Использование сети гаплотипов пластидной ДНК для реконструкции филогении рода Rosa L. (Rosaceae)

Полный текст

К роду Rosa разные авторы относят от 150 до 500 видов (Бузунова, 2001; Ku, Robertson, 2003; Wissemann, 2003), распространенных в умеренных областях северного полушария. Точное число дикорастущих видов до сих пор остается предметом дискуссии систематиков. Необычайную сложность рода Rosa в отношении классификации и разграничения видов первым отметил еще Карл Линней, снабдивший только этот род специальным комментарием в первом издании “Species Plantarum” (Linnaeus, 1753): “Species Rosarum difficile distingvuntur, difficilius determinantur; mihi videtur naturam miscuisse plures vel lusu ex uno plures formasse; hinc qui paucas vidit species facilius eas distinguit, quam qui plures examinavit”. (Виды рода Rosa трудны для различения и определения; я видел, как природа, играя, может смешивать многие из них, чтобы получить один новый из множества других; тот, кто видел их мало, различает их легче, чем тот, кто изучил множество).

История таксономического изучения и современное состояние представлений о систематике рода Rosa были достаточно подробно описаны в двух обзорных статьях (Wissemann, 2006; Tomljenović, Pejić, 2018). В них же были рассмотрены ряд молекулярно-филогенетических работ и то влияние, которое они оказали на систематику рода. Кратко резюмируя современное состояние проблемы, можно сказать, что интернет-ресурс the World Checklist of Vascular Plants (The World Checklist, 2022) приводит 367 названий видов и гибридов шиповников, как принятые, и 663 названия, как синонимы. В другой базе данных, Plants Of the World Online (2022), приводятся 271 принятое название видов и гибридов дикорастущих видов шиповников.

Современная классификация рода Rosa до сих пор основывается на работах XIX и XX веков, несмотря на довольно большое число молекулярно-филогенетических исследований, выполненных в последние годы. Последняя по времени классификация рода (Wissemann, 2003) мало чем отличается от классификации Редера (Rehder, 1949), которая, в свою очередь, базируется на таксономических концепциях, созданных еще Крепеном (Crépin, 1869; 1891).

Согласно Виземанну (Wissemann, 2003), род Rosa делится на четыре подрода, наиболее крупный из которых, подрод Rosa, в свою очередь, представлен десятью секциями. В современных таксономических обработках (Ku, Robertson, 2003; Lewis et al., 2022), учитывающих результаты недавних молекулярно-филогенетических исследований, род Rosa включает от 2 до 4 подродов и от 10 до 12 секций в пределах подрода Rosa. Однако фактически, обычно признаются два подрода: Hulthemia с единственным видом R. persica и Rosa, к которому относят все остальные виды. После консервации родового названия Rosa с лектотипом R. cinnamomea (International Code, 2006; International Code, 2018) изменилось применение автонима Rosa в ранге секции: бывшая секция Rosa стала называться Gallicanae, а бывшая секция Cinnamomeae поменяла свое название на Rosa.

Молекулярно-филогенетические исследования XXI века привели к появлению противоречивых филогенетических реконструкций, детальное сравнение которых было проведено в работах Коопмана с соавт. (Koopman et al., 2008) и Фужере-Данезан с соавт. (Fougère-Danezan et al., 2015). Все построенные филогенетические деревья оказались обладающими либо недостаточным разрешением, либо низкими значениями поддержки внутренних узлов дерева. Только в самых недавних работах с использованием тегов однокопийных ядерных генов (Debray et al., 2019) или полных пластидных геномов (Cui et al., 2022) удалось получить деревья с высокой поддержкой базальных и внутренних узлов. К сожалению, эти работы ставили основной целью не реконструкцию филогении рода, как таковую, а оценку пригодности маркеров для реконструкции сетчатой эволюции в роде Rosa в первом случае, и происхождение ряда гибридогенных культиваров во втором. Поэтому обе работы характеризуются недостаточными и несбалансированными выборками таксонов (Приложение, табл. 1). Несмотря на то, что филогенетические деревья разных авторов основаны на разных таксономических выборках и анализе разных маркеров (Приложение, табл. 1), в них наблюдается ряд общих особенностей топологии, таксономическая интерпретация которых в настоящее время стала общепринятой. Так североамериканские виды, ранее традиционно выделявшиеся в отдельную секцию Carolinae, во всех исследованиях оказались принадлежащими к кладе, объединяющей виды секции Rosa (бывшая Cinnamomeae).

 

Таблица 1. Краткая информация по молекулярно-филогенетическим исследованиям рода Rosa.

Источник	Число видов*	Число образцов*	Смещенность таксономической выборки	Внешняя группа	Пластидные маркеры	Ядерные маркеры
Ritz et al., 2005	58	125 (mostly ITS1 clones)	sect. Caninae избыточная выборка, sect. Synstylae недостаточная выборка	без внешней группы	нет	ITS1
Wissemann, Ritz, 2005	61	66	sect. Caninae избыточная выборка	Rubus	atpB-rbcL	ITS1
Bruneau et al., 2007	67	79	sect. Rosa избыточная выборка	Potentilla	trnL-trnF, psbA-trnH	нет
Koopman et al., 2008	46	92	sect. Caninae избыточная выборка, sect. Synstylae и Rosa недостаточная выборка	Rubus	нет	AFLP
Zhang et al., 2013	36	55	sect. Caninae избыточная выборка	без внешней группы	нет	Rc06 SNPSTR
Fougère-Danezan et al., 2015	101	от 55 до 129	не очевидно	Rubus (хп); без внешней группы (яд)	psbA-trnH, trnL-F, trnS-G, интроны trnL, trnG	GAPDH
Liu et al., 2015	32	48	sect. Caninae недостаточная выборка	Rubus, Spiraea	trnL-trnF, atpB-rbcL, интрон rpl16	нет
Zhu et al., 2015a	60	123	sect. Rosa, Pimpinellifoliae, Caninae недостаточная выборка	Potentilla, Rubus	ndhC-trnV, ndhF-rpl32, ndhJ-trnF, psbJ-petA	ITS, GAPDH
Debray et al., 2019	15	15	sect. Caninae отсутствует в выборке	Fragaria, Geum, Potentilla, Rubus	нет	теги ортологичных однокопийных генов
Zhang et al., 2022	37	44	sect. Caninae недостаточная выборка	Dasiphora, Fragaria	полные хп геномы	нет
Cui et al., 2022	37	53	sect. Caninae, Pimpinellifoliae недостаточная выборка	Fallugia, Fragaria, Potentilla, Rubus	полные хп геномы	фазированные риботипы ITS1 и ITS2
данное исследование	101	503	не очевидно, отсутствует sect. Minutifoliae	Agrimonia, Hagenia, Potentilla, Rubus	ndhC-trnV, полные хп геномы	нет

Примечание. * Исключая культивары гибридного происхождения

 

Еще одним фактом, подтвержденным большинством молекулярно-филогенетических исследований, стало то, что род Rosa подразделяется на две большие клады. Одна из них объединяет преимущественно виды секций Rosa и Pimpinellifolae, а другая – преимущественно членов секций Synstylae и Caninae (Wissemann, Ritz, 2005; Bruneau et al., 2007; Fougère-Danezan et al., 2015; Zhu et al., 2015; Liu et al., 2015; Debray et al., 2019; Cui et al., 2022; Zhang et al., 2022). Виды, относимые к секциям Chinenses, Bracteatae, Laevigatae и Microphyllae также обычно ассоциированы с этой второй кладой.

В тех случаях, когда в анализ включались множественные образцы видов секции Caninae, они либо формировали отдельную кладу, либо разделялись на две или три сестринские клады вместе с западно-евразиатскими видами секции Synstylae (Wissemann, Ritz, 2005; Fougère-Danezan et al., 2015). Во многих филогенетических работах было выявлено изолированное базальное положение R. persica (подрод Hulthemia), а также R. minutifolia и R. stellata (секция Minutifoliae), которые в ряде случаев кластеризовались вместе на длинной ветви (Wissemann, Ritz, 2005; Fougère-Danezan et al., 2015; Zhang et al., 2022). Rosa roxburghii (секция Microphyllae), R. laevigata (секция Laevigatae), R. banksiae и R. cymosa (секция Banksianae) образуют одну или несколько отдельных клад, сестринских по отношению к кладе, образованной видами секции Synstylae (Fougère-Danezan et al., 2015; Zhu et al., 2015; Zhang et al., 2022), подтверждая таким образом свой секционный таксономический ранг, ранее предполагавшийся на основании морфологических признаков.

Точное положение и родство отдельных видов часто бывает трудно оценить из-за того, что в разных исследованиях были использованы разные наборы таксонов. На самом деле, проблема еще сложнее, так как многие виды, особенно относящиеся к секциям Caninae и Rosa, сложно надежно определить по морфологическим признакам, вследствие чего разные авторы могли использовать генетически различные образцы под одними и теми же названиями. Многие виды рода Rosa могут гибридизировать при совместном произрастании в природе, а также в ботанических садах и питомниках. Это дополнительно осложняет проблему сравнимости разных филогенетических деревьев в связи с возможным гибридным происхождением отдельных образцов.

Другой общей чертой деревьев, полученных разными авторами, представляется то, что многие концевые и внутренние промежуточные ветви оказываются очень короткими или даже имеющими нулевую длину, в то время как некоторые рано дивергирующие внутренние ветви оказываются длинными. Это указывает на недавнее происхождение большинства видов и клад, в то время как немногие из них являются древними и отдаленно родственными остальным. Этот результат был в последнее время подтвержден в работе Жанга с соавт. (Zhang et al., 2022), которые проанализировали полные пластидные геномы 37 видов рода Rosa. Данные авторы пришли к выводу, что таксоны подрода Rosa прошли быструю одновременную диверсификацию, что и является причиной короткой длины и низкой поддержки ветвей филогенетических деревьев. Они также идентифицировали виды секции Minutifoliae, R. stellata и R. minutifolia, как наиболее рано дивергировавшую кладу, а подрод Hulthemia (R. persica, под названием R. berberifolia) и секцию Pimpinellifoliae (представленную в их работе видами R. xanthina и R. omeiensis) как следующие последовательные клады.

Все перечисленные выше проблемы с интерпретацией филогенетических деревьев приводят к тому, что обсуждение эволюции шиповников продолжается в рамках устаревших классификаций в попытке привязать выявляемые клады к традиционному секционному делению рода, основанному на морфологии.

Алгоритмы филогенетического анализа могут давать проблематичные результаты, когда сама структура данных не является древовидной (Jacob, Blattner, 2006). В цитированном исследовании авторы анализировали филогению рода Hordeum и показали, что глубокая коалесценция (Hudson, 1990) может приводить к неконгруэнтности деревьев, построенных по ядерным и пластидным данным, как в молодых, подверженных быстрому видообразованию группах, так и в старых филогенетических линиях, уходящих в глубину истории рода. Для преодоления этих проблем они реконструировали генеалогические отношения пластидных гаплотипов применив метод статистической парсимонии ко всему роду. Этот же подход был успешно использован для реконструкции филогении и биогеографии подрода Melanocrommium рода Allium (Gurushidze et al., 2010), а также китайских представителей рода Gagea (Peterson et al., 2019). Вероятно, такой подход мог бы быть успешным и в случае рода Rosa, в котором экстенсивная гибридизация между разными видами сочетается с такими факторами, как недавнее происхождение многих видов и присутствие нескольких старых филогенетически изолированных линий. Это создает сетчатый характер эволюции, который не может быть адекватно отображен в виде дихотомически ветвящихся филогенетических деревьев. В этой ситуации мы предлагаем проведение анализа генеалогических связей пластидных гаплотипов методом статистической парсимонии вместо очередных попыток реконструкции филогенетических деревьев видов. Генеалогия пластидных гаплотипов отражает, главным образом, материнскую линию родства, в меньшей степени подверженную влиянию сетчатого характера эволюции. Насколько это известно в настоящее время, пластиды в роде Rosa наследуются строго по материнской линии (Bruneau et al., 2007), хотя в последнее время и появились данные о гетероплазмии у гибридов шиповников (Schanzer et al., 2020). Тем не менее, мы считаем, что прослеживание генеалогий пластидных гаплотипов может оказаться более успешным для оценки границ и эволюционных отношений крупных филогенетических групп шиповников, чем филогенетические реконструкции, основанные на алгоритмах построения деревьев. Данный подход был обоснован Джейкобом и Блаттнером (Jacob, Blattner, 2006) для филогенетического анализа недавно дивергировавших групп, а его использование для анализа рода Rosa было предложено Шанцером (2011). Для того чтобы проследить материнскую линию эволюции у шиповников, минимизировав эффекты сетчатой эволюции на филогенетическую реконструкцию, и выявить границы и эволюционные отношения основных крупных групп в пределах рода мы использовали пластидный межгенный спейсер ndhC-trnV. Высокая вариабельность этого региона ДНК была продемонстрирована для разных групп цветковых растений (Shaw et al., 2007), в том числе и непосредственно для рода Rosa (Fedorova et al., 2010; Meng et al., 2011; Шанцер и др., 2011; Zhu et al., 2015; Schanzer et al., 2020; Zhang et al., 2022). Использование единственного маркера нередко подвергается критике, как недостаточное для филогенетической реконструкции. Однако в нашем случае уже были опубликованы несколько филогенетических реконструкций, построенных по результатам анализа множественных пластидных и ядерных маркеров, что, тем не менее, не позволило добиться лучшего разрешения или более высокой поддержки базальных и внутренних узлов деревьев. В нашем исследовании мы оцениваем потенциал метода сетей гаплотипов для реконструкции эволюции рода Rosa. Следует подчеркнуть, что наш подход был нацелен на реконструкцию генеалогии пластидных гаплотипов, а не филогении видов рода Rosa как таковой. Мы считаем, что гаплотипы или группы близкородственных гаплотипов (гаплогруппы) могут указывать на тесное родство обладающих ими видов или групп видов. Для проверки состоятельности результатов, полученных по единственному пластидному маркеру, мы также проанализировали небольшую выборку последовательностей полных пластидных геномов, доступных в GenBank, используя метод максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML) и алгоритм NeighborNet и сравнили полученные деревья и сплитграфы с нашей сетью гаплотипов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал

Материал для настоящего исследования был по большей части собран нами из естественных популяций шиповников с территории Западной Европы (Германия, Чехия, Венгрия, Хорватия, Италия), Украины, европейской части России, Сибири, Российского Дальнего Востока, Кавказа и Узбекистана. Так как мы ожидали выявления неполной сортировки филогенетических линий для близкородственных недавно дивергировавших групп видов, во всех случаях, где это было возможно, мы включали в анализ несколько индивидуальных растений каждого вида, только 37 видов были представлены единичными последовательностями (Приложение, табл. 2). Ваучерные гербарные образцы мы определяли до уровня вида с использованием определительных ключей в нескольких “Флорах” (Klášterský, 1968; Бузунова, 2001; Henker, 2003; Ku, Robertson, 2003) и при возможности сравнивали наши образцы с типовыми материалами, хранящимися в Гербариях Санкт-Петербурга (LE), Киева (KW), Львова (LW), Вены (W) и Берлина (B). Так как участок ndhC-trnV ранее использовался в молекулярно-филогенетическом исследовании шиповников секций Synstylae и Chinenses (Zhu et al., 2015), которые были недостаточно представлены в нашей коллекции, мы использовали для нашего исследования ряд последовательностей из базы данных GenBank (Zhu et al., 2015) для дополнения нашей матрицы данных (Приложение, табл. 2). Отбирались только последовательности с образцов, собранных в природе, хотя в нескольких случаях мы включили также и последовательности, полученные из растений местных видов, культивировавшихся в ботанических садах. Мы также использовали несколько последовательностей межгенного спейсера ndhC-trnV от образцов таксонов с полными пластидными геномами, опубликованными в GenBank (Jian et al., 2018a; 2018b; Wang Q. et al., 2018; Chen X. et al., 2019; Chen M. et al., 2019; Jeon et al., 2019; Meng et al., 2019; Wang M. et al., 2019; Zhang C. et al., 2019; Zhang S. D. et al., 2019; Zhao et al., 2019; Cui et al., 2020; Yin et al., 2020). Полное выравнивание ndhC-trnV содержало 363 последовательности, полученные из образцов нашей коллекции и 140 последовательностей, полученных из базы GenBank, представлявших 101 вид из всех секций рода, кроме североамериканской секции Minutifoliae (бывший подрод Hesperhodos) представленной двумя видами, R. minutifolia и R. stellata.

 

Таблица 2. Изученные таксоны, образцы и номера последовательностей в GenBank.

Вид	Число изученных образцов	Гаплотип ndhC-trnV	Географический регион	Номера GenBank	Подрод или секция/подсекция по Виземанну (Wissemann, 2003)
R. abyssinica R.Br. ex Lindl.	4	7	Йемен, Эфиопия	KM352638, KM352639, KM352640, KM352641	Synstylae
R. acicularis Lindl.	3	12, 13, 31	Китай (Внутренняя Монголия), Россия (Сахалин, В Сибирь)	MK714016, MK848158, MT302309	Rosa
R. agrestis Savi	3	64, 67, 93	Словакия, Морокко	MT302278, MT302289, MT302300	Caninae/Rubigineae
R. amblyotis C.A.Mey.	4	41	Россия (Камчатка, Сахалин)	KM352696, MK848155, MK848156, MK848157	Rosa
R. anemoniflora Fortune ex Lindl.	2	58	Китай (Фуцзянь)	KM352642, KM352643	Synstylae
R. arabica Crép.	2	91, 92	Египет (Синай)	MT302324, MT302325	Caninae/Rubigineae
R. ´ archipelagica Tchubar	3	58	Россия (Дальний Восток)	MK848172, MK848173, MK848196	Rosa ´ Synstylae
R. arkansana Porter	1	45	Китай, культ.	KM352644	Rosa
R. arvensis Huds.	5	71	Италия, Нидерланды, Венгрия	KM352645-KM352648, MT302311	Synstylae
R. banksiae R.Br.	1	50	Китай (Юннань)	MK361034	Banksianae
R. brunonii Lindl.	2	58	Китай (Тибет), Пакистан	KM352649, KM352650	Synstylae
R. caesia Sm.	1	87	Франция	KM352651	Caninae/Caninae
R. canina L.	51	12, 70, 80, 81, 83, 84, 85, 87, 94, 95	Украина, Россия (Европейская часть, Крым), Франция, Узбекистан, Чехия, Морокко, Италия, Венгрия, Черногория	HQ404961-HQ404979, KJ886967, KM352652, MT273175-MT273176, MT279070, MT279147-MT279149, MT279156, MT279170-MT279171, MT279176, MT279178-MT279180, MT279182, MT279186-MT279187, MT279192, MT302285-MT302286, MT302288, MT302290, MT302292, MT302298, MT302302-MT302305, MT302312-MT302314	Caninae/Caninae
R. × canina	1	68	Украина	MT279071	Caninae
R. caryophyllacea Besser	1	87	Украина	HQ404989	Caninae/Rubigineae
R. caudata Baker	1	7	Китай (Сычуань)	KM352656	Rosa
R. chinensis Jacq. var. spontanea (Rehder & E.H.Wilson) T.T.Yu & T.C.Ku	5	58	Китай (Хубей, Ганьсу, Чунцин, Гуйчжоу)	KM352657-KM352660, MG523859	Chinenses
R. chinensis Jacq.cult. 'Old Blush'	1	58	Китай, культ.	MH332770	Chinenses
R. chomutoviensis Chrshan. & Lasebna	3	81, 83	Украина	MT279088-MT279089, MT279111	Caninae
R. cinnamomea L.	7	38, 41, 43, 44	Нидерланды, культ., Россия (Европейская часть)	KM352712, MT302299, MT302323, MT302326-MT302329	Rosa
R. corymbifera Borkh.	11	72, 87	Украина, Россия (Крым)	HQ404986, MT273177-MT273186	Caninae/Caninae
R. cuneicarpa Galushko & Bagath. ex Buzunova	1	87	Россия (Дагестан)	MT302306	Caninae/Caninae
R. cymosa Tratt.	1	52	Китай (Гуанси)	KM352661	Banksianae
R. davidii Crép.	1	7	Китай (Сычуань)	KM352662	Rosa
R. davurica Pall.	5	41, 42	Китай (Гирин), Россия (Приморский край)	KM352663, MK848168-MK848171	Rosa
R. deqenensis T.C.Ku	1	53	Китай (Юннань)	KM352664	Synstylae
R. derongensis T.C.Ku	1	54	Китай (Сычуань)	KM352665	Synstylae
R. duplicata T.T.Yu & T.C.Ku	2	54	Китай (Тибет, Юннань)	KM352666-KM352667	Synstylae
R. elliptica Tausch ex Tratt.	1	64	Франция	KM352668	Caninae/Rubigineae
R. fedtschenkoana Regel	2	39, 40	Узбекистан	MT279175, MT279181	Rosa
R. filipes Rehder & E.H.Wilson	3	58	Китай (Сычуань)	KM352669-KM352671	Synstylae
R. fujisanensis Makino	1	58	Япония	KM352672	Synstylae
R. gallica L.	38	71, 76, 87	Украина, Франция, Греция, Венгрия, Россия (Крым)	HQ404939-HQ404955, KM352673, MT273141-MT273150, MT273156, MT273187-MT273195	Gallicanae
R. glauca Pourr.	2	64, 88	Украина, Германия	MT302264, HQ404995	Caninae/Rubrifoliae
R. glomerata Rehder & E.H.Wilson	3	8, 28	Китай (Сычуань)	KM352677-KM352679	Synstylae
R. graciliflora Rehder & E.H.Wilson	1	37	Китай (Сычуань)	KM352680	Pimpinellifoliae
R. gremlii (Christ) Christ ex Gremli	6	64, 70	Германия	MT302293-MT302297, MT302301	Caninae/Rubigineae
R. helenae Rehder & E.H.Wilson	6	58	Китай (Сычуань, Юннань, Чунцин, Хубэй, Ганьсу)	KM352681-KM352686	Synstylae
R. henryi Boulenger	8	58	Китай (Чунцин, Чжэдзян, Хэнань, Хунань, Фуцзянь)	KM352687-KM352694	Synstylae
R. hungarica A.Kern.	2	64	Венгрия	MT302307-MT302308	Caninae/Rubigineae
R. kokanica (Regel) Regel ex Juz.	32	15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 29, 30, 32, 33, 34, 36	Узбекистан	MT279140-MT279146, MT279151-MT279152, MT279154-MT279155, MT279157-MT279160, MT279162-MT279169, MT279172-MT279174, MT279177, MT279183-MT279185, MT279190-MT279191	Pimpinellifoliae
R. koreana Kom.	1	27	Россия (Приморский край)	MK848166	Pimpinellifoliae
R. kwangtungensis T.T.Yu & Tsai	1	58	Китай (Гуандун)	KM352697	Synstylae
R. laevigata Michx.	1	48	Китай (Гуанси)	KM352702	Laevigatae
R. lasiosepala F.P.Metcalf	3	58	Китай (Гуанси, Юннань)	KM352698-KM352700	Synstylae
R. laxa Retz.	1	39	Китай (Синьцзян)	KM352701	Rosa
R. lichiangensis T.T.Yu & T.C.Ku	2	54	Китай (Юннань)	KM352703, KY419934	Synstylae
R. longicuspis Bertol.	3	58	Китай (Гуйчжоу, Сычуань, Юннань)	KM352704-KM352706	Synstylae
R. longicuspis Bertol. var. sinowilsonii (Hemsl.) T.T.Yu & T.C.Ku	2	58	Китай (Гуйчжоу, Юннань)	KM352747-KM352748	Synstylae
R. lucidissima H.Lév.	3	61, 63	Китай (Гуйчжоу, Юннань)	KM352710-KM352711, MK782979	Chinenses
R. lucieae Franch. & Rochebr.	3	58	Китай (Гуандун), Корея	KM352707-KM352708, MG727864	Synstylae
R. macrophylla Lindl.	1	26	Китай (Тибет)	KR105779	Rosa
R. marginata Wallr.	12	64, 72, 73, 86, 87	Украина, Россия (Европейская часть, Крым), Франция, Венгрия	HQ404960, KJ886959, KJ886961, KJ886963, KM352755, MT273163-MT273168, MT302310	Caninae/Trachyphyllae
R. marretii H.Lév.	5	41	Россия (Сахалин)	MK848159-MK848163	Rosa
R. maximowicziana Regel	14	58	Китай (Гирин), Корея, Россия (Приморский край)	KM352713, MG727865, MK848165, MK848174-MK848175, MK848177, MK848179, MK848181, MK848183-MK848184, MK848188-MK848189, MK848194-MK848195	Synstylae
R. micrantha Borrer ex Sm.	1	67	Италия	MT302291	Caninae/Rubigineae
R. montana Chaix	1	87	Франция	KM352714	Caninae/Caninae
R. moyesii Hemsl. & E.H.Wilson	1	37	Китай (Сычуань)	KM352715	Rosa
R. multibracteata Hemsl. & E.H.Wilson	1	9	Китай (Сычуань)	KM352716	Rosa
R. multiflora Thunb.	5	10, 58	Китай (Гуйчжоу, Чунцин, Шаньдун), Корея	KM352717-KM352718, KM352720, MG727863, MG893867	Synstylae
R. multiflora Thunb. var. cathayensis Rehder & E.H.Wilson	3	10, 58	Китай (Аньхой, Чунцин)	KM352653-KM352655	Synstylae
R. nutkana C.Presl	1	12	США (Монтана)	MT302321	Rosa
R. odorata (Andrews) Sweet	1	56	Китай (Юннань)	KM352721	Chinenses
R. odorata (Andrews) Sweet var. gigantea (Crépin) Rehder & E.H.Wilson	4	56, 57	Китай (Юннань)	KF753637, KM352674-KM352676	Chinenses
R. odorata (Andrews) Sweet var. pseudoindica (Lindley) Rehder	1	56	Китай (Юннань)	MK116518	Chinenses
R. omeiensis Rolfe	1	51	Китай (Сычуань)	KM352722	Pimpinellifoliae
R. palustris Marshall	2	11, 46	США (Мэрилэнд, Мичиган)	KM352723, MT302330	Rosa
R. paniculigera (Makino ex Koidz.) Makino ex Momiy.	2	58	Япония	KM352724-KM352725	Synstylae
R. pendulina L.	1	39	Австрия	KM352726	Rosa
R. persica J.F.Gmel.	5	1, 2, 3, 4, 5	Китай (Синьцзян), Узбекистан	KY419918, MK423879, MT279153, MT279188-MT279189	подрод Hulthemia
R. phoenicia Boiss.	1	71	Турция	KM352727	Synstylae
R. porrectidens Chrshan. & Lasebna	1	87	Украина	HQ404956	Gallicanae или Caninae
R. praelucens Bijh.	1	26	Китай (Юннань)	MG450565	подрод Plathyrhodon, или секция Microphyllae
R. prattii Hemsl.	1	35	Китай (Сычуань)	KR105778	Rosa
R. pricei Hayata	3	58, 62	Китай (Тайвань)	KM352729--KM352730, MK613354	Synstylae
R. pygmaea M.Bieb.	61	68, 72, 74, 75, 78, 79, 81, 83, 87, 90	Украина, Россия (Европейская часть, Крым)	HQ404957-HQ404959, KJ886958, KJ886960, KJ886962, KJ886964-KJ886965, MT279078, MT273169-MT273174, MT273196, MT279072-MT279077, MT279091-MT279109, MT279120-MT279139	Gallicanae или Caninae
R. roxburghii Tratt.	4	47, 49	Китай (Гуйчжоу, Сычуань), Япония	KM352695, KM352731, KX768420, KY419960	подрод Plathyrhodon, или секция Microphyllae
R. rubiginosa L.	39	64, 66, 67, 70, 77, 81, 83	Украина, Россия (Европейская часть), Морокко, Венгрия, Германия, Чехия, Черногория	KJ886943-KJ886945, KJ886947, KJ886951, KJ886953-KJ886955, KJ886957, MT302284, MT279079-MT279087, MT279090, MT302258-MT302261, MT302266-MT302277, MT302287, MT302315-MT302316	Caninae/Rubigineae
R. rubiginosa L. x R. villosa L.	2	87	Россия (Европейская часть)	KJ886966, KJ886968	Caninae ´ Vestitae
R. rubus H.Lév. & Vaniot	6	58	Китай (Юннань, Ганьсу, Гуандун, Гуйчжоу, Хунань)	KM352732-KM352733, KM352735-KM352738	Synstylae
R. rugosa Thunb.	12	41	Россия (Приморский край)	MK848167, MK848176, MK848178, MK848180, MK848182, MK848185-MK848187, MK848190-MK848193	Rosa
R. sambucina Koidz.	2	58	Китай (Тайвань)	KM352739-KM352740	Synstylae
R. sancti-andreae Degen & Trautm.	1	12	Венгрия	MT302263	Caninae/Vestitae
R. schmalhauseniana Chrshan.	1	83	Украина	MT279110	Caninae/Caninae
R. sempervirens L.	3	64	Италия	KM352741-KM352743	Synstylae
R. setigera Michx.	1	60	США	KM352744	Synstylae
R. shangchengensis T.C.Ku	2	58, 59	Китай (Хэнань, Аньхой)	KM352745-KM352746	Synstylae
R. sicula Tratt.	5	64, 69, 70	Морокко	MT302279-MT302283	Caninae/Rubigineae
R. soulieana Crép.	5	53, 54, 55	Китай (Юннань, Сычуань, Тибет)	KM352749-KM352753	Synstylae
R. soulieana Crép. var. sungpanensis Rehder	1	53	Китай (Сычуань)	KM352754	Synstylae
R. sp.1	1	14	Узбекистан	MT279150
R. sp.2	1	26	Узбекистан	MT279161
R. spinosissima L.	4	6	Украина, Франция	HQ404992-HQ404994, KM352728	Pimpinellifoliae
R. stylosa Desv.	1	12	Венгрия	MT302265	Caninae/Caninae
R. subcanina (Christ) Vuk.	6	87	Украина	HQ404980-HQ404985	Caninae/Caninae
R. subpomifera Chrshan.	1	83	Украина	MT279112	Caninae/Vestitae
R. tomentosa Sm.	2	64	Украина	HQ404990-HQ404991	Caninae/Vestitae
R. transmorrisonensis Hayata	1	58	Китай (Тайвань)	KM352756	Synstylae
R. turcica Rouy	4	64	Россия (Крым)	MT273159-MT273162	Caninae/Rubigineae
R. uniflorella Buzunova	1	58	Китай (Чжэцзян)	KM352757	Synstylae
R. villosa L.	9	64, 65	Россия (Европейская часть), Венгрия	KJ886942, KJ886946, KJ886948-KJ886950, KJ886952, KJ886956-KJ886957, MT302262	Caninae/Vestitae
R. weisiensis T.T.Yu & T.C.Ku	2	58	Китай (Юннань)	KM352758-KM352759	Synstylae
R. willmottiae Hemsl. var. glandulifera T.T.Yu & T.C.Ku	1	39	Китай (Сычуань)	KM352760	Rosa
R. woodsii Lindl.	5	45	США (Вайоминг, Монтана)	MT302317-MT302320, MT302322	Rosa

Примечание. Жирным выделены номера последовательностей, полученных в ходе настоящего исследования

 

Выделение ДНК, ПЦР и секвенирование

Тотальную геномную ДНК извлекали из высушенных в силикагеле листьев или из листьев гербарных образцов с использованием коммерческого набора NucleoSpin Plant II DNA extraction kit (Macherey-Nagel, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Участок ndhC-trnV амплифицировали с праймерами ndhC (ATTAGAAATGYCCARAAAATATCAT) и trnV(UAC)x2 (GTCTACGGTTCGARTCCGTA) (Shaw et al., 2007). Праймеры были синтезированы и очищены в ПААГ компанией ООО Синтол (Москва, Россия). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в объеме 20 мкл, содержавшем 4 мкл реакционной смеси Ready-to-Use PCR MasterMIX на основе “hot-start” SmarTaq ДНК полимеразы (ООО Диалат, Москва, Россия), 13 мкл деионизированной воды, 3.2 пмоль каждого праймера, и около 1.5–2 нг исследуемой ДНК в амплификаторе MJ Research PTC-220 DNA Engine Dyad Thermal Cycler (БиоРад, США) при следующих условиях: 95 °C-180 с; 95 °C-60 с, 57 °C-40 с, 60 °C-80 с (35 циклов); 57 °C-40 с, 60 °C-80 с (2 цикла). Продукты амплификации проверяли в 1% агарозном геле в 0.5×TBE буфере с окрашиванием бромидом этидия. Очистку продуктов ПЦР проводили переосаждением в 0.125 моль/л растворе ацетата аммония в 70% этаноле. Очищенные продукты ПЦР секвенировали в обоих направлениях с использованием коммерческого набора ABI PRISM © BigDye™ Terminator v. 3. kit (Applied Biosystems, США) и анализировали на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems, США) на базе Института проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН, Центра коллективного пользования “Геном” (Москва, Россия) и ООО Синтол (Москва, Россия). Все секвенированные последовательности были опубликованы в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), номера последовательностей указаны в табл. 2 (Приложение).

Анализ данных

Последовательности ndhC-trnV были выравнены в программе MAFFT v. 7.147b (Katoh et al., 2002, 2013) с использованием алгоритма L–INS-i с последующим ручным редактированием в программе BioEdit v. 7.0.8.0 (Hall, 1999). Последовательности 45 полных пластидных геномов 29 видов Rosa и 10 последовательностей таксонов внешней группы, полученные из GenBank, выравнивали в программе MAFFT с использованием FFT-NS-2 алгоритма выравнивания. Так как выравнивание участка ndhC-trnV содержало многочисленные индели, мы оценили его на содержание неинформативных и сомнительно выравненных участков и провели их удаление в программе BMGE v. 1.12 (Criscuolo, Gribaldo, 2010). Оставшиеся индели были кодированы, как единичные мутационные события (Simmons, Ochoterena, 2000) в программе FastGap v. 1.2 (Borchsenius, 2009) и добавлены в конец выравнивания.

Обработанное таким образом выравнивание анализировали с использованием алгоритма статистической парсимонии, описанного в работе Темплтона с соавт. (Templeton et al., 1992) и реализованного в программе TCS v. 1.21 (Clement et al., 2000). Для установления вероятного корня сети гаплотипов, полученной в программе TCS, мы подготовили выравнивание гаплотипов, содержавшее одну последовательность на гаплотип, и выравнивание видов, содержавшее от одной до нескольких последовательностей на таксон, в зависимости от числа гаплотипов, установленных для каждого вида. Эти выравнивания были проанализированы вместе с последовательностями внешней группы методом максимального правдоподобия в программе raxmlGUI 2.0 beta (Silvestro, Michalak, 2012; Edler et al., 2019), а также методом NeighborNet, реализованным в программе SplitsTree4 (Huson, 1998; Huson, Bryant, 2006). Отдельно методом максимального правдоподобия была проанализирована выборка из 45 полных пластидных геномов, полученных из GenBank. Все анализы были проведены в программе raxmlGUI 2.0 с установками по умолчанию и с использованием модели GTRGAMMA с параметрами, рассчитанными программой. Значения бутстрепа рассчитывались для 100 реплик (опция быстрого бутстрепа).

Для укоренения деревьев и сетей использовали множественную внешнюю группу, включавшую последовательности Rubus occidentalis L. (OK054548), R. arcticus L. (OL891648), R. pedunculosus D. Don (OQ992654), R. biflorus Buch.-Ham. ex Sm. (OQ992653), R. coreanus Miq. (MH992398), R. trifidus Thunb. (MK465682), Hagenia abyssinica J. F. Gmel. (KX008604), Sanguisorba officinalis L. (MF678801), S. tenuifolia Fisch. ex Link (MH513641) и Potentilla micropetala D. Don (KY420021). Таксоны, использованные в качестве внешней группы, отбирались в соответствии с опубликованными филогенетическими деревьями для семейства Rosaceae (Potter et al., 2002; Eriksson et al., 2003; Zhang et al., 2017).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ межгенного спейсера ndhC-trnV методом статистической парсимонии

Последовательности межгенного спейсера ndhC-trnV после удаления плохо прочитавшихся участков с обоих концов варьировали по длине от 383 до 475 п. н. Итоговое выравнивание участка ndhC-trnV составило 588 позиций. После обрезки сомнительно выравненных участков в программе BMGE и кодирования инделей, как единичных мутационных событий, окончательная длина выравнивания составила 583 позиции. Анализ методом статистической парсимонии в программе TCS позволил объединить идентичные последовательности в 95 гаплотипов. Программа рассчитала максимально возможное число мутационных шагов при 95% вероятности парсимонического решения (лимит парсимонии) равным 10 и объединила все гаплотипы в одну сеть. Включить в анализ какие-либо последовательности внешней группы не удалось из-за значительного превышения лимита парсимонии.

Сеть содержит несколько замкнутых петель, вызванных гомоплазией. Часть этих петель была нами разрешена с использованием правил, описанных в работе Крэндэла и Темплтона (Crandall, Templeton, 1993). Несколько петель остались не разрешенными, что, однако, не помешало определению отношений большинства гаплотипов (рис. 1). Мы следуем терминологии, изложенной в работе Крэндэла и Темплтона (Crandall, Templeton, 1993), в определении гаплотипов, имеющих единственную связь с другим гаплотипом, как концевых (tip), а имеющих две или более связей с другими гаплотипами, как внутренних (interior) гаплотипов сети. Ниже мы описываем полученную сеть в терминах гаплогрупп (групп родственных гаплотипов) от I до IX, определяемых на основании их положения в сети, а также числу и длине связей между гаплотипами, объединяемыми в такую гаплогруппу. Во многих случаях такие гаплогруппы приблизительно соответствуют таксономическим секциям рода Rosa с целым рядом примечательных исключений.

 

Рисунок 1. Сеть гаплотипов ndhC-trnV рода Rosa, построенная методом статистической парсимонии. Гаплогруппы обозначены римскими цифрами и оконтурены. Размер кружков коррелирует с числом последовательностей, объединенных в один гаплотип. Черные точки обозначают отсутствующие промежуточные гаплотипы, не обнаруженные среди проанализированных образцов. Разрешенные замкнутые петли обозначены точечным пунктиром. Цвета гаплотипов и обозначения в легенде (в верхнем левом углу) соответствуют таксономическим секциям рода Rosa. Соответствие номеров гаплотипов видам и секциям приведено ниже (подробнее см. табл. 2 в Приложении):

I: 1–5: subgen. Hulthemia: 1–5 R. persica;

II–IX: 6–95: subgen. Rosa:

II: 6+26–37: sect. Pimpinellifoliae: 6 R. spinosissima; 26, 29–30, 32–34, 36 R. kokanica; 27 R. koreana; 37 R. graciliflora + sect. Rosa: 26 R. macrophylla; 31 R. acicularis; 35 R. prattii; 37 R. moyesii + sect. Microphyllae: 26 R. praelucens + sect. Synstylae: 28 R. glomerata

III: 14–25: sect. Pimpinellifoliae: 14–25 R. kokanica

IV: 7–13: sect. Rosa: 7 R. caudata, R. davidii; 9 R. multibracteata; 11 R. palustris; 12 R. acicularis, R. nutkana; 13 R. acicularis + sect. Synstylae: 7 R. abyssinica; 8 R. glomerata; 10 R. multiflora, R. multiflora var. cathayensis + sect. Caninae: 12 R. canina, R. stylosa, R. sancti-andreae

V: 38–46: sect. Rosa: 38 R. cinnamomea; 39 R. pendulina, R. willmottiae var. glandulifera, R. fedtschenkoana; 40 R. fedtschenkoana; 41 R. amblyotis, R. cinnamomea, R. rugosa, R. davurica; 42 R. davurica; 43–44 R. cinnamomea; 45 R. arkansana, R. woodsii; 46 R. palustris

VI: 47–52: sect. Microphyllae: 47, 49 R. roxburghii; + sect. Laevigatae: 48 R. laevigata + sect.Banksianae: 50 R. banksiae; 52 R. cymosa + sect. Pimpinellifoliae: 51 R. omeiensis

VII: 53–63: sect. Synstylae: 53 R. deqenensis, R. soulieana, R. soulieana var. sungpanensis; 54 R. derongensis, R. duplicata, R. lichiangensis, R. soulieana; 58 R. anemoniflora, R. brunonii, R. multiflora, R. multiflora var. cathayensis, R. filipes, R. fujisanensis, R. helenae, R. henryi, R. kwangtungensis, R. lasiosepala, R. longicuspis, R. lucieae, R. maximowicziana, R. paniculigera, R. pricei, R. rubus, R. sambucina, R. shangchengensis, R. longicuspis var. sinowilsonii, R. transmorrisonensis, R. uniflorella, R. weisiensis; 59 R. shangchengensis; 60 R. setigera; 62 R. pricei + sect. Chinenses: 56 R. odorata, R. odorata var. gigantea, R. odorata var. pseudoindica; 57 R. odorata var. gigantea; 58 R. chinensis var. spontanea, R. chinensis cult. ‘Old Blush’; 61, 63 R. lucidissima + sect. Synstylae × sect. Rosa: 58 R. × archipelagica

VIII: 64–70: sect. Caninae: 64 R. tomentosa, R. villosa, R. rubiginosa, R. elliptica, R. marginata, R. turcica, R. glauca, R. sicula, R. agrestis, R. gremlii, R. hungarica; 65 R. villosa; 66 R. rubiginosa; 67 R. rubiginosa, R. agrestis, R. micrantha; 68 R. × canina, R. pygmaea; 69 R. sicula; 70 R. rubiginosa, R. sicula, R. canina, R. gremlii + sect. Synstylae: 64 R. sempervirens

IX: 71–95: sect. Caninae: 72 R. pygmaea, R. corymbifera; 73–75, 78–79 R. pygmaea; 77 R. rubiginosa; 80 R. canina; 81 R. canina, R. pygmaea, R. rubiginosa, R. chomutoviensis; 82 R. pygmaea; 83 R. canina, R. pygmaea, R. rubiginosa, R. chomutoviensis, R. schmalhauseniana, R. subpomifera; 84–85 R. canina; 86 R. marginata; 87 R. pygmaea, R. canina, R. subcanina, R. corymbifera, R. caryophyllacea, R. caesia, R. montana, R. cuneicarpa; 88 R. glauca; 89 R. corymbifera; 90 R. pygmaea; 91–92 R. arabica; 93 R. agrestis; 94–95 R. canina + sect. Gallicanae: 71, 76 R. gallica + sect. Synstylae: 71 R. arvensis, R. phoenicia

 

Гаплогруппа I представлена гаплотипами с 1 по 5 относящимися к R. persica (подрод Hulthemia) и находящимися на расстоянии от двух до четырех мутационных шагов друг от друга и на расстоянии девяти мутационных шагов от ближайшего гаплотипа 6 гаплогруппы II. Гаплогруппа I занимает наиболее изолированное положение в сети. Гаплотип 6 принадлежит ко II гаплогруппе и представлен последовательностями R. spinosissima из двух местонахождений в Восточных Карпатах и одного во Франции. Во второй гаплогруппе представлены преимущественно гаплотипы видов секции Pimpinellifoliae с несколькими исключениями. Это R. macrophylla (секция Rosa) и R. praelucens (секция Microphyllae) для которых выявлен тот же внутренний гаплотип 26, что и для ряда образцов R. kokanica из нескольких местонахождений в Узбекистане; R. glomerata (секция Synstylae) представленная двумя образцами, обладающими одним и тем же концевым гаплотипом 28; R. acicularis, R. prattii и R. moyesii (секция Rosa) представленные концевыми гаплотипами 31, 35 и 37, соответственно. Гаплогруппа II занимает центральное положение в сети и прямо или косвенно оказывается анцестральной для всех остальных групп.

Гаплогруппа III также представляет секцию Pimpinellifoliae и содержит гаплотипы от 14 до 25, выявленные у образцов R. kokanica из единственного местонахождения в Узбекистане.

Гаплогруппа IV представлена гаплотипами от 7 до 13, большей частью принадлежащими видам секций Rosa и Synstylae. Гаплотип 12 оказался общим для образцов, относящихся к секциям Rosa и Caninae. Два гаплотипа (11 и 12) североамериканских представителей секции Rosa (R. palustris и R. nutkana) также принадлежат к этой гаплогруппе.

Гаплогруппа V представлена гаплотипами от 38 до 46, выявленными у оставшихся евроазиатских и североамериканских представителей секции Rosa. Гаплогруппа VI представляет собой филогенетическую линию с многочисленными отсутствующими в выборке промежуточными гаплотипами, к которой относятся гаплотипы представителей олиготипных секций Microphyllae, Laevigatae и Banksianae. Как видно на рис. 1, при первичном анализе эта линия образовала обширную замкнутую петлю, вызванную гомоплазией, разорванную нами согласно правилам, изложенным в работе Крэндэла и Темплтона (Crandall, Templeton, 1993). Гаплотип 51 удален от этой группы на расстояние в шесть мутационных шагов и представляет собой единственный образец R. omeiensis (секция Pimpinellifoliae). Мы не включили его в состав шестой гаплогруппы, так как его положение изменчиво при разных способах анализа данных (см. ниже).

Базальный гаплотип этой гаплогруппы (47), представленный тремя образцами R. roxburghii, является анцестральным для этой филогенетической линии, а также для гаплогруппы VII, представляющей большинство последовательностей секции Synstylae и все последовательности секции Chinenses. Большинство образцов, вошедших в эту гаплогруппу, относятся к разным видам обеих секций, обладающим одним и тем же внутренним гаплотипом 58.

Гаплогруппа VII и гаплотип 58, в частности, представляются анцестральными для двух филогенетических линий, представленных гаплогруппами VIII и IX. Эти гаплогруппы представлены близкородственными гаплотипами, различающимися между собой дистанциями в один мутационный шаг. К ним относится подавляющее большинство образцов видов секции Caninae. Гаплогруппа VIII представлена гаплотипами от 64 до 70, представляющих виды секции Caninae (большинство представителей подсекций Rubigineae, Rubrifoliae, Trachyphyllae и Vestitae, а также несколько последовательностей видов подсекции Caninae). Базальный для гаплогруппы внутренний гаплотип 64 встречается также у R. sempervirens, западно-евразиатского представителя секции Synstylae. К гаплогруппе IX относятся гаплотипы от 71 до 95, представляющие оставшиеся виды секции Caninae (подсекция Caninae и меньшая часть последовательностей представителей подсекций Rubigineae, Rubrifoliae, Trachyphyllae и Vestitae) и виды секции Gallicanae. К ее базальному внутреннему гаплотипу 71 относится большинство последовательностей R. gallica, а также последовательности двух западно-евразиатских видов секции Synstylae – R. phoenicia и R. arvensis.

Географическое распространение гаплогрупп

Картирование географического распространения гаплогрупп (с некоторыми экстраполяциями, основанными на знании ареалов ряда таксонов) выявляет неслучайный паттерн их распространения (рис. 2).

 

Рисунок 2. Географическое распространение основных гаплогрупп в роде Rosa. Цвета соответствуют номерам гаплогрупп на рис. 1 и показаны на легенде в верхнем правом углу.

 

Ареал гаплогруппы I (только R. persica) расположен в Средней Азии и северном Иране, достигая на востоке западного Китая. Ареал гаплогруппы II, представленной в основном членами секции Pimpinellifoliae, имеет центр в центральном Китае, и прерывистое распространение с очагами, разбросанными на территории СВ Китая, Российского Дальнего Востока, Средней Азии и Европы. Большинство находок приходится на китайскую провинцию Сычуань. Однако центральный и наиболее широко представленный в нашей выборке внутренний гаплотип 26 практически целиком приурочен к горам Узбекистана, с одной находкой в Синцзяне (Китай). Два других гаплотипа были встречены во Внутренней Монголии (северный Китай) и на юге Российского Дальнего Востока. Распространение гаплогруппы III, как уже упоминалось выше, ограничено единственным местонахождением R. kokanica в Узбекистане (Приложение табл. 2). Распространение гаплотипов группы IV охватывает умеренную зону Евразии и Северной Америки, достигая Аравийского полуострова и северо-восточной Африки на юге. Оно, однако, неравномерно, и большая часть находок происходит из юго-восточного Китая (провинции Сычуань, Чунцин, Гуйчжоу и Аньхой). Распространение данной гаплогруппы в Северной Америке не вполне ясно, так как в нашей выборке присутствуют только два образца с атлантического и тихоокеанского побережий. Гаплогруппа V является наиболее широко распространенной, практически по всей северной Евразии и Северной Америке. Ее ареал состоит из нескольких отдельных участков в северной Евразии с наиболее удаленным южным фрагментом в Китае в провинции Сычуань. Распространение гаплогруппы VII ограничено юго-восточным Китаем, с центром в провинциях Юннань и Сычуань. Только гаплотип 49 распространен на юге Японии (R. roxburghii var. hirtula). Гаплотипы группы VII распространены по всему южному и центральному Китаю, достигая северного Пакистана на западе, южной Японии на востоке, и юга Российского Дальнего Востока на северо-востоке. Эта гаплогруппа обладает дизъюнктивным ареалом с оторванным от основной его части фрагментом в юго-восточной части Северной Америки (R. setigera). Гаплогруппа VIII приурочена в своем распространении к Европе, в юго-западной части ареала достигая Атласских гор в северной Африке. Ареал гаплогруппы IX в основном совпадает с предыдущей гаплогруппой, однако он шире, глубже продвигаясь на север, достигая Средней Азии на востоке и Синайского полуострова на юго-востоке.

Анализ гаплотипов ndhC-trnV методом NeighborNet

Так как внешнюю группу не удалось включить в сеть гаплотипов ndhC-trnV для рода Rosa из-за превышения рассчитанного программой TCS предельного числа мутационных шагов допускавших парсимоническое решение, для укоренения сети потребовалось определение корневого гаплотипа. Анализ видового выравнивания в raxmlGUI дал плохо разрешенное дерево с низкой или нулевой поддержкой большинства ветвей (не показано). Анализ выравнивания гаплотипов в SplitsTree4 с помощью алгоритма NeighborNet построил сплитграф на котором гаплотипы 1–5 R. persica оказались ближайшими к внешней группе (рис. 3). Это позволило нам укоренить сеть гаплотипов, построенную в TCS, на гаплогруппу I, представленную гаплотипами R. persica (рис. 1).

 

Рисунок 3. Сплитграф NeighborNet гаплотипов ndhC-trnV рода Rosa. Номера гаплотипов приведены в табл. 2 Приложения. Римские цифры обозначают гаплогруппы, как на рис. 1. Гаплогруппа I выделена закрашенным эллипсом, как корневая. Гаплотип 51 (R. omeiensis) выделен полужирным шрифтом, как занимающий иное положение в сети гаплотипов TCS.

 

Хотя этот анализ был проведен нами, главным образом, с целью укоренения сети, следует отметить, что он выявил примерно те же группы гаплотипов, что и анализ методом статистической парсимонии (рис. 3).

На сплитграфе выделяются три основные группы гаплотипов. Наиболее рано дивергировавшая группа гаплотипов образована плохо разрешенным пучком ветвей, соответствующим гаплогруппам с I по V и представляющих, главным образом, последовательности образцов видов секций Pimpinellifoliae и Rosa. Среди них, гаплогруппа I, представляющая подрод Hulthemia, выглядит расположенной ближе к внешней группе, чем все остальные. Гаплотип 51, располагающийся на длинной ветви, соединенной с гаплогруппой VI в сети TCS, на сплитграфе оказался среди ветвей гаплогрупп II и IV. Терминальная группа объединяет гаплотипы групп с VII по IX, представляющих последовательности образцов видов секций Synstylae, Chinenses, Gallicanae и Caninae и расположена дальше всех от внешней группы. Гаплогруппа VI, представляющая последовательности видов секций Microphyllae, Banksianae и Laevigatae расположена между ними.

Анализ полных последовательностей пластидных геномов

Для независимой проверки наших результатов мы проанализировали выравнивание 45 полных пластидных геномов шиповников. Полные пластидные геномы 45 образцов Rosa принадлежали к 29 видам и были получены из базы данных GenBank вместе с 10 полными геномами внешней группы. Последовательности видов Rosa варьировали по длине от 156333 до 157391 п. н. Выравнивание было обрезано в программе BMGE для удаления ненадежно выравненных участков и в окончательном виде составило 155119 позиций. Анализ методом максимального правдоподобия в программе raxmlGUI построил полностью разрешенное дерево с хорошими поддержками ветвей (рис. 4), в котором клада R. persica (подрод Hulthemia) оказалась сестринской по отношению ко всем остальным представителям рода Rosa, за исключением последовательностей R. xanthina, R. sericea и R. omeiensis. Последние образовали наиболее рано дивергировавшую кладу, в нашем анализе гаплотипов ndhC-trnV представленную только гаплотипом 51 R. omeiensis. Положение на дереве (рис. 4) пластомов R. minutifolia MT755634 в кладе, объединяющей представителей секций Rosa и Pimpinellifoliae, и R. rugosa MN661138 в кладе, объединяющей представителей секций Synstylae и Chinenses, вероятно, объясняется неверной таксономической идентификацией исходного материала (Zhao, Gao, 2020; Yin et al., 2020).

 

Рисунок 4. Филогенетическое дерево рода Rosa, построенное методом максимального правдоподобия по данным полных последовательностей пластидных геномов. Цвета и римские цифры справа обозначают группы гаплотипов и соответствуют гаплогруппам ndhC-trnV на рис. 1. Бутстреп поддержки выше 50% показаны над ветвями. Ветви, выделенные жирным, указывают на бутстреп поддержки 100%. Цифра 51 справа от первой дивергирующей клады соответствует номеру гаплотипа R. omeiensis в сети гаплотипов на рис. 1, 3. Жирным шрифтом выделены названия неверно таксономически идентифицированных образцов.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Укоренение сети

Процедура укоренения критически важна в филогенетических исследованиях, так как топология филогенетического дерева полностью зависит от положения корня (Kinene et al., 2016). Неукорененное дерево или сеть может лишь отграничить отдельные клады, но не может определить их эволюционные отношения. На наиболее хорошо разрешенном дереве семейства Rosaceae (Zhang et al., 2017) род Rosa является сестринским для клады Potentilleae, включающей роды Potentilla, Alchemilla, Fragaria, Chamaerhodos, Drymocallis и Sibbaldia. Эта клада, в свою очередь, является сестринской по отношению к кладе Agrimonieae. Клада Rubus является сестринской по отношению ко всей этой группе. Мы в нашем исследовании гаплотипов ndhC-trnV использовали множественную внешнюю группу и установили, что при анализе методом NeighborNet ближайшей к ней оказалась клада, представленная гаплотипами R. persica (рис. 3). Проверка этого результата на выборке 45 полных пластидных геномов, в которой были представлены большинство секций рода Rosa, подтвердила этот вывод (рис. 4). В нашем анализе, так же как в других филогенетических реконструкциях, основанных на анализе полных пластидных геномов (Cui et al., 2022; Zhang et al., 2022), клада R. persica оказалась сестринской по отношению к большинству других групп Rosa, хотя и не наиболее рано дивергировавшей. В работе Жанга с соавт. (Zhang et al., 2022) наиболее рано дивергировавшей оказалась клада R. minutifolia (секция Minutifoliae), следующей рано дивергировавшей кладой, как и в нашем анализе, оказалась клада R. xanthina – R. omeiensis, и только после нее дивергировала R. persica. Этот результат отличается от реконструкции Фужере-Данезан с соавт. (Fougère-Danezan et al., 2015), у которых при анализе пластидных данных клада R. xanthina – R. omeiensis оказалась поздно дивергировавшей и включенной в их большую кладу ‘C and allies clade’. Тем не менее, анализ разнообразных топологий деревьев, построенных как по отдельным пластидным маркерам, так и по полным пластомам в цитированных выше работах убеждает в правильности укоренения нашей сети на гаплогруппу I.

Основные таксономические группы шиповников

Таким образом, R. persica и, вероятно, также североамериканские R. minutifolia и R. stellata (секция Minutifoliae: не анализировалась в нашем исследовании), могут представлять собой наиболее рано дивергировавших представителей рода Rosa. Их родство было реконструировано в двух филогенетических исследованиях рода (Wissemann, Ritz, 2005; Fougère-Danezan et al., 2015). Мы полагаем, что эти виды могут быть единственными сохранившимися до наших дней потомками древней и в настоящее время практически вымершей группы шиповников, широко распространенной в северном полушарии в олигоцене (Becker, 1963; Kvaček, Walther, 2004; Kellner et al., 2012). Хотя они морфологически не схожи друг с другом и ранее помещались в два разных подрода, Hulthemia и Hesperhodos, соответственно, у них все же есть ряд сходных черт. Гипантии у всех трех видов обладают необычно широкими отверстиями (до 4–5 мм) и снаружи покрыты длинными острыми щетинками. У видов из других клад гипантии гораздо более закрытые, с отверстиями, не превышающими 2–3 мм в диаметре. Исключение, которое мы обсуждаем ниже, составляет только R. roxburghii.

Гаплотип 6 (R. spinosissima) является корневым для двух гаплогрупп, или филогенетических линий III и IV. Линия III в нашем исследовании представлена исключительно гаплотипами R. kokanica, желтоцветкового вида из Средней Азии. Необычное гаплотипическое разнообразие этого вида, представленного 12 гаплотипами, заслуживает специального исследования. Мы предполагаем, что оно могло возникнуть вследствие длительной изоляции популяций этого вида в предгорьях Тань-Шаня во время плейстоценовых оледенений. Линия, или гаплогруппа, IV представлена 7 гаплотипами видов, относящихся к секциям Rosa, Synstylae и Caninae, распространенных в разных частях обширного ареала рода, а также большим числом промежуточных гаплотипов отсутствующих в выборке. Вероятно, это остатки какой-то древней группы гаплотипов, большая часть которой в настоящее время вымерла, сохранившиеся отчасти вследствие гибридизации.

Таким образом, в нашем исследовании гаплотип 6 оказывается базальным по отношению к гаплогруппам III и IV и корневым для гаплогруппы II, отличаясь единственной мутацией от ее центрального и наиболее широко распространенного гаплотипа 26. Последний занимает центральное положение не только в своей гаплогруппе, но и во всей сети. Фактически, он является корневым для двух основных филогенетических линий Rosa, представленных, с одной стороны, гаплогруппой V, объединяющей большинство представителей секции Rosa, а с другой – всеми оставшимися гаплогруппами с VI по IX, объединяющих представителей секций Microphyllae, Banksianae, Laevigatae, Synstylae, Gallicanae и Caninae.

Последовательности представителей секции Pimpinellifoliae представлены только в группах II и III, в то время как основная масса последовательностей видов секции Rosa принадлежат группам VI и V. Тем не менее, гаплотипы нескольких видов секции Rosa, таких как R. prattii, R. moyesii, R. acicularis и R. macrophylla, принадлежат к гаплогруппе II. Это может быть объяснено как неполной сортировкой филогенетических линий, как в случае R. macrophylla (внутренний гаплотип 26), так и гибридизацией или ошибочной секционной идентификацией в случае трех других видов (концевые гаплотипы 31, 35, 37). В частности, R. acicularis в нашей сети представлена неродственными или отдаленно родственными гаплотипами 12, 13, 31, что можно объяснить гибридизацией и вымиранием большей части гаплотипов этого циркумбореального высокополиплоидного вида в ледниковое время, который заслуживает специального исследования на адекватно большем материале. Присутствие внутреннего гаплотипа 26 у R. praelucens (секция Microphyllae), другого высокополиплоидного (декаплоидного: 2n = 10x = 70; Jian et al., 2010) вида эндемичного для китайской провинции Юннань, вероятнее всего может быть связано с гибридизацией, возможно, неоднократной, с видами секций Rosa и/или Pimpinellifoliae (Fougère-Danezan et al., 2015). Морфологически этот вид очень сходен с диплоидной R. roxburghii, однако на филогенетических деревьях, построенных по пластидным маркерам, регулярно оказывается в составе клады, общей с видами секции Rosa (Fougère-Danezan et al., 2015; Cui et al., 2022). Концевые гаплотипы 8, 10, 28, представленные у видов секции Synstylae, также вероятнее всего присутствуют в гаплогруппах II и IV в результате событий гибридизации видов этой секции с представителями секций Pimpinellifoliae и Rosa. Особо следует отметить нестабильное положение в сети и на сплитграфе гаплотипа 51, представленного у R. omeiensis. В нашем исследовании это была единственная последовательность представителя китайских видов секции Pimpinellifoliae, к которым относятся также R. sericea и R. xanthina. При анализе полных пластидных геномов эта группа часто оказывается наиболее рано дивергировавшей. Все это говорит о неоднородности секции Pimpinellifoliae, включающей в себя, вероятно, различных потомков исходной группы шиповников, морфологическое сходство которых может быть обусловлено общими плезиоморфиями.

Гаплогруппы с VII по IX объединяют последовательности видов секций Synstylae, Chinenses, Gallicanae и Caninae. Эти гаплогруппы, вероятно, произошли от гаплогруппы II, занимающей центральное положение в нашей сети гаплотипов. Гаплогруппа VI расположена между ними и, вероятно, включает остатки в настоящее время почти вымершей группы шиповников, промежуточной между секциями Pimpinellifoliae и Synstylae. Отношения между гаплотипами этой группы менее определенны из-за присутствия множественных промежуточных гаплотипов, отсутствующих в выборке. Тем не менее, в соответствии с этими результатами, R. roxburghii (секция Microphyllae, гаплотип 47) представляется анцестральной для видов секций Banksianae и Laevigatae. Эти виды также обладают широко раскрытыми гипантиями с большим отверстием, признаком примитивным с морфологической точки зрения.

Гаплогруппа VII включает большинство видов секции Synstylae и все виды секции Chinenses. Последняя отличается от первой главным образом свободными столбиками: у видов секции Synstylae столбики, сросшиеся в общую колонку. Хотя у видов этой секции они и свободны, однако далеко выставляются из узкого отверстия гипантия, сильно напоминая этой чертой членов секции Synstylae. Все образцы R. chinensis обладают внутренним гаплотипом 58, общим с большинством видов секции Synstylae; R. odorata представлена концевыми гаплотипами 56 и 57, а R. lucidissima – концевыми гаплотипами 61 и 63, все из которых являются производными от гаплотипа 58. Таким образом, секция Chinenses не образует монофилетической группы и, вероятно, должна рассматриваться в рамках секции Synstylae.

Гаплотипы секции Caninae образуют две отчетливо различные филогенетические линии (гаплогруппы VIII и IX) производные от гаплотипа 58, т. е. от секции Synstylae. В обоих случаях базальные внутренние гаплотипы 64 и 71 этой секции являются общими также и для западно-евразийских видов секции Synstylae. В случае гаплогруппы VIII это R. sempervirens, распространенная в Средиземноморье. В случае гаплогруппы IX это европейская R. arvensis и западно-азиатская R. phoenicia, обладающие гаплотипом 71, общим также и для R. gallica из секции Gallicanae. Это подтверждает предшествующие результаты других авторов (Fougère-Danezan et al., 2015; Zhu et al., 2015), у которых западно-азиатские и европейские виды секции Synstylae также оказались в тех же кладах, что и виды секции Caninae. Тот факт, что западные виды секции Synstylae обладают базальными внутренними гаплотипами, принадлежащими к двум ветвям секции Caninae делает их или их непосредственных предков вероятными анценстральными видами этой секции. Таким образом, характерный для секции Caninae специфический тип гетерогамного мейоза независимо возникал в ходе эволюции этой группы по крайней мере дважды. Этот результат подтверждается также детальными цитогенетическими исследованиями нескольких западноевропейских представителей секции Caninae (Herklotz et al., 2018; Lunerová et al., 2020).

Особенности эволюции рода Rosa

Результаты проведенного нами анализа выявляют в широком смысле парафилетические отношения между основными крупными таксономическими группами шиповников: группа Synstylae–Caninae (гаплогруппы с VII по IX), так же, как и Rosa (гаплогруппы III и V) представляет собой потомка группы Pimpinellifoliae (гаплогруппы II и IV).

Эти заключения подтверждаются географическим распространением гаплогрупп и таксономических секций (рис. 2). Гаплогруппа I и виды секции Minutifoliae распространены дизъюнктивно в Средней Азии и на западе Северной Америки, соответственно. Мы полагаем, что подобный характер ареала этой группы подтверждает ее реликтовую природу. В ископаемом состоянии шиповники встречаются с верхнего эоцена, причем в олигоцене представители рода присутствуют в многочисленных местонахождениях как в Азии, так и в Европе и Северной Америке (Becker, 1963; Kvaček, Walther, 2004; Kellner et al., 2012). Однако остатки представлены, главным образом, отдельными листочками сложных листьев, шипами, и в единичных случаях цветками, плодами или сложными листьями, что не позволяет идентифицировать их точнее, чем до уровня рода. Молекулярное датирование филогенетического дерева в работе Фужере-Данезан с соавторами (Fougère-Danezan et al., 2015) не противоречит этим данным. Согласно ему, диверсификация главных клад произошла в среднем–верхнем олигоцене. В это же время происходит дивергенция клады R. minutifolia – R. persica. Диверсификация современных секций произошла в миоцене – плиоцене. Таким образом, олигоценовые находки не могут быть сопоставлены с современными секциями, а рано дивергировавшие R. minutifolia и R. persica, вероятно, представляют собой потомков вымершей первичной группы роз. Гаплогруппы со II по V, представленные видами таксономических секций Pimpinellifoliae и Rosa, широко распространены в Евразии и Северной Америке. Хотя виды первой из секций в Северной Америке отсутствуют, в Евразии их ареал обширен, хотя и тоже имеет прерывистый характер. Мы полагаем, что такой характер ареала указывает на длительное присутствие представителей этой секции на данной территории.

Географическое распространение гаплогрупп с VII по IX, представленных видами секций Synstylae, Chinenses, Gallicanae и Caninae, напротив, является непрерывным (за исключением североамериканской R. setigera из секции Synstylae) и менее широким. Ареал секции Synstylae ограничен преимущественно южным и восточным Китаем с несколькими видами, достигшими в своем распространении западной Азии и Европы. Ареал секции Caninae ограничен Европой и Западной и Средней Азией. Олиготипные секции Chinenses и Gallicanae обладают небольшими ареалами, включенными в более обширные ареалы соответствующих гаплогрупп. Подобный тип ареалов указывает на относительную молодость перечисленных секций, возникновение которых согласно результатам молекулярного датирования не превышает плиоценого времени, т. е. 5–6 млн лет назад (Fougère-Danezan et al., 2015).

Таким образом, результаты нашего исследования приводят нас к заключению, что в пересмотре нуждается не система рода Rosa, как таковая, которая достаточно адекватно отражает существующие группы родства, а таксономическое положение отдельных видов. Наименее изученная в таксономическом и филогенетическом отношении секция Pimpinellifoliae представляется нам анцестральной для всех остальных секций рода, за исключением потомков наиболее древней и практически вымершей группы, представленной в настоящее время двумя североамериканскими (виды секции Minutifoliae) и одним цетральноазиатским (R. persica) видом. Парафилия большинства групп связана с их недавним возникновением и быстрой диверсификацией, сопровождавшимися активной гибридизацией между молодыми видами, вследствие чего предковые группы не вымерли и существуют в настоящее время наряду со своими потомками.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование было выполнено в рамках государственного задания Главного ботанического сада им. Н. В. Цицина РАН № 122042700002-6 и, отчасти, поддержано грантами РФФИ № 16-04-01390 и 19-04-01308. Авторы также благодарны Министерству науки и высшего образования РФ за финансовую поддержку Центра коллективного пользования “Гербарий ГБС РАН”, грант № 075-15-2021-678.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарны следующим коллегам за помощь в сборе или получении образцов из различных природных местонахождений: К. Тоджибаеву (Ботанический институт НАН, Узбекистан), Г. Шрамко (Университет Дебрецена, Венгрия), Е. А. Чубарь (Национальный научный центр морской биологии, Россия), Ю. К. Виноградовой (ГБС РАН, Россия), В. Херклотцу (Шенкенбергский естественноисторический музей, Германия), В. М. Остапко (Донецкий ботанический сад, ДНР), А. А. Кагало (Институт экологии Карпат НАН, Украина), И. Бартишу (Институт ботаники, Чехия), М. Г. Пименову (МГУ им. М. В. Ломоносова, Россия), А. Элькорди (Сохагский университет, Египет), а также кураторам Гербариев MHA, LE, KW, B, BP, DE за возможность изучения и деструктивного отбора материала.

Об авторах

И. А. Шанцер

Главный ботанический сад им. Н. В. Цицина РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ischanzer@gmail.com
Россия, 127276, Москва, Ботаническая ул., д. 4

А. В. Федорова

Главный ботанический сад им. Н. В. Цицина РАН

Email: ischanzer@gmail.com
Россия, 127276, Москва, Ботаническая ул., д. 4

И. Г. Мещерский

Институт проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН

Email: ischanzer@gmail.com
Россия, 119071, Москва, Ленинский пр., д. 33

Список литературы

Дополнительные файлы