Микробиота кишечника как модулятор постстрессорного нейровоспаления: методологические ограничения существующих исследовательских практик

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Микробиота кишечника — сложная экосистема бактерий, вирусов, грибов и архей, населяющих кишечник человека и животных. С одной стороны, данные микроорганизмы играют ключевую роль в поддержании функционального состояния многих систем “организма-хозяина”: участвуют в пищеварении, синтезе витаминов, метаболизме лекарств, а также в модуляции иммунных процессов. С другой стороны, в последние годы микробиота кишечника стала предметом активного изучения в связи с ее возможным влиянием на широкий спектр патологических процессов. Так, сегодня сложно найти нейро- или психопатологию, в развитии которой не “подозревали” бы микробиоту ЖКТ. Ось микробиота-кишечник-мозг является одной из ключевых мишеней для исследований болезни Альцгеймера [1], социального тревожного расстройства [2], расстройств настроения [3, 4].

С точки зрения генетического разнообразия микробиом может превосходить размер генома организма-хозяина более чем на три порядка, а значит потенциально способен синтезировать огромное количество метаболитов, влияющих на физиологию хозяина [5].

Кроме толстого кишечника, микробные ниши существуют по всему ЖКТ, в частности, в полости рта (например, на языке, зубном налете, поверхностях десен) и тонком кишечнике [6].

Под термином “ось микробиота-кишечник-мозг” понимают двунаправленную связь между микробиомом и мозгом хозяина. Существует несколько способов, с помощью которых происходит эта коммуникация: микробы способны продуцировать нейроактивные соединения, такие как короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), могут модулировать иммунную систему и этот иммунный сигнал транслируется в мозг, так же обнаружена прямая возможность стимуляции микробными метаболитами блуждающего нерва [7]. Кроме того, микробиота может влиять на эпигенетические модификации, что приводит к изменению экспрессии генов в клетках как кишечника, так и мозга. Такие КЦЖК как бутират, ацетат и пропионат могут ингибировать гистоновые деацетилазы (HDACs), что приводит к изменениям в ацетилировании гистонов [8].

Одной из ключевых дискуссий последних лет является вопрос о том, как стресс влияет на состав и функциональные характеристики микробиоты кишечника. Психологические и физические стрессоры как острые, так и хронические приводят к изменениям в микробиоте, которые, возможно, могут способствовать развитию нейровоспаления и нарушений поведения. Понимание этих взаимосвязей важно для разработки новых терапевтических стратегий при стресс-ассоциированных расстройствах, таких как депрессия и тревожные расстройства.

Однако зачастую обнаруженные “дисбиотические паттерны” в микробиомах человека и модельных животных не являются специфичными и выявляются при множестве патологических состояний, высказывается мнение, что они вторичны по отношению к болезни [9]. Большинство исследований в области эффектов стресса на микробное сообщество ЖКТ являются по сути корреляционными [для обзора 10] и поэтому очень ограниченно транслируются в клинику.

Данный обзор направлен на анализ основных проблем и ограничений в текущих исследованиях оси “микробиота-кишечник-мозг”, а также на рассмотрение путей улучшения методологических подходов.

ДИСБИОТИЧЕСКИЕ ПАТТЕРНЫ В МОДЕЛЯХ СТРЕССА И ПРИ ПСИХОПАТОЛОГИЯХ

Микробное сообщество кишечника может очень динамично изменяться в ответ на внешние и внутренние факторы, такие как диета, стресс, инфекции и применение антибиотиков [11, 12]. Эти изменения могут быть как временными, так и устойчивыми, в зависимости от силы и длительности воздействия факторов. Например, кратковременное изменение диеты может быстро поменять состав микробиоты, но эти изменения могут быть обратимыми при возврате к прежнему режиму питания [12].

С другой стороны, разнообразие и композиция микробиоты ЖКТ является индивидуальной особенностью каждого организма и может быть связана с генетическими факторами “организма-хозяина”. Исследования показывают, что генетический фон может влиять на состав и функциональность микробиоты. Близнецовые исследования демонстрируют, что генетически идентичные близнецы имеют более схожую микробиоту, чем дизиготные близнецы [13].

Исследования оси “микробиота-кишечник-мозг” на модельных животных показывают, что наиболее хорошо воспроизводимый и значимый эффект микробиоты – это модуляция социального поведения и реакция организма на стресс [14].

Стресс и социальное поведение тесно переплетены; воздействие хронического стресса влияет на социальные взаимодействия, и, наоборот, социальная среда является предиктором способности справляться со стрессом. Оба эти процесса связаны с похожими нейронными сетями, что указывает на общие механизмы регуляции [2].

Стресс изменяет состав кишечной микробиоты у различных видов, и, наоборот, кишечная микробиота формирует чувствительность к стрессу, главным образом посредством модуляции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (ГГН-оси) [10].

Исследования показывают, что стрессоры (физические, социальные и психо-эмоциональные) могут значительно изменять микробиоту, что, в свою очередь, влияет на поведение и физиологические реакции организма.

Показано, что социальная изоляция у мышей изменяет соотношение бактерий Firmicutes к Bacteroidetes, что приводит к снижению уровня микроорганизмов, производящих КЦЖК, и увеличению количества бактерий, связанных с воспалением [15]. Изучают роль кишечной микробиоты в формировании дефицита социального поведения, используя селектированные линии мышей, обладающих доминантными (Dom) или субмиссивными (Sub) чертами поведения. Мыши линии Sub демонстрируют нарушения социального взаимодействия, депрессивно- и тревожноподобное поведение, а также системное воспаление.

Кроме того, у мышей линии Sub было выявлено увеличение количества условно-патогенных бактерий, таких как Bacteroides и Clostridium по сравнению с линией Dom. Так же было выявлено снижение показателей относительной представленности Lactobacillus и Faecalibacterium [16]. При этом, у линии Sub ранее обнаружены повышение уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, таких как интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-1β (IL-1β) [17]. Авторы предполагают, что нарушения в микробиоте кишечника могут способствовать развитию воспалительных процессов, нарушению барьерной функции кишечника и, как следствие, нарушениям социального взаимодействия у данных животных.

Исследования на GF-мышах (germ free, выращенные в стерильных условиях, “безмикробные мыши”) и SPF-мышах (specific pathogen free, без специфических патогенов) показали, что микробиота влияет на развитие ГГН-оси и, следовательно, на реакцию на стресс. Мыши, выращенные в стерильных условиях, демонстрируют повышенную активность ГГН-оси и более высокий уровень АКТГ и кортикостерона в ответ на стрессор по сравнению с SPF-мышами [18]. Отсутствие микробиоты у GF-мышей связывают с наблюдающимися у них признаками нейровоспаления в тех структурах мозга, которые вовлечены в патогенез связанных со стрессом расстройств [19]. Наряду с высокими уровнями провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β в мозге GF- животных выявляют снижение нейротрофического фактора мозга BDNF [20].

Изучается и действие физических стрессоров. Было обнаружено, что тепловой стресс значимо изменяет состав и разнообразие микробиоты кишечника: увеличивается количество представителей Firmicutes и уменьшается Bacteroidetes [21].

В модели стресса, связанного с длительным обездвиживанием показано, что хронический стресс приводит к изменениям в микробиоте и повышает восприимчивость мышей к колиту. По сравнению с контрольной группой, у мышей, подвергшихся стрессу, были повышены уровни функциональных таксономических единиц (OTU), способствующих воспалению и относящихся к Helicobacter, Peptostreptococcaceae, Streptococcus и Enterococcus faecalis, но снижены уровни Rikenella, Roseburia и Lachnospiraceae [22].

Одна из самых популярных моделей стресса на ранних стадиях онтогенеза – материнская депривация. У новорожденных крысят ранняя разлука с матерью приводит к сохраняющимся во взрослом возрасте изменениям в работе ГГН-оси, а также оказывает длительный эффект на состав микробиоты у потомства [23].

Наиболее воспроизводимое изменение в микробиоме в ответ на большинство стрессоров – снижение представленности лактобактерий. Впервые продемонстрированное в мышиной модели стресса более четырех десятилетий назад [24] это открытие было впоследствии воспроизведено на макаках-резусах [25], крысах, испытывающих стресс от разлуки с матерью в раннем возрасте [23], и во многих других моделях [для обзора 7].

Обнаруженные на животных изменения микробной композиции ЖКТ в ответ на стрессоры обладают высоким трансляционным потенциалом, поскольку известно, что стресс является ключевым пусковым фактором для многих нейро- и психопатологий.

Однако обнаруженные в исследованиях на людях изменения микробной композиции не являются специфичными для большинства психопатологий. Так, мета-анализ 59 исследований типа “случай-контроль” выявил трансдиагностическую закономерность, то есть общую для различных психических расстройств тенденцию, связывающую нарушения микробиоты кишечника с депрессией, биполярным расстройством, шизофренией и тревожными расстройствами. В частности, было обнаружено уменьшение количества “противовоспалительных” бактерий, продуцирующих бутират, и увеличение количества бактерий, способствующих воспалению [26].

Традиционно патофизиологию депрессии связывают с нейромедиаторными нарушениями, дисфункцией ГГН-оси, нейротрофическими факторами и циркадными ритмами [27]. Исследования последних лет показывают, что у пациентов, страдающих депрессивными расстройствами, обнаруживаются изменения в микробной композиции кишечника, по сравнению со здоровыми испытуемыми [для обзора 28]. Однако результаты данных исследований зачастую контрастируют друг с другом.

В одном исследовании количество бифидобактерий и лактобактерий было снижено у пациентов с депрессией [29] по сравнению с контролем. В другом исследовании было отмечено увеличение у пациентов с депрессией показателей α-разнообразия в стуле, чего не наблюдалось у пациентов, которые ответили на лечение. Показано, что представленность Bacteroidetes, Proteobacteria и Actinobacteria увеличена, а Firmicutes – уменьшена у пациентов по сравнению с контролем, обнаружена отрицательная корреляция между фекалибактериями и тяжестью депрессивных симптомов [30].

Другие авторы показали, напротив, снижение микробного разнообразия в стуле пациентов с депрессией по сравнению с контролем [31].

Мета-анализ, включивший данные 34 исследований (1519 пациентов с различными психопатологиями и 1429 здоровых испытуемых), показал, что данные разных исследователей контрастируют друг с другом. Хотя было выявлено значимое снижение микробного разнообразия у пациентов по сравнению с контрольной группой, такое снижение стабильно наблюдалось только при биполярном расстройстве. Для других расстройств результаты были менее однозначными: не было значимых различий по индексам Шеннона и Симпсона, а различия в бета-разнообразии стабильно наблюдались только при депрессии, психозах и шизофрении [26].

Несмотря на контрастирующие экспериментальные данные, несомненно, что стрессоры изменяют состав микробиоты, что может способствовать развитию нейровоспаления через несколько механизмов: нарушение производства КЦЖК, эпигенетическая регуляция генов, модуляция ГГН-оси. Эти изменения в микробиоте могут способствовать развитию и поддержанию психопатологических состояний, таких как депрессия и тревожные расстройства. Таким образом, кишечная микробиота является важным модулятором постстрессорного нейровоспаления, что подчеркивает необходимость дальнейших исследований в данной области для разработки новых терапевтических стратегий.

Однако для перехода к клиническому использованию данных необходимо устранить противоречия в результатах исследований оси “микробиота-кишечник-мозг”. В настоящее время это затруднено из-за колоссального количества данных, ежегодно получаемых в ходе клинических и доклинических исследований. Кроме того, выделяются несколько методологических проблем в данной области, наиболее важные из которых обсуждаются в следующем разделе обзора.

МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ОГРАНИЧЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ОСИ МИКРОБИОТА-КИШЕЧНИК МОЗГ

Среди основных методологических проблем исследований “оси микробиота-кишечник-мозг” можно выделить следующие:

– корреляционный характер большинства проводимых исследований;

– авторы, пытающиеся установить причинно-следственные связи, например, путем трансплантации стула пациентов GF-мышам, зачастую публикуют только положительные результаты;

– недостатки экспериментальных дизайнов, связанные с игнорированием возможных спонтанных изменений микробиоты и индивидуальных различий микробной композиции;

– чрезмерная стандартизация в экспериментах повышает воспроизводимость за счет снижения внешней валидности;

– ограничения, связанные с несовершенством методик для оценки поведения животных, напоминающего психопатологические симптомы у человека;

– недостатки, связанные с использованием методов секвенирования и биоинформатического анализа данных.

Поскольку точное определение “нормального” или “здорового” микробиома еще не установлено [32], термин “дисбиоз” используют для обозначения изменений в микробиоме, связанных с определенным заболеванием или состоянием, по сравнению с контрольными показателями. В большинстве случаев не установлено, являются ли такие “дисбиотические” микробиомы причиной или следствием заболевания, или оба явления вызваны третьим фактором [14]. Для того чтобы микробиом стал надежной мишенью для вмешательств, требуется подтверждение этих причинно-следственных связей.

Одна из возможностей установить причинно-следственные связи, это трансплантация стула от здоровых доноров и пациентов безмикробным GF-мышам. Такие исследования показывают, что микробиота больных людей может воспроизводить патологии у грызунов [для обзора 14]. Однако, к таким исследованиям есть ряд критических замечаний.

Отрицательные результаты часто не публикуются, что создает иллюзию, будто 9 из 10 исследований, в которых была произведена трансплантация стула, имеют положительные результаты. Предварительная регистрация рассматривается сегодня как одна из основных возможностей коррекции “публикационных искажений” [33]. Такая регистрация подразумевает предварительное документирование гипотез и плана предполагаемого анализа. Это позволяет избежать выборочного представления результатов на основе значимости различий.

Считают, что низкая воспроизводимость и трудности с трансляцией в клинику результатов исследований оси “микробиота-кишечник-мозг” связаны с большим количеством ошибок первого рода (ложноположительные результаты), практика предварительной регистрации способна уменьшить их количество [33].

В исследованиях по трансплантации стула от человека к животным зачастую используют псевдореплики, формируя выборку, когда стул от одного донора пересаживают нескольким мышам и считают размером выборки количество мышей, а не доноров, при этом именно последние представляют собой биологические повторности.

Не тестируется дисбиоз у пациентов и животных до вмешательства [14]. Например, в исследовании эффекта психологического стрессора (наблюдение за конспецификами, которые подвергаются действию электрического тока) на мышах показано, что относительная представленность таких таксонов как Proteobacteria и Actinobacteriota выше у стрессированных по сравнению с контролем; представленность родов Parasutterella и Rikenellaceae_RC9_gut_group также повышена у стрессированных мышей, в то время как Bacteroides, Alistipes, и Lactobacillus снижены у стрессированных по сравнению с контролем. В ответ на стресс также снижается показатель разнообразия (Chao1 index) у стрессированных животных по сравнению с контролем [34]. При этом авторы данного исследования не проводили забор стула у животных обеих групп до начала эксперимента и, таким образом, нет уверенности, что указанные различия связаны именно с действием стрессора, а не с какими-либо неучтенными факторами (например, “эффект клетки”). Кроме того, в данной работе провели трансплантацию стула от стрессированных мышей животным, на протяжении 5 дней принимавшим антибиотик. Авторы делают вывод о том, что пересадка микробиоты стрессированных животных повышает чувствительность к стрессу, поскольку изменились параметры в поведенческих тестах, однако не проводился забор стула и анализ микробиоты ни в ответ на антибиотикотерапию, ни после трансплантации.

В целом, несмотря на рекомендации учитывать возможные динамические процессы в составе микробиоты интактных животных [35], в большинстве исследований забор кала для анализа в контрольной и экспериментальной группах проводится однократно [например, 34, 36]. В то же время имеются данные о значительных изменениях показателей альфа-разнообразия у интактных половозрелых грызунов, содержащихся в стандартных условиях, если отбор биоматериала проводить каждую неделю [37]. Проведенные нами исследования постстрессорных изменений микробиоты кишечника у крыс с контрастной возбудимостью нервной системы показали, что забор материала у всех животных до начала эксперимента позволяет установить наличие исходных различий в представленности некоторых таксонов в контрольных и экспериментальных группах [38].

Поскольку грызуны являются копрофагами, микробиом фекалий животных, живущих в одной клетке, со временем становится более однородным (так называемый “эффект клетки”), поэтому эксперименты необходимо проводить в нескольких клетках и учитывать возможное влияние этого фактора [35].

С учетом вышесказанного, а также того, что даже генетически идентичные грызуны могут отличаться по-своему микробиому из-за неконтролируемых факторов окружающей среды, представляется важным, во-первых, делать забор стула у всех животных до начала эксперимента, а также в нескольких временных точках не только у экспериментальной, но и у контрольной группы. Это позволит, с одной стороны, убедиться, что микробиота контрольных животных изначально значимо не отличалась от экспериментальных групп и сравнения с контролем имеют смысл. Кроме того, это позволит убедиться, что не имело место спонтанное изменение микробной композиции. Еще одно преимущество такого дизайна в том, что он позволяет проводить не только сравнения “кейс\контроль”, но и оценить постстрессорные изменения микробиоты кишечника у одних и тех же животных, что важно в перспективе развития персонализованных подходов.

Еще один способ приблизиться к пониманию причинно-следственных связей – это наблюдение за последствиями коррекции микробного сообщества. Есть данные, что определенные штаммы бактерий могут обращать вспять различные эффекты стресса, например введение пробиотиков снижает выраженность тревожно-подобных и депрессивно-подобных симптомов у стрессированных мышей [для обзора 39].

Однако, как и во всех исследованиях, где оцениваемыми переменными является сложное поведение животных, наблюдаются трудности с воспроизводимостью результатов даже в рамках одной лаборатории [40]. Наряду с методическими проблемами, связанными с методами секвенирования и биоинформатического анализа, используемыми для идентификации микроорганизмов, ключевой причиной таких расхождений в данных являются ограничения классических поведенческих тестов.

В большинстве работ, анализ поведения животных в ответ на стрессор – это однократный 5-минутный срез, поэтому выводы о том, что изменения в микробиоме и поведении являются одновременными, а потому вероятнее всего связанными, преувеличены. Критерии “похожести на болезнь человека” часто расплывчаты, неопределены или просто описаны постфактум [14].

В отношении классических поведенческих методик, таких как “Открытое поле”, “Приподнятый крестообразный лабиринт”, которые активно используются в доклинических исследованиях оси “микробиота-кишечник-мозг” в настоящее время обсуждают ряд методологических проблем, наиболее важными из которых являются: несоответствие времени тестирования поведения суточным ритмам активности грызунов; ограниченное время тестирования (в среднем 5 минут); невозможность лонгитюдного наблюдения, так как многие тесты нет смысла проводить повторно из-за явления габитуации; игнорирование индивидуальных различий.

Один из способов преодолеть указанные ограничения поведенческих тестов, который активно обсуждается в литературе – широкое внедрение автоматизированных систем и технологий, позволяющих вести лонгитюдное наблюдение за активностью животных в домашних клетках [41]. Долговременный мониторинг поведения позволил бы установить более точную динамику развития поведенческих симптомов стресса и сопоставить ее с динамикой изменений в композиции микробного сообщества ЖКТ. Это даст возможность учесть индивидуальные, в том числе генетически детерминированные, различия в микробиоте, что обеспечит более точное и персонализированное понимание взаимодействий между стрессом, микробиотой и поведением.

Нужно учитывать и ограничения метода секвенирования гена 16S рРНК, изначально разработанного для изучения микробного разнообразия в экологических системах и в применении к исследованию количественного соотношения микробов в ЖКТ могут возникнуть следующие трудности.

Одно из важнейших критических замечаний связано с тем, что микробная нагрузка (общее количество микроорганизмов) зачастую существенно варьируется между образцами. В этом случае относительное профилирование, которое выражает количество различных таксонов в процентах от общего числа секвенированных микроорганизмов, может вводить в заблуждение. Если общее количество микроорганизмов варьируется, это может искусственно изменить видимую долю каждого таксона. Например, в образце с низким общим количеством микроорганизмов один таксон может казаться более распространенным, чем в образце с высоким общим количеством микроорганизмов, даже если абсолютное количество этого таксона одинаково в обоих образцах. Поскольку относительное профилирование не предоставляет информацию об абсолютных количествах микроорганизмов, это затрудняет сопоставление данных с физиологическими параметрами или концентрациями метаболитов, которые измеряются в абсолютных единицах. Для решения этих проблем предлагают использовать подходы, которые комбинируют относительное профилирование с методами для оценки абсолютного количества микроорганизмов, такими как проточная цитометрия или использование внутренних стандартов в секвенировании [42].

Ген 16S рРНК обладает высокой степенью консервативности, что затрудняет различие между близкородственными видами. Это может привести к неточностям в идентификации микроорганизмов на уровне вида и даже рода и таким образом снижает разрешающую способность метода. ПЦР-амплификация, используемая для подготовки образцов к секвенированию, может вносить систематические ошибки. Некоторые последовательности амплифицируются с разной эффективностью, что искажает реальное соотношение микроорганизмов. Праймеры, используемые для амплификации гена 16S рРНК, могут не одинаково эффективно связываться с ДНК разных микроорганизмов. Это может привести к тому, что некоторые виды будут представлены в результатах в меньшем количестве, чем они реально присутствуют в образце. И, наконец, поскольку разные организмы содержат разное количество копий гена 16S, зачастую наблюдается искажение данных о представленности. Каждая копия гена 16S рРНК будет амплифицирована и секвенирована, а это значит, что организмы с большим количеством копий гена 16S рРНК будут представлены в данных в большем количестве, чем те, у которых копий меньше, даже если их общее количество в образце одинаково [43].

Таким образом, секвенирование 16S рРНК дает скорее информацию о наличии или отсутствии определенных микроорганизмов и их относительной пропорции, но не точные количественные данные. Возможно ртПЦР-верификация должна стать таким же золотым стандартом в метагеномных исследованиях, каковой стала в транскриптомных. Также следует рассмотреть внедрение методов, таких как проточная цитометрия или использование внутренних стандартов [44] для более точного количественного анализа микробиоты.

Ну и наконец, еще одним ограничением в практическом применении, получаемых в микробиомных исследованиях результатов, является отсутствие понимания механизмов, которые стоят за наблюдаемыми изменениями микробиоты в ответ на стресс или у пациентов с психопатологиями. Это не позволяет быть уверенными, что некоторые изменения не могут быть компенсаторными реакциями на заболевание, тогда их “коррекция” может быть вредной.

Таким образом, значимость кишечной микробиоты как модулятора постстрессорного нейровоспаления и ее влияние на центральную нервную систему и поведение не вызывает сомнения. Тем не менее, методологические ограничения, которые обсуждались выше, затрудняют перенос полученных результатов в клиническую практику. Перспективы исследований в этой области определяются успехами в разработке более точных и надежных методик для количественного анализа микробиоты, улучшением экспериментальных дизайнов, а также появлением более валидных моделей поведенческих расстройств и методов оценки поведения животных. Преодоление этих методологических проблем будет способствовать лучшему пониманию сложных взаимодействий между микробиотой, стрессом и нейропсихопатологями, открывая путь для разработки новых, более эффективных терапевтических вмешательств.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Внешнее финансирование отсутствует.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

И. Г. Шалагинова

Балтийский федеральный университет им. И. Канта

Автор, ответственный за переписку.
Email: shalaginova_i@mail.ru
Россия, Калининград

С. П. Лузикова

Балтийский федеральный университет им. И. Канта

Email: shalaginova_i@mail.ru
Россия, Калининград

А. Э. Вылегжанина

Балтийский федеральный университет им. И. Канта; Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Email: shalaginova_i@mail.ru
Россия, Калининград; Санкт-Петербург

Д. С. Кацеров

Балтийский федеральный университет им. И. Канта

Email: shalaginova_i@mail.ru
Россия, Калининград

Список литературы

Дополнительные файлы