отбирали корни и листья в опыте и контроле (по два биологических повтора на каждую точку), хранили при -80°С.

Собранные пробы использовали для выделения РНК/кДНК и проведения ПЦР-РВ как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация и структурная характеристика генов AsCHS чеснока

Халконсинтазы входят в семейство поликетидсинтаз типа III, состоят из двух консервативных доменов Chal_sti_synt_N (PF00195.16) и Chal_sti_synt_C (PF02797.12) и в составе гомодимера катализируют присоединение трех молекул малонил-КоА к 4-кумароил-КоА с образованием халкона [3, 14]. Каждый компонент димера имеет активный центр, катализирующий одну или несколько реакций конденсации [14]. Каталитический центр CHS содержит четыре высококонсервативных а.о. (Cys164, His303, Asn336, Phe215 у CHS1 Glycin max) [7, 15], где Cys164 также является сайтом связывания с субстратом 4-кумароил-КоА [14]. В связывании с 4-кумароил-КоА участвуют Gly259 и Ser345, а с субстратом малонил-КоА – консенсусная последовательность из 17 а.о. [10]. Кроме того, для халконсинтаз предложена сигнатурная последовательность из 17 а.о. в домене Chal_sti_synt_C [10].

В геноме чеснока A. sativum сорта Ershuizao [31] нами идентифицированы восемь генов халконсинтаз – AsCHS1–8 (1182–2010 п.н.), которые содержали от одного до трех экзонов и располагались на хромосомах Chr1 (AsCHS1), Chr4 (AsCHS2, 3), Chr5 (AsCHS4, 5) и Chr6 (AsCHS6–8) (табл. 2) (рис. 1А).

 

Таблица 2. Характеристика генов халконсинтаз чеснока A. sativum сорта Ershuizao

Ген1	Ген/ транскрипт ID2	Локализация в геноме2	Ген, п.н.	Число экзонов/интронов	кДНК, п.н.	Белок, а.о.	Mw, кДа	pI	GRAVY
AsCHS1	Asa1G03363.1/ Asa2G01293.1	chr1: 913472045..913473226	1182	1/0	1182	393	43.26	6.22	-0.139
AsCHS2	Asa4G02924.1/ Asa4G00890.1	chr4: 781174614..781176037	1424	3/2	1128	375	41.06	6.96	-0.084
AsCHS3	Asa4G06151.1/ Asa4G03387.1	chr4: 1682101557..1682102738	1182	1/0	1182	393	43.15	6.48	-0.121
AsCHS4	Asa5G04529.1/ Asa5G01644.1	chr5: 1227135621..1227136805	1185	1/0	1185	394	43.46	6.1	-0.179
AsCHS5	Asa5G04530.1/ Asa5G01645.1	chr5: 1227252338..1227253522	1185	1/0	1185	394	43.43	6.1	-0.177
AsCHS6	Asa6G02586.1/ Asa6G05452.1	chr6: 656216362..656217943	1582	3/2	1173	390	43.32	5.75	-0.126
AsCHS7	Asa6G03080.1/ Asa1G04064.1	chr6: 787943706..787944950	1245	2/1	1155	384	42.27	5.57	-0.155
AsCHS8	Asa6G03715.1/ Asa6G04348.1	chr6: 973362901..973364911	2010	2/1	1194	397	43.78	6.48	-0.186

¹Номера в названиях генов соответствуют их хромосомной локализации.

²Определено по данным секвенирования генома и транскриптомов чеснока [31].

 

Рис. 1. Экзон-интронная структура генов AsCHS1–8 (А), состав и распределение консервативных мотивов в последовательностях белков AsCHS1–8 (Б)

 

Белки AsCHS1–8 незначительно различались размером (375–397 а.о.). Согласно функциональным предсказаниям в терминах Gene Ontology (GO), все AsCHS1–8 имеют ацилтрансферазную активность (GO:0016747) и участвуют в процессах биосинтеза поликетидов (GO:0030639) и флавоноидов (GO:0009813). При этом белки AsCHS2 и 7 имели сходство 75% и значительно отличались от халконсинтаз AsCHS1, 3–6, 8 (идентичность 56–61%).

Структурный анализ аминокислотных последовательностей AsCHS1–8 установил положение халконсинтазных доменов Chal_sti_synt_N (PF00195.16) и Chal_sti_synt_C (PF02797.12) (рис. 1). В доменах найдены консервативные остатки (Cys167, Phe218 (Chal_sti_synt_N); His309, Asn342 (Chal_sti_synt_C)), характерные для активного центра фермента [15], за исключением AsCHS3 (Phe218 → Cys). Сайты связывания с субстратом 4-кумароил-КоА – Cys167 [14], Gly259 и Ser345 [10] присутствовали у всех AsCHS1–8, за исключением мутации Gly259 → Lys у AsCHS6. В домене Chal_sti_synt_C все AsCHS1–8 содержали консенсус связывания с субстратом малонил-КоА и сигнатурную последовательность халконсинтаз (рис. 2).

 

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей AsCHS1–8. Подчеркнуты домены Chal_sti_synt_N (красным) и Chal_sti_synt_C (голубым). Четыре остатка (Cys167, Phe218, His309, Asn342) активного центра фермента выделены красной рамкой (согласно [15]). Остатки Ser345 и Gly259, участвующие в связывании субстрата 4-кумароил-КоА [10], выделены синей рамкой. Черной и коричневой рамками отмечены консенсусы связывания малонил-КоА и сигнатурная последовательность халконсинтаз соответственно [10]. Цвет фона указывает на высокую степень консервативности аминокислотных остатков в белках AsCHS1–8 (зеленый – 100%, голубой – 80%, розовый – 60%)

 

Последовательности белков AsCHS1–8 охарактеризованы по профилю консервативных мотивов/консенсусов (рис. 1Б). Большинство халконсинтаз (AsCHS1, 3–5, 8) содержали 10 из 11 найденных мотивов; AsCHS6 отличался только отсутствием мотива 9. Исключение составили AsCHS2 и AsCHS7 (пять и шесть мотивов вместо 10–11), однако в последовательности именно этих белков специфично присутствовал мотив 11, соответствующий измененному (в сравнении с другими белками) началу домена Chal_sti_synt_N; консенсус 7 отсутствовал у AsCHS2 по причине делеции начала домена Chal_sti_synt_N. Мотивы 6 и 8–10 были утрачены AsCHS2 и AsCHS7 вследствие того, что консервативность данных участков составила < 50% в сравнении с остальными халконсинтазами (рис. 1, 2).

С целью исследования филогении халконсинтаз AsCHS1–8 чеснока в базах данных AlliumDB и NCBI были идентифицированы последовательности этих ферментов у наиболее родственных A. sativum видов – лука репчатого A. cepa (6 CHS), лука-батуна A. fistulosum (5) и спаржи As. officinalis (6), а также отдаленных видов – перца C. annuum (9), томата S. lycopersicum (7) и A. thaliana (4).

На построенной дендрограмме (рис. 3) белки AsCHS1–8 группировались с представителями других видов однодольных (A. cepa, A. fistulosum, As. officinalis). Ортологи AsCHS6–8 выявлены у всех трех видов, AsCHS2 – только у A. cepa, тогда как AsCHS1, 3–5 группировались отдельно от представителей и однодольных, и двудольных (рис. 3).

 

Рис. 3. Дендрограмма, основанная на аминокислотных последовательностях халконсинтаз A. sativum (As; красный шрифт), A. cepa (синий), A. fistulosum (зеленый), As. officinalis (голубой), A. thaliana (AT; черный), C. annuum (оранжевый) и S. lycopersicum (фиолетовый). Значимые значения бутстреп (> 50%) указаны в основании ветвей, длина которых соответствует количеству мутаций в ходе эволюции

 

В геномах двудольных (C. annuum, S. lycopersicum, A. thaliana) найдены ортологи только халконсинтаз AsCHS2 и 7 чеснока (рис. 3).

Определение профиля экспрессии генов AsCHS в растениях чеснока

Профили экспрессии генов халконсинтаз определяли, используя результаты транскриптомного анализа отдельных органов A. sativum сорта Ershuizao [31], включая восемь стадий развития луковицы (рис. 4).

 

Рис. 4. Тепловая карта экспрессии генов AsCHS1–8 в разных органах A. sativum сорта Ershuizao, построенная по транскриптомным данным [31]. В прямоугольниках – средние значения FPKM по трем биологическим повторам. Приведены стадии развития (1–8) луковиц, возраст которых составил 192, 197, 202, 207, 212, 217, 222 и 227 дней соответственно [31]

 

Оказалось, что гены AsCHS2 и AsCHS7 не экспрессируются, за исключением следовых количеств транскриптов в цветках (оба гена), корнях и луковице на отдельных стадиях развития (AsCHS7). Экспрессия остальных шести генов крайне незначительна в корнях, листьях, ложном стебле, цветках и в процессе развития луковицы (AsCHS1, 3–6), а также в бутонах (кроме AsCHS5) и проростках (кроме AsCHS1). Среди генов AsCHS1–7, несмотря на низкий уровень их экспрессии, можно выделить AsCHS3 (FPKM значимо выше, чем у других пяти генов, но < 10) (рис. 4).

Только у гена AsCHS8 выявлены существенные уровни транскриптов (FPKM>10). Ген AsCHS8 экспрессируется во всех проанализированных органах с наибольшими значениями FPKM в ложном стебле, листьях, цветках и проростках; в луковице экспрессия минимальна на протяжении всех восьми стадий развития; в корнях FPKM в ~9 раз меньше, чем в листьях (рис. 4).

Методом ПЦР-РВ нами определены профили экспрессии генов AsCHS1–8 в корнях, донце (видоизмененный стебель), луковице, ложном стебле и листьях чеснока сорта Сармат. Обнаружена экспрессия двух из восьми генов, AsCHS3 и 8. Транскрипты AsCHS3 присутствуют во всех анализируемых органах (максимум в луковице, листьях и ложном стебле), тогда как AsCHS8 – только в корнях, листьях и ложном стебле (максимум в ложном стебле и листьях). В корнях оба гена экспрессируются на следовом уровне, но экспрессия AsCHS3 в 26 раз ниже, чем AsCHS8. В ложном стебле и листьях уровни транскриптов AsCHS8 в ~41 раз выше, чем у AsCHS3 (рис. 5А).

 

Рис. 5. А – профиль экспрессии генов AsCHS3 и 8 в разных органах взрослого растения чеснока сорта Сармат (^a-cp < 0.05 – значимые различия уровня экспрессии в разных органах). Экспрессии генов AsCHS1, 2, 4–7 не обнаружено. Б – динамика экспрессии гена AsCHS8 в корнях и листьях растений чеснока в ответ на абиотические стрессы (засоление, засуха, холод) и экзогенные фитогормоны (АБК, MeJA)

 

Динамика экспрессии генов CHS в растениях чеснока в ответ на стрессоры и фитогормоны

С целью определения возможного участия халконсинтаз AsCHS1–8 в стрессовом ответе чеснока сорта Сармат мы провели серию экспериментов по симуляции воздействия на растения засоления, засухи и низкой положительной температуры, а также экзогенной обработки абсцизовой кислотой и метилжасмонатом, проанализировали экспрессию генов AsCHS1–8 в корнях и листьях в динамике.

Показано, что только ген AsCHS8 значимо экспрессируется как в контроле, так и в опыте (рис. 5Б). В листьях в ответ на холодовой стресс появляются следовые количества транскриптов AsCHS2–4 (в связи с незначительностью индукции генов рисунки не приведены и эффект не обсуждается).

Профиль экспрессии гена AsCHS8 в ответ на стрессовые воздействия зависит как от типа стрессора, так и от органа растения (корни или листья).

Избыток соли в основном стимулирует экспрессию AsCHS8 и в корнях, и в листьях. В корнях экспрессия гена возрастает в 2.7 (6 ч) и 2.9 (24 ч) раза в сравнении с контролем; в листьях – повышается в 1.3 раза (6 ч), но понижается в 1.2 раза к концу воздействия (24 ч) (рис. 5Б).

В условиях засухи экспрессия AsCHS8 в корнях стабильно снижается (6 и 24 ч), тогда как в листьях сначала наблюдается активация экспрессии в 1.3 раза (6 ч) и затем резкое снижение почти до нулевых значений (24 ч) (рис. 5Б).

Холодовой стресс стимулирует экспрессию AsCHS8 в начале воздействия (6 ч) в корнях (в 6.6 раз) и листьях (8.6). В конце воздействия (24 ч) уровень транскриптов гена в корнях возрастает в 113.3 раз, а в листьях уменьшается в 1.5 раза (рис. 5Б).

Таким образом, если говорить о тенденции изменения экспрессии гена, то все три вида абиотических стрессоров сходным образом влияют на экспрессию AsCHS8 в листьях, в то время как эффект, оказываемый на корни, специфичен для каждого стрессора.

Экзогенная обработка растений чеснока абсцизовой кислотой и метилжасмонатом подавляет экспрессию AsCHS8 в корнях до нулевых значений. В листьях экспрессия гена существенно снижается на протяжении 24 ч при воздействии АБК, в то время как MeJA вызывает сначала увеличение уровня транскриптов в 1.2 раза (6 ч) и затем уменьшение до следовых количеств (24 ч) (рис. 5Б).

Также проведен анализ зависимости экспрессии гена AsCHS8 от наличия освещения корней и листьев растений, помещенных в стандартные условия освещения (контроль) и темноту (опыт) (рис. 6). Обнаружено, что в корнях контрольных (освещенных) растений ген AsCHS8 экспрессируется, тогда как в темноте следовые количества транскриптов регистрируются только спустя 6 ч воздействия. В листьях AsCHS8 экспрессируется и в контроле, и в опыте: в точке 6 ч уровень транскриптов гена в 11.2 раза ниже в условиях темноты в сравнении с освещенными листьями; спустя сутки (24 ч) уровни транскриптов AsCHS8 в контроле и опыте сходны (рис. 6).

 

Рис. 6. Экспрессия гена AsCHS8 в корнях и листьях растений чеснока спустя 6 и 24 ч культивирования при наличии освещения (желтый круг) и в темноте (черный круг). (^*p < 0.05 – значимые различия уровня экспрессии, темнота vs. освещение)

 

Определение цис-регуляторных элементов в промоторах генов AsCHS1–8

С целью интерпретации профилей экспрессии генов AsCHS1–8 их промоторы (-2000 п.н. от стартового кодона) охарактеризованы по профилю цис-регуляторных элементов (рис. 7). Найдены 44 элемента, которые распределены на четыре группы: элементы ответа на фитогормоны (7) и стрессовые факторы (11), а также светочувствительные (13) и другие (13) элементы. К последним отнесены сайты связывания с белками и транскрипционными факторами, элементы, ассоциированные с процессами развития, и потенциальные регуляторные мотивы с неизвестной функцией.

 

Рис. 7. Содержание и состав цис-регуляторных элементов в промоторах (2 т.п.н. до стартового кодона, включая предположительную 5´-нетранслируемую область (5´-UTR)) генов AsCHS1–8 (А) и их распределение по последовательности промотора (Б). Красной стрелкой указан предполагаемый сайт начала транскрипции гена AsCHS8 (на основании анализа транскриптомных данных)

 

Показано, что в промоторах большинства генов (кроме AsCHS3) присутствуют фитогормон-чувствительные элементы с преобладанием среди них сайтов ответа на абсцизовую кислоту и метилжасмонат. Гены AsCHS1, 2 и 7 содержат наибольшее количество элементов ответа на АБК (3 ‘ABRE’); AsCHS2 – на MeJA (4 ‘CGTCA’). Элементы, ассоциированные с ауксинами (‘TGA’), гиббереллинами (‘P-box’, ‘GARE’), салициловой кислотой (‘TCA’) и этиленом (‘ERE’), представлены в промоторах отдельных генов в одной-двух копиях (рис. 7).

В промоторах всех генов AsCHS1–8 выявлены элементы, связанные с ответом на стресс в целом (‘MBS’, ‘W-box’, ‘TC-rich repeats’), на анаэробные условия (‘ARE’, особенно AsCHS7 с 6 сайтами), фитопатогены (‘Wun’, ‘WRE3’, ‘box S’), холод (‘LTR’), засуху (‘DRE1’), осмотический стресс, жару и дефицит питательных элементов (‘STRE’). Наибольшее число элементов (14) найдено у AsCHS8. Учитывая стрессовые факторы, использованные в нашей работе, отметим, что элементы ‘LTR’ (ответ на холод) обнаружены у AsCHS2, 4, 5 и 7; ‘DRE1’ и/или ‘STRE’ (ответ на осмотический стресс) – у всех генов, кроме AsCHS4 и 5 (рис. 7).

Проведенный анализ показал, что промоторные области AsCHS1–8 содержат от 4 (AsCHS4) до 14 (AsCHS8) светочувствительных элементов (рис. 7).

У всех генов найдены сайты связывания со стресс-ассоциированными факторами транскрипции семейств MYB (‘MRE’, ‘MYB’, ‘MBS1’) и MYC (‘MYC’) – 5–14 и 2–8 элементов соответственно. MYB-связывающими сайтами наиболее обогащены промоторы генов AsCHS2 (14), 7 (10) и 4 (9); промоторы AsCHS2–5 содержат ‘MBS1’, ассоциированный с регуляцией биосинтеза флавоноидов (рис. 7).

ОБСУЖДЕНИЕ

Защитный ответ растений ассоциирован с накоплением метаболитов с антиоксидантными свойствами, в частности флавоноидов [5, 6]. У чеснока A. sativum, утратившего в процессе эволюции и доместикации фертильность, возникли, как следствие, серьезные изменения генетической регуляции адаптации к стрессу [34]. Флавоноидный путь у чеснока не охарактеризован. Поэтому целью нашего исследования стали идентификация и структурно-функциональная характеристика генов A. sativum, кодирующих халконсинтазы, которые катализируют первую стадию пути биосинтеза флавоноидов [12].

Анализ генома и транскриптомов A. sativum сорта Ershuizao позволил выявить восемь генов халконсинтаз AsCHS1–8 (табл. 2). Число генов этого семейства в геноме чеснока отличалось от числа генов у других однодольных, таких как пшеница T. aestivum (49 или 87 генов) или кукуруза Z. mays (17). Однако размеры этого семейства у A. sativum и у одного из видов, наиболее близких роду Allium – As. officinalis (шесть генов), оказались близкими [18, 21]. Поскольку высокая фенотипическая вариабельность современного чеснока считается следствием перекрестных скрещиваний фертильных диких предков в центре происхождения вида [25, 34], можно предположить, что семейство AsCHS появилось в геноме чеснока еще до утраты видом способности к половому размножению.

Опираясь на результаты структурно-филогенетического анализа (табл. 2, рис. 1, 3), можно было бы предположить, что высокогомологичные белки AsCHS1, 3–5 функционально избыточны и могут работать с частичным перекрытием в разных тканях/органах растения, что определяется специфичностью промоторов генов. Соответствующие гены значительно различаются набором цис-регуляторных элементов в промоторной области (рис. 7) и профилем органоспецифичной экспрессии (рис. 4), основанным на транскриптомных данных A. sativum сорта Ershuizao [31]. Участие генов в биосинтезе флавоноидов может быть ограничено отдельными узкоспециализированными клетками/тканями/органами/стадиями развития растения чеснока. Выявленные мутации значимых аминокислотных остатков у AsCHS3 и 6 (рис. 2), необходимых для формирования субстратсвязывающих сайтов, могут также свидетельствовать о возможных различиях ферментативной активности этих белков [10, 15].

В целом, если рассматривать экспрессию всех анализируемых генов AsCHS (рис. 4), то можно говорить о существенной экспрессии только AsCHS8 (FPKM>10) и, в меньшей степени, AsCHS3 (рис. 4). Это полностью подтверждается результатами ПЦР-РВ, согласно которым экспрессируются только гены AsCHS3 и 8 с весомым преобладанием транскриптов AsCHS8 в корнях, ложном стебле и листьях чеснока сорта Сармат (рис. 5А).

Отсутствие или низкая экспрессия остальных генов AsCHS1, 2 и 4–7 еще не является свидетельством их нефункциональности. Все эти гены структурно полноценны, включая профиль цис-регуляторных элементов в промоторной области (табл. 2, рис. 7), они могут иметь узкую специализацию, участвуя в флавоноидном пути в конкретных клетках/тканях/органах на отдельных стадиях развития растения. К примеру, у пшеницы ряд генов халконсинтаз экспрессируется исключительно в клетках пыльников при развитии пыльцевой экзины [21].

Нами проведен дополнительный анализ экспрессии генов AsCHS1–8 в ответ на основные абиотические стрессоры (засоление, засуха, холод), а также на экзогенную обработку фитогормонами (абсцизовая кислота и метилжасмонат), которые опосредуют сигнальные пути стрессовых ответов в растении [35]. В результате обнаружено, что только экспрессия гена AsCHS8 значимо изменяется в ответ на воздействие всех использованных нами стрессоров (рис. 5Б).

Показанное нами стимулирующее воздействие холода на активность гена AsCHS8 (рис. 5Б) соответствует данным подобных исследований, проведенных, например, на растениях Coelogyne ovalis [36] или Oryza sativa [37]. Повышение экспрессии гена AsCHS8 при засолении (рис. 5Б) согласуется с данными, полученными при изучении реакции растений риса [37], а также с положительной ассоциацией между экспрессией генов халконсинтаз и солеустойчивостью растений Eupatorium adenophorum [38].

В отличие от солевого и холодового эффектов ответ на другой осмотический стресс – засуху, сопровождается снижением экспрессии гена AsCHS8 (рис. 5Б). С одной стороны, это соответствует данным анализа растений Camellia sinensis, у которых в ответ на засуху уменьшалось содержание белка халконсинтаз [39]. С другой стороны, эффект AsCHS8 противоположен реакции трех генов халконсинтаз Silybum marianum, экспрессия которых увеличилась в ответ на засуху [40].

Примечательно, что обработка растений чеснока абсцизовой кислотой и метилжасмонатом подавляет экспрессию гена AsCHS8 как в корнях, так и в листьях (рис. 5Б). У видов Vitis sp. такие воздействия, напротив, стимулируют экспрессию генов халконсинтаз [41, 42]; в случае MeJA это ассоциировано с активацией жасмонатами биосинтеза антимикробных фитоалексинов для защиты от патогенов [41]. Возможно, противоположный эффект связан с тем, что растения чеснока богаты сераорганическими биологически активными соединениями, обладающими высокими антиоксидантными и противомикробными свойствами [43], и c тем, что для защитного ответа синтез флавоноидов, запускаемый у других видов растений жасмонатным сигнальным путем, не так важен. Более того, на примере Salvia miltiorrhiza показано, что обработка растений MeJA может и стимулировать (SmCHS1–5), и подавлять (SmCHS6), и не влиять (SmCHS7) на экспрессию генов халконсинтаз [44].

Известно, что флавоноиды участвуют в фотозащите растений [1, 2], при этом биосинтез флавоноидов находится в положительной зависимости от освещения [45], с чем ассоциированы светочувствительные цис-регуляторные элементы в промоторах генов халконсинтаз [7, 46]. Мы также обнаружили значительное количество светочувствительных сайтов в промоторах всех генов AsCHS и, в частности, AsCHS8 (рис. 7), что согласуется с показанным нами подавлением экспрессии AsCHS8 в затемненных растениях (рис. 6). Сходный профиль экспрессии генов халконсинтаз при наличии освещения и в темноте характерен и для других видов растений, например для Sinapis alba [45].

Таким образом, из всего семейства AsCHS только один ген (AsCHS8) участвует в защитных реакциях в листьях и корнях растения чеснока, причем ответная динамика экспрессии гена зависит от типа стрессора и часто противоположна. Эти данные могут косвенно подтверждать, что в процессе эволюции и доместикации в растениях чеснока возникли серьезные изменения в генетической регуляции адаптации к стрессу, отличные от других видов растений [34], что требует дополнительных исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы идентифицировали и охарактеризовали восемь генов халконсинтаз (AsCHS1–8) в геноме чеснока A. sativum сорта Ershuizao, сравнили профили их органоспецифичной экспрессии с профилями у сорта Сармат и проанализировали экспрессию генов в ответ на абиотические стрессоры (засоление, засуха, холод), экзогенные фитогормоны (АБК, MeJA) (все гены) и освещенность (только AsCHS8). Полученные результаты позволяют предположить, что только два гена из восьми – AsCHS3 и 8, могут определять синтез флавоноидов во всех проанализированных органах в процессе развития растения чеснока, и основная халконсинтазная активность определяется AsCHS8, экспрессия которого в отдельных органах не только наиболее значима, но и чувствительна к воздействию стрессовых факторов. Остальные шесть генов (AsCHS1, 2, 4–7) могут участвовать в биосинтезе флавоноидов в узкоспециализированных клетках/тканях/органах или на отдельных стадиях развития растений чеснока. Проведенные идентификация и характеристика генов халконсинтаз AsCHS1–8 чеснока могут стать основой для дальнейшего анализа механизмов регуляции стрессовой адаптации A. sativum, а также других видов Allium.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (№ 24-76-10005; характеристика и анализ генов, экспрессионный анализ) и Министерства науки и высшего образования РФ (анализ экспрессии на основе данных транскриптомного анализа).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных и человека.

Об авторах

О. К. Анисимова

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Email: michel7753@mail.ru
Россия, Москва

А. В. Щенникова

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Email: michel7753@mail.ru
Россия, Москва

Е. З. Кочиева

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Email: michel7753@mail.ru
Россия, Москва

М. А. Филюшин

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: michel7753@mail.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы