Устойчивые к воздействию тяжелых металлов PGPR штаммы Pseudomonas sp., стимулирующие рост люцерны посевной при кадмиевом стрессе

Полный текст

В настоящее время в результате растущей техногенной нагрузки актуальной проблемой сельского хозяйства является загрязнение почвы, снижение урожайности растений и качества аграрной продукции. На сегодняшний день одними из наиболее опасных экополлютантов являются тяжелые металлы (ТМ), такие как свинец (Pb), кадмий (Cd), ртуть (Hg), хром (Cr), цинк (Zn) и другие (Choudhury, Chatterjee, 2022). Ряд ТМ (молибден (Mo), железо (Fe), медь (Сu), марганец (Mn), цинк (Zn), никель (Ni), кобальт (Со)) в микроколичествах необходимы для функционирования растений и микроорганизмов. Другие, такие как Cd, Pb, Hg и Ag не выполняют никакой биологической функции и токсичны уже в микродозах (Raklami et al., 2022). ТМ не поддаются разложению и способны накапливаться во всех звеньях пищевой цепи, что приводит к снижению роста и урожайности растений, к опасным заболеваниям человека и животных (Pande et al., 2022). Одним из многообещающих подходов к решению данных проблем является использование стимулирующих рост растений бактерий (PGPR), (plant growth-promoting rhizobacteria), которые колонизируют корни растения и способны улучшить его рост как в нормальных, так и в стрессовых условиях путем синтеза антимикробных и антигрибных соединений, органических кислот, гормонов, сидерофоров, фосфатмобилизующих свойств и других процессов (Wang et al., 2022). Также PGPR бактерии, обладающие устойчивостью к ТМ, могут снизить токсическую нагрузку на растения за счет различных механизмов: биосорбции, биоаккумуляции, биотрансформации и биоминерализации (Raklami et al., 2022).

По данным литературы значительная часть ризосферных микроорганизмов представлена грамотрицательными бактериями Pseudomonas sp. (Berendsen et al., 2015). Представители данного рода отличаются высокой конкурентоспособностью и метаболитической активностью, среди них описаны штаммы P. putida, P. fluorescens, P. chlororaphis, P. protegens, P. kilonensis, обладающие PGPR свойствами (Gu et al., 2020; Чубукова и др., 2022). Биоудобрения на оcнове PGPR штаммов Pseudomonas sp. активно применяют в агротехнологиях для повышения урожайности сельскохозяйственных культур, поддержания продуктивности почвы и снижения доли вносимых химических удобрений (Singh et al., 2022). В различных исследованиях также продемонстрированы примеры успешного применения PGPR штаммов псевдомонад для улучшения роста растений в почвах, загрязненных ТМ. Описана работа, в которой обработка растений томата (Lycopersicon esculentum), штаммом Pseudomonas aeruginosa, в условиях кадмиевого загрязнения вызвала улучшение ростовых параметров, повышение содержания фотосинтетических пигментов и снижение накопления Cd в тканях растения (Khanna et al., 2019). В работе (Manzoor et al., 2019) было показано, что в результате инокуляции штаммом Pseudomonas sp. strain PG-12 папоротника Pteris vittata, растущего на среде, загрязненной Pb, происходило улучшение фосфорного питания, роста и уменьшение содержания Pb в опытных растениях в сравнении с контролем. Штамм Pseudomonas putida SFB3 показал высокую устойчивость к нескольким ТМ (Cd, Cu, Pb, Ni, Zn) и способность улучшать всхожесть и ростовые характеристики вигны лучистой (Vigna radiate) в условиях загрязнения указанными поллютантами (Saif, Khan, 2017). Подобные штаммы могут быть использованы в качестве биоудобрения для выращивания агрокультур на почвах с небольшим загрязнением ТМ.

Для сельского хозяйства перспективным представляется применение многофункциональных штаммов Pseudomonas sp., сочетающих ростостимулирующие свойства и устойчивость к ТМ, которые в перспективе могут способствовать увеличению биомассы растений и усилить защитные свойства растений в условиях загрязнения ТМ.

Целью данной работы был поиск устойчивых к ТМ штаммов Pseudomonas sp., выделенных из загрязненных почв, и исследование ростостимулирующих и защитных свойств данных микроорганизмов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение чистых культур микроорганизмов из образцов почвы. Объектом исследования являлись микроорганизмы, выделенные из образцов почв, собранных в районе химического завода в г. Уфа. Для получения бактериальных изолятов навески почв гомогенизировали в стерильной среде LB (масс. % в водном растворе: бактотриптон – 1, дрожжевой экстракт – 0.5, NaCl – 0.5). Инкубировали на качалке при комнатной температуре и 160 об/мин, через 30 мин отбирали надосадочную жидкость из которой готовили серию десятикратных разведений. Из разведений в 10⁴ и 10⁵ по 100 мкл рассеивали на чашки с агаризованной средой LB, содержащие Pb²⁺и Ni²⁺ (с использованием солей Pb(CH₃COO)₂ и NiCl₂, соответственно) в концентрации 3 мМ и выращивали в течение 5 дней при температуре 28°C (Desoky et al., 2020). Выросшие отдельные колонии пересевали и культивировали на чашках при 28°C и 37°C для исключения потенциальных патогенов человека и животных. Дальнейшие исследования проводились на штаммах с температурой роста при 28°C. Бактериальные изоляты пересевали на агаризованную среду LB без ТМ и выращивали сутки при 28°C.

Максимальную толерантную концентрацию (МТК) к Cd, Ni, Zn, Pb определяли на агаризованной питательной среде Nutrient Broth (NB) (масс. % в водном растворе: бактотриптон – 0.5, мясной экстракт – 0.15, дрожжевой экстракт – 0.15, NaCl – 0.5, агар – 0.1) c возрастающими концентрациями ТМ (Mtengai et al., 2022). Для этого предварительно стерилизованные растворы солей CdCl₂, NiCl₂, ZnSO₄, Pb(CH₃COO)₂ в различных концентрациях добавляли к среде NB с агаром сразу после автоклавирования. МТК определяли как максимальную концентрацию металла в среде, при которой еще наблюдался рост колоний на чашках с агаром. Контролем служила среда без добавления ТМ. Штаммы выращивали на чашках при 28°C в течение 5 суток.

ДНК из бактерий выделяли лизированием клеток в 1% Triton X100 и 1% – ной суспензии Chelex100. Надосадочную жидкость брали в качестве матрицы для ПЦР (Чубукова и др., 2022).

Молекулярно-генетическая идентификация бактериальных штаммов. Генетическое разнообразие собранных изолятов исследовали с помощью RAPD анализа (Random Amplified Polymorphic DNA) с использованием следующих “случайных” праймеров: 1) LMBD 5'-GGGCGCTG-3'; 2) AFK 5'-ACGGTGGACG-3' (Чубукова и др., 2022).

Для амплификации гена 16S рРНК были использованы универсальные праймеры fD1 5'-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAG CC-3' и rD1 5'-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', фланкирующие фрагмент гена размером около 1500 пн (Чубукова и др., 2022). Для амплификации фрагмента гена rpoD были использованы праймеры PsEG30F 5'-ATYGAAATCGCCAARCG-3' и PsEG790R 5'-CGGTTGATKTCCTTGA-3' с размером продукта 760 п.н. (Mulet et al., 2009).

Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3500 фирмы “Applied Biosystems, Inc.” (США) с использованием наборов “Big Dye Terminator v. 3.1”.

Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы “DNASTAR, Inc.” (США). Нуклеотидные последовательности для сравнительного анализа были взяты из базы данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием метода множественного выравнивания Clustal W в программе Megalign Lasergene (DNASTAR, США).

Статистическую достоверность ветвления (bootstrap-анализ) оценивали с использованием соответствующей функции программы Megalign на основе 1000 альтернативных деревьев.

Анализ бактериальных биопленок, формируемых на инертных поверхностях. Для получения биопленок использовали среду LB, YM (масс. % в водном растворе: маннитол – 1, дрожжевой экстракт – 0.04, NaCl – 0.01, MgSO₄ – 0.01, K₂HPO4 ∙ 3H₂O – 0.05, агар – 1) и MH (масс. % в водном растворе: кислый казеиновый пептон – 1.75, крахмал – 0.15, вытяжка из говядины – 0.2) с применением 24-луночных пластиковых планшетов (полистирол) (“Corning Inc.”, США) согласно методике (Чубукова и др., 2022). Для определения относительных показателей плотности биопленки использовали метод окрашивания генцианом фиолетовым (“Агат-Мед”, Россия) (Чубукова и др., 2022). Оптическую плотность образцов измеряли с помощью прибора Enspire Model 2300 Multilabel Microplate Reader (“Perkin Elmer”, США).

Микроскопирование корней растений. Для исследования способности бактерий формировать биопленки на корнях растений штаммы Pseudomonas sp. были трансформированы ранее сконструированной генетической конструкцией на основе вектора pJN105, в которую был добавлен ген флуоресцентного белка TurboRFР (Баймиев и др., 2011). Полученными флуоресцентными штаммами псевдомонад были обработаны корни проростков люцерны.

Подготовка электрокомпетентных клеток и их трансформация, а также электрофорез фрагментов ДНК проводились согласно (Sambrook, 1989).

Стерильные семена люцерны посевной (Medicago sativa, L.) проращивали в течение 7 дней на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри. Далее проростки выдерживали при покачивании (50 об./мин) в суспензии бактерий (10⁶ КОЕ/мл) в течении суток. Для приготовления суспензий использовали суточные культуры бактерий, выращенные в жидкой среде LB.

Визуальное наблюдение меченых микроорганизмов на корнях растений проводили на флуоресцентном микроскопе AxioImagerM1 (“CarlZeiss”, Германия).

Исследование влияния бактерий на рост растений. Семена растений люцерны посевной стерилизовали в течении 1 мин в 70% спирте, затем 20 мин в 5% растворе гипохлорита натрия и промывали несколько раз стерильной водой. Далее семена выдерживали в течение 30 мин в воде (контроль) или в суточной суспензии бактерий, которые предварительно выращивали на качалках в жидкой среде LB до концентрации 10⁸ KOE/мл и разводили до концентрации 10⁶ КОЕ/мл. Семена (100 штук) выращивали на смоченной водой фильтровальной бумаге в течение 3 сут при комнатной температуре в темноте. Аналогично выращивали в стрессовом варианте опыта семена без обработки и с обработкой бактериями на фильтровальной бумаге, смоченной раствором CdCl₂ в концентрации 0.5 мМ. Далее проросшие семена выращивали при естественном освещении в дистиллированной воде или в стрессовом варианте опыта в растворе CdCl₂ в концентрации 0.5 мМ в течение 7 сут. Часть растений использовали для определения содержания фотосинтетических пигментов, у остальных контрольных и опытных растений измеряли сухую биомассу. Для этого растения целиком высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса, а затем взвешивали.

Определение содержания фотосинтетических пигментов. Экстракцию и определение содержания пигментов в растительных тканях проводили согласно (Maslennikova et al., 2022). Для этого листья растений (0.05 г) гомогенизировали в 90% этаноле (10 мл) с добавлением CaCO₃ и фильтровали. Оптическую плотность отфильтрованных экстрактов измеряли с помощью спектрофотометра SmartSpecTM Plus spectrophotometer (Bio–Rad, США) при 663 (Хл a), 646 (Хл b).

Выявление фосфатмобилизующей активности при росте бактерий на агаризованной питательной среде. Анализ способности штаммов Pseudomonas sp. к мобилизации неорганического фосфора проводили по определению площади зоны просветления (гало) вокруг колоний через 1–4 сут на чашках со средой Муромцева (масс. % в водном растворе: глюкоза – 1, аспарагин – 1, K₂SO4 – 0.02, MgSO4 – 0.02, кукурузный экстракт – 0.002, агар – 2; рН 6.8), содержащей нерастворимый фосфат. В качестве источника фосфора в среду добавляли Ca₃(PO₄)₂ в концентрации 5 г/л (Чубукова и др., 2022).

Определение способности бактерий синтезировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Для изучения способности микроорганизмов синтезировать ауксины их выращивали на среде LB с добавлением 1 мг/мл триптофана в течение 5 сут, после чего культуру центрифугировали 5 мин при 1300 об/мин. Затем к супернатанту добавляли реактив Сальковского (2 мл 0.5 М раствора FeCl₃ и 100 мл 37% HClO₄) в соотношении 1:2 и выдерживали в темноте в течение 30 мин. Определение уровня ауксинов в супернатанте проводили колориметрическим методом по калибровочной кривой, построенной с использованием растворов ИУК с концентрацией 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 мкг/мл с помощью планшетного спектрофотометра Enspire Model 2300 Multilabel Microplate Reader (“Perkin Elmer”, США) при 535 нм (Maslennikova et al., 2022).

Определение сидерофорной активности. Продукцию сидерофоров определяли, используя универсальный метод, с применением минимальной среды с CAS-реактивом (синий агар) (Maslennikova et al., 2022). Бактерии выращивали на чашках с «синим» агаром в течение 7 дней. Появление желтого «гало» вокруг колонии выявляло выделение сидерофоров.

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в 4-кратной повторности и каждый независимо воспроизводили не менее 3 раз.

Результаты обрабатывали с использованием пакета Microsoft Office Excel 2010, доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

Депонирование штаммов. Последовательности исследованных штаммов были зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами ON892076, ON892493, ON892495 для гена 16S рРНК и ON993895, OP019022, OP019023 для гена rpoD, соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Из загрязненной почвы нами было выделено и исследовано 120 изолятов бактерий, выросших на среде с ТМ. Из них было отобрано 70 изолятов с оптимальной температурой роста 28°C. Для идентификации штаммов псевдомонад из различных природных образцов ранее M. Мюлет с соавторами предложили использовать ПЦР с применением разработанных ими высокоселективных праймеров (PsEG30F и PsEG790R), специфичных к консервативным регионам гена rpoD бактерий Pseudomonas sp., кодирующего бактериальный фактор инициации транскрипции (Mulet et al., 2009; Lalucat et al., 2020). ПЦР анализ бактериальных изолятов с указанными праймерами выявил ожидаемый продукт в размере 760 п.н. у трех штаммов. Отобранные чистые культуры изучаемых микроорганизмов предварительно проверяли на гетерогенность с помощью RAPD-анализа с применением “произвольных” олигонуклеотидных праймеров AFK и LMBD.

Для определения филогенетической принадлежности данных штаммов было проведено исследование нуклеотидной последовательности фрагментов консервативных генов rpoD и 16S рРНК и сравнительный анализ с другими аналогичными генами из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). В настоящее время принято считать, что для видовой идентификации бактерий сравнительный анализ генов 16S рРНК обладает недостаточной дискриминирующей способностью вследствие небольшого числа замен в нуклеотидной последовательности данного гена. Это особенно актуально для бактерий рода Pseudomonas, включающего более 200 видов, многие из которых филогенетически очень близки (Lalucat et al., 2020). В отличие от гена 16S рРНК ген rpoD представлен у бактерий в одной копии, и его последовательность отличается значительной вариабельностью вследствие высокой эволюционной изменчивости. Во многих исследованиях показано, что для бактерий рода Pseudomonas филогенетический анализ гена rpoD в сравнении с геном 16S рРНК обладает большей разрешающей способностью для идентификации изолятов до вида (Mulet et al., 2010; Lalucat et al., 2020).

 

Рис. 1. Филогенетическое древо бактерий, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена 16S рРНК. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа (показаны величины показателя “bootstrap”-анализа от 70%). На горизонтальной оси приведен вес данного выравнивания, выраженный в количестве замен нуклеотидов (×100). В качестве внешней группы использована нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК E. coli ATCC 11775T.

 

Анализ последовательностей генов 16S рРНК и rpoD позволил отнести все три исследуемых штамма, получившие название 17 HM, 65 HM и 67 HM, к роду Pseudomonas. На филогенетических деревьях, построенных на основе сравнения последовательностей вышеуказанных генов типовых штаммов псевдомонад и трех идентифицируемых штаммов, последние разделились на три обособленные группы (рис. 1, 2). На древе сходства генов 16S рРНК штамм Pseudomonas sp. 17 HM показал очень высокий уровень гомологии с типовыми штаммами Pseudomonas capeferrum WCS358^T и Pseudomonas putida ATCC 12633^T (99.4% и 99.6%, соответственно), тогда как его сходство по гену rpoD с указанными штаммами составило 99.7% и 85.9%, соответственно. Таким образом, на основании полученных данных штамм Pseudomonas sp. 17 HM можно идентифицировать как P. capeferrum. Штамм Pseudomonas sp. 65 HM на 16S рРНК и rpoD-дендрограммах оказался наиболее близок к типовому штамму Pseudomonas silesiensis A3^T (99.7% и 96.7%, соответственно), а Pseudomonas sp. 67 HM к типовому штамму Pseudomonas umsongensis LMG 21317^T (98.6% и 95.6%, соответственно). Охарактеризованные штаммы были депонированы в коллекции микроорганизмов ИБГ УФИЦ РАН «Симбионт».

 

Рис. 2. Филогенетическое древо бактерий, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена rpoD. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа (показаны величины показателя “bootstrap”-анализа от 70%). На горизонтальной оси приведен вес данного выравнивания, выраженный в количестве замен нуклеотидов (×100). В качестве внешней группы использована нуклеотидная последовательность гена rpoD E. coli ATCC 11775T.

 

По ранее полученным данным сравнительного анализа генов 16S рРНК и rpoD род Pseudomonas можно разделить на три основные группы: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pertucinogena и Pseudomonas fluorescens (Lalucat et al., 2020; Girard et al., 2020). Секвенирование вышеуказанных генов выявило, что штаммы Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM с большой вероятностью можно отнести к видам P. capeferrum, P. silesiensis, P. umsongensis, соответственно, которые входят в группу P. fluorescens. Сообщалось, что представители данных видов в большинстве случаев были выделены из почв и многие из них обладали свойствами PGPR бактерий, а также способностью к биоаккумуляции и биодеградации загрязняющих веществ (Berendsen et al., 2015; Kaminski et al., 2018; Narancic et al., 2021).

Анализ металлорезистентности бактериальных штаммов. При культивировании штаммов Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM на питательной агаризованной среде NB с ТМ было установлено, что исследуемые бактерии характеризуются разным уровнем устойчивости к токсическому действию Cd, Ni, Pb, Zn (табл. 1). Минимальный уровень резистентности все три штамма псевдомонад показали к Zn и Cd; МТК цинка составил 1 мМ для трех штаммов, а МТК кадмия – 1, 1.5 и 1 мМ для штаммов Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM, соответственно. Значительную резистентность все штаммы проявили к Pb; МТК штаммов Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM составила 5, 5, 4 мМ, соответственно. Наиболее высокую резистентность исследуемые штаммы псевдомонад проявили к Ni, причем наилучшие показатели были у Pseudomonas sp. 65 HM (МТК 9 мМ).

Таким образом, анализ роста бактерий на твердых средах показал, что штаммы Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM отличаются повышенной резистентностью к Ni и Pb, и низким уровнем резистентности к Zn и Cd, что вероятно связано с различными механизмами устойчивости исследованных микроорганизмов к определенному ТМ. Полученные результаты соответствуют данным других исследований, в которых была выявлена подобная шкала устойчивости к ТМ у различных штаммов Pseudomonas sp., выделенных из донных отложений и почвы (Akinbowale et al, 2007),

 

Табл.1. Максимальные толерантные концентрации (МТК) тяжелых металлов исследованных штаммов бактерий

Штамм Pseudomonas sp.	МТК, мМ
	Cd	Ni	Pb	Zn
17 HM	1	7	5	1
65 HM	1.5	9	5	1
67 HM	1	7	4	1

 

В целом, наиболее высокая резистентность к большинству исследованных ТМ была выявлена у штамма Pseudomonas sp. 65 HM. Подобные устойчивые штаммы могут быть использованы в биоремедиации, например, в качестве биосорбентов для удаления Ni и Pb из загрязненной воды, почвы, промышленных отходов. Ранее сообщалось о эффективной биосорбции Pb из сточных вод почвенной психротрофной бактерией Pseudomonas sp. I3, с минимальной ингибирующей концентрацией Pb²⁺ 7,5 мМ (Li et al., 2017). У штамма Pseudomonas aeruginosa Zambia SZK17 Kabwe1 c множественной устойчивостью к ТМ, включая Ni²⁺ в концентрации до 2 мМ, была показана способность к их удалению из жидкой среды (Mtengai et al., 2022). В исследовании (Patel et al., 2006) описан штамм Pseudomonas fragi, способный к максимальной аккумуляции Ni в присутствии 2 мМ данного ТМ в среде.

Исследование биопленкообразования штаммами Pseudomonas sp. Устойчивость к ТМ выше у бактерий, организованных в биопленки – специализированные структуры, позволяющие им адаптироваться к меняющимся или неблагоприятным условиям окружающей среды (Pande et al., 2022). Бактериальные биопленки являются особенно эффективными для биоремедиации различных сред (почв, воды), загрязненных экополлютантами, из-за высокой микробной биомассы и лучшей, в сравнении с планктонными клетками, способностью к биоаккумуляции и биосорбции различных соединений (Choudhury, Chatterjee, 2022).

Нами была изучена способность штаммов Pseu- domonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM к биопленко- образованию в различных средах на инертных поверхностях. Исследования показали, что все три штамма почвенных псевдомонад формировали зрелые биопленки на поверхности пластиковых планшетов как в богатых, так и в бедных питательных средах (рис. 3).

 

Рис. 3. Биопленки, образуемые штаммами Pseudomonas sp. на поверхности планшета через 7 дней культивирования: а – Pseudomonas sp. 17 НМ, среда LB; б – Pseudomonas sp. 65 НМ, среда YM; в – Pseudomonas sp. 67 НМ, среда MH.

 

Также, применение бактериального препарата на основе резистентных к ТМ PGPR штаммов для фиторемедиации или в качестве биоудобрения будет значительно эффективнее при активной колонизации данными бактериями корневой поверхности растения, сопровождающейся образованием биопленок.

Анализ колонизации корней 7-дневных проростков люцерны после суток совместного инкубирования с флуоресцентными штаммами Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM, 67 HM показал успешное формирование биопленок на корневой поверхности, а также на корневых волосках растений (рис.4).

 

Рис. 4. Образование биопленок на поверхности корней проростков люцерны через 24 ч совместного культивирования: а – Pseudomonas sp. 17 HM; б – Pseudomonas sp. 65 HM; в – Pseudomonas sp. 67 HM.

 

Исследование PGPR свойств штаммов псевдомонад. К механизмам прямого положительного влияния PGPR бактерий на растения относится способность синтезировать фитогормоны и улучшать фосфорное питание растений, за счет повышения доступности в ризосфере соединений фосфора (Raklami et al., 2022).

Одним из известных регуляторов роста, вырабатываемых псевдомонадами, является индолил-3-уксусная кислота (ИУК), которая стимулирует рост и развитие корневой системы, а также может влиять на поглощение и транслокацию ТМ растениями (Chen et al., 2017). У всех проанализированных штаммов Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM, 67 HM, была выявлена способность к синтезу ауксинов, соответствующая значению 5 мкг/мл.

Исследование способности растворять неорганический фосфат в виде фосфата кальция в питательной среде показало, что штаммы Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM, 67 HM обладают фосфатмобилизующей активностью. Причем лучшая мобилизация Ca₃(PO4)₂ наблюдалась у штамма Pseudomonas sp. 17 HM (рис. 5).

 

Рис. 5. Динамика мобилизации неорганического фосфата штаммами Pseudomonas sp.: 1 – 17 HM; 2 – 67 HM; 3 – 65 HM. По оси абсцисс ‒ сутки, на которые измеряли площадь мобилизации фосфата; по оси ординат ‒ значения площади зон мобилизации фосфата в мм².

 

К непрямым механизмам положительного воздействия бактерий на растения можно отнести продукцию сидерофоров, низкомолекулярных соединений, эффективно связывающих трехвалентное железо (Fe³⁺) из почвы в комплексы, которые далее поступают в клетки бактерий. Таким образом, сидерофор-продуцирующие ризосферные бактерии, конкурируя за железо, замедляют рост фитопатогенных грибов и улучшают рост растения (Maslennikova et al., 2022). Сидерофорная активность была выявлена у штаммов Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM, 67 HM.

Влияние штаммов псевдомонад на ростовые показатели и содержание фотосинтетических пигментов в листьях люцерны посевной в нормальных условиях и в присутствии кадмия. Люцерна является важной бобовой кормовой культурой, отличающейся высокой урожайностью, пищевой ценностью и способностью к повышению продуктивности почвы. Поэтому большое значение имеет исследование способов снижения токсического действия ТМ на данное растение.

Кадмий считается одним из наиболее токсичных ТМ, действие которого в отношении растений проявляется в ингибировании роста, фотосинтеза, снижении урожайности (Khanna et al., 2019). Ранее нами было показано, что Cd²⁺ в концентрации 0.5 мМ оказывал выраженный токсический эффект на проростки люцерны и гороха, тогда как обработка семян штаммом Pseudomonas sp. 2.4.1 снижала влияние кадмиевого стресса у инокулированных растений (Khakimova et al., 2023; Хакимова и др., 2022).

 

Рис. 6. Влияние штаммов Pseudomonas sp. на сухую биомассу растений люцерны посевной (по оси ординат изменение сухой биомассы растений в г при нормальных условиях (а) и в условиях кадмиевого стресса (б). Обозначения штаммов Pseudomonas sp. (1–4): 1 – контроль; 2 – 17 HM; 3 – 65 HM; 4 – 67 HM.

 

В нашем исследовании обработка семян люцерны посевной штаммами Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM, 67 HM в нормальных условиях приводила к прибавке сухой массы в 20–22% относительно контрольных, необработанных растений (рис. 6а).

Анализ сухой биомассы 7 суточных растений люцерны показал, что кадмиевый стресс закономерно снижал сухую биомассу растений почти в 2 раза по сравнению с нормальными условиями роста. Предобработка штаммами псевдомонад в стрессовых условиях приводила к повышению сухой биомассы люцерны на 25–40 % относительно необработанного контроля (рис. 6б).

Обработка семян штаммами Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM, 67 HM в нормальных условиях привела к сбалансированному увеличению содержания хлорофилла a (Хл а) на 5-9% и хлорофилла b (Хл б) на 14–21 % в листьях люцерны, а сумма данных пигментов в этих растениях была на 7–11% выше уровня контрольных необработанных растений (табл. 2).

 

Табл. 2. Содержание пигментов (мг/г сырой массы) в листьях растений (P ≤ 0.05)

Вариант		Хлорофилл а	Хлорофилл b	Хлорофилл a+ хлорофилл b
Нормальные условия	Контроль	0.54±0.018	0.14±0.010	0.68±0.020
	Pseudomonas sp. 17 НM	0.58±0.019	0.16±0.013	0.74±0.021
	Pseudomonas sp. 65 НM	0.59± 0.017	0.17±0.011	0.76±0.022
	Pseudomonas sp. 67 НM	0.57±0.016	0.16±0.012	0.73±0.020
0.5 мМ Cd2+	Контроль	0.26±0.015	0.10±0.009	0.36±0.014
	Pseudomonas sp. 17	0.35±0.017	0.13±0.011	0.47±0.015
	Pseudomonas sp. 65 НM	0.36± 0.016	0.12±0.012	0.48±0.017
	Pseudomonas sp. 67 НM	0.34± 0.019	0.11±0.009	0.45±0.019

 

В условиях кадмиевого загрязнения в обработанных растениях содержание Хл a было на 31–38%, а Хл b на 10–30% выше уровня контрольного стрессового варианта опыта. Сумма Хл a и b у инокулированных растений была выше соответствующего значения необработанных контрольных стрессовых растений на 25–33% (табл. 2).

Одним из важнейших процессов, обеспечивающим накопление сухой биомассы и в целом продуктивность растений является фотосинтез. Пигментный состав считается основным индикатором, характеризующим работу фотосинтетического аппарата (Khanna et al., 2019; Maslennikova et al., 2022). Обработка семян люцерны штаммами Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM увеличивала содержание Хл a и Хл b в проростках, что свидетельствовало о повышении интенсивности фотосинтеза в листьях инокулированных растений (табл. 2).

Бактериальная обработка семян увеличивала сухую биомассу растений в присутствии Cd относительно неинокулированного контроля (рис. 6б). В эксперименте Cd привел к истощению Хл a и Хл b, а также к двукратному снижению суммы хлорофиллов в стрессированных растениях относительно нормальных условий роста. Предобработка штаммами певдомонад влияла на содержание пигментов в листьях проростков в условиях кадмиевого стресса.

Результаты нашего исследования согласуются с данными работ, в которых показана способность устойчивых к ТМ PGPR штаммов бактерий снижать влияние стресса, вызванного загрязнением ТМ у люцерны посевной. Так, обработка растений люцерны, выросших в почве, загрязненной Cd, почвенными бактериями Sinorhizobium meliloti, устойчивыми к ТМ, способствовала увеличению накопления растительной биомассы и улучшению усвоения питательных веществ по сравнению с неинокулированными растениями (Ghnaya et al., 2015). Сообщалось, что ИУК продуцирующие штаммы Baciilus filamentosus и Bacillus cereus стимулировали рост корней и побегов у проростков люцерны, в условиях загрязения среды Zn и Pb, что снижало токсическое действие данных ТМ на растения (Jócsák et al., 2022).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе из загрязненных почв были выделены и идентифицированы три новых штамма псевдомонад Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM. Исследование показало, что штаммы обладают различным уровнем резистентности к ТМ. Для штаммов Pseudomonas sp. 17 HM, 65 HM и 67 HM, значения МТК составили, соответственно; Cd – 1, 1.5, 1 мМ, Pb – 5, 5, 4 мМ, Ni – 7, 9, 7 мМ, Zn – 1 мМ. Для всех штаммов показано наличие фосфатмобилизующей активности и способность к синтезу ИУК и сидерофоров. Предпосевная обработка семян люцерны данными штаммами псевдомонад приводила к увеличению значений сухой биомассы и фотосинтетических пигментов проростков как в нормальных условиях, так и в присутствии Cd. Данный факт демонстрирует наличие ростстимулирующего и защитного эффектов исследуемых бактерий на растения люцерны в условиях кадмиевого загрязнения на начальном этапе роста. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что описанные PGPR штаммы псевдомонад могут обладать перспективой применения в качестве биоудобрения в нормальных условиях и для повышения устойчивости к стрессу люцерны посевной, вызванного загрязнением Cd. При этом необходимы вегетационные и полевые эксперименты для оценки полного потенциала данных штаммов в снижении токсического действия ТМ на растения.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа была выполнена в рамках госзадания (тема № 122041400162-3) с привлечением приборного парка ЦКП “Биомика” (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП “Агидель”) и УНУ “КОДИНК”.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Данная статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

О. В. Чубукова

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: chubukova@bk.ru
Россия, просп. Октября, 71, Уфа, 450054

Л. Р. Хакимова

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Email: chubukova@bk.ru
Россия, просп. Октября, 71, Уфа, 450054

Р. Т. Матниязов

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра

Email: chubukova@bk.ru
Россия, Российской академии наук просп. Октября, 71, Уфа, 450054

З. Р. Вершинина

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Уфимский государственный нефтяной технический университет»

Email: chubukova@bk.ru
Россия, просп. Октября, 71, Уфа, 450054; ул. Космонавтов, 1, Уфа, 450000

Список литературы

Дополнительные файлы