Anakinra Promotes M2 Microglia Activation during the Latent Phase of the Lithium-Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Эпилептогенез – это процесс, приводящий к повышению возбудимости нейронной сети и возникновению спонтанных эпилептических припадков в результате кас- када молекулярных и структурных изменений в головном мозге [1]. Точные механизмы эпилептогенеза до конца не определены, однако в последние годы активно изучается участие глиальных клеток в этом процессе [1, 2]. Реактивация астроцитов и микроглии, заключающаяся в морфологическом, молекулярном или функциональном ремоделировании клеток, часто описывается при эпилептогенезе [3, 4]. Глиальные клетки вовлечены как в процессы воспаления, так и в контроль возбудимости нейронов. Однако, несмотря на появление все большего количества данных об их роли в патофизиологии эпилептических припадков, конкретные механизмы участия астро- и микроглии неясны [5].

По аналогии с периферическими макрофагами, для астро- и микроглии условно выделяют два полярных состояния активации при реализации воспалительной реакции, а процесс перехода между этими состояниями называют поляризацией. А1/M1 – нейротоксический, или провоспалительный, сопровождается повышением экспрессии провоспалительных генов (Il1b, Tnfa, Il6) и понижением экспрессии генов белков, участвующих в транспорте и метаболизме глутамата (Slc1a2, Slc1a3, Glul), что может усугублять течение эпилепсии и возможных постсудорожных нервно-психических расстройств. A2/M2 – нейрозащитный, или противовоспалительный – активирует нейротрофические (Tgfb1) или противовоспалительные (Il1rn) гены, которые способствуют выживанию и росту нейронов и поддерживают репаративные процессы в мозге [6, 7]. Для каждого из полярных состояний существуют специфические маркерные гены, по высокой продукции которых можно говорить о функциональном состоянии клеток. Так, повышенная продукция мРНК Lcn2 и Gbp2 считается маркером провоспалительной активации астроцитов, а увеличенная экспрессия генов S100a10, Ptx3 – маркер состояний A2 [7]. Для микроглии гиперэкспрессия гена Nos2 является маркером провоспалительной активации, а маркером противовоспалительного состояния M2 считается повышенная экспрессия гена Arg1 [8–10].

Дисфункциональное и патологическое ремоделирование астроцитов может способствовать повышению возбудимости нейронов и развитию эпилепсии после эпилептического статуса [11, 12]. В частности, астроциты участвуют в регуляции активности глутаматергической медиаторной системы, гиперактивность которой лежит в основе многих неврологических заболеваний, в том числе эпилепсии [13, 14]. Астроциты экспрессируют переносчики возбуждающих аминокислот с высокой аффинностью к глутамату EAAT1 и EAAT2, которые осуществляют обратный захват глутамата, высвобождаемого пресинапсом [15, 16]. Поглощаемый астроцитами глутамат может быть перераспределен между соседними астроцитами с помощью щелевых контактов, образованных коннексинами Cx43 и Cx30, соединяясь через которые, астроциты образуют в мозге подобие синцития, что обеспечивает быстрое перераспределение ионов, малых молекул и распространение кальциевых волн [17]. В астроцитах с помощью глутаминсинтетазы (GS) происходит синтез глутамина из глутамата. Глутамат-глутаминовый цикл необходим для нормального функционирования глутаматергического синапса [18]. Нарушение работы каждого из перечисленных звеньев может приводить к патологическим изменениям и развитию эпилепсии. Так, инактивация GS приводит к развитию судорог или нейродегенерации вследствие эксайтотоксичности [18]. Во время судорог разобщение каналов, образованных Cx43, приводит к появлению полуканалов, в связи с чем повышается выделение астроцитами глутамата, АТФ и других соединений, способствующих повышению возбудимости нейронов. В экспериментальных моделях эпилепсии и у пациентов с эпилепсией было обнаружено повышение экспрессии астроцитарных коннексинов, а введение их блокаторов облегчало судорожную активность [19]. В моделях эпилепсии также обнаружено снижение экспрессии EAAT1 и EAAT2 [20]. Ранее в наших исследованиях было показано, что продукция белка EAAT2 снижается через 7 дней после эпилептического статуса, вызванного введением пилокарпина [21]. Все указанные изменения рассматриваются как возможные механизмы эпилептогенеза [22].

Одним из неотъемлемых механизмов эпилептогенеза считается развитие нейро- воспаления, способствующего повышению возбудимости нейронов [23]. Центральным механизмом регуляции нейровоспаления является путь IL-1β, опосредующий мощный воспалительный ответ. В моделях постстатусной эпилепсии этот путь активируется в числе первых в областях мозга, участвующих в генерации и распространении судорог [24]. Показано, что эпилептический статус способствует транскрипционной активации элементов пути NLRP3 – одного из основных регуляторов высвобождения активной формы IL-1β [25]. В свою очередь, высокий уровень экспрессии IL-1β характерен для людей с резистентными формами эпилепсии и коррелирует с генерацией судорожных приступов у больных эпилепсией [26]. В работах Vezzani и соавт. показано на экспериментальных моделях, что введение IL-1β имеет проконвульсантный эффект [27, 28]. IL-1β запускает каскад провоспалительных реакций, связываясь с рецептором IL-1R1 – следующим после системы NLRP3 регулятором провоспалительного действия IL-1β. Естественным противовоспалительным фактором на данном этапе является антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra), связывающийся с рецептором IL-1R1 и блокирующий дальнейшую передачу сигнала [29]. При развитии воспалительной реакции продукция IL-1β сопровождается экспрессией многократно большего количества IL-1Ra, однако во время судорог продукция антагониста в мозге значительно запаздывает относительно выброса IL-1β, что может являться причиной более серьезных последствий [28, 30]. Применяемый для терапии в виде рекомбинантного белка IL-1Ra (препарат анакинра) демонстрирует высокую селективность и противовоспалительную эффективность [31, 32]. В экспериментальных моделях также показано, что введение IL-1Ra ослабляет острые судороги и меняет течение эпилептогенеза, в частности, оказывая нейропротекторный эффект и ослабляя поведенческие нарушения [33, 34].

В данном исследовании для анализа изменений поляризации глиальных клеток в ходе эпилептогенеза была использована литий-пилокарпиновая модель, считающаяся одной из лучших моделей височной эпилепсии, в которой эпилептогенез индуцируется эпилептическим статусом [35]. В этой модели эпилептический статус развивается после введения хемоконвульсанта пилокарпина, затем следует латентный период, длящийся от 1 до 5 недель, когда спонтанные судороги не наблюдаются. Латентный период заканчивается с появлением первого спонтанного эпилептического припадка. Основной структурой мозга, участвующей в эпилептогенезе и претерпевающей сущест- венные изменения в латентный период, является гиппокамп, однако молекулярные изменения затрагивают также и височную кору [36, 37]. Для модификации эпилептогенеза в латентный период был использован IL-1Ra (препарат анакинра) с целью уточнить роль провоспалительного пути IL-1β в поляризации глиальных клеток при эпилептогенезе.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные

В эксперименте были использованы самцы крыс Вистар в возрасте 7 недель. Разведение животных осуществлялось виварием Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Крыс размещали по 4–6 особей в стандартные клетки для содержания лабораторных грызунов. На всех этапах эксперимента животным предоставлялся неограниченный доступ к воде и гранулированному сухому корму, осуществлялся автоматический контроль освещения с циклом 12-часового светового дня.

Литий-пилокарпиновая модель

За сутки до введения пилокарпина крысам вводили раствор хлорида лития (внутрибрюшинно – в/б, 127 мг/кг, Sigma-Aldrich, США) [38]. За 30–40 мин до введения пилокарпина крысам вводили скополамин метил бромид (в/б, 1 мг/кг, Sigma-Aldrich) для снижения активации периферических мускариновых рецепторов [35]. Введение пилокарпина (Sigma-Aldrich) производили дозами по 10 мг/кг (в/б) каждые полчаса, максимальная суммарная доза достигала 40 мг/кг. Введение пилокарпина прекращали на той дозе, после которой у крыс развивались судороги 4-й стадии тяжести (rearing) по модифицированной шкале Racine [39]. Если после введения пилокарпина в суммарной дозе 40 мг/кг у крыс не развивался эпилептический статус, их исключали из эксперимента. Эпилептический статус останавливали через 75 мин введением диазепама (в/б, 10 мг/кг, Sigma-Aldrich). Контрольным животным вводили только раствор хлорида лития. В течение первой недели после эпилептического статуса крыс кормили преимущественно влажным и сладким кормом (огурцы, хурма, распаренный геркулес с сахаром и растительным маслом) для облегчения восстановления и улучшения выживаемости.

Схема введения анакинры

После прекращения эпилептического статуса крысы случайным образом были поделены на две группы. Одной группе животных вводили антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra, препарат анакинра, Научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов, Россия), вторая группа получала физиологический раствор. Препарат анакинра представляет собой модифицированный белок IL-1Ra (чистота 99%), к N-концу которого добавлена аминокислота метионин, разведенный в концентрации 100 мг/мл. Первая инъекция (100 мг/кг) осуществлялась через час после введения диазепама. Затем препарат вводили один раз в день по 100 мг/кг первые 5 дней, 50 мг/кг на шестой день и не вводили на седьмой день перед забором образцов мозга для биохимического анализа. Таким образом, было сформировано 3 группы животных: (1) контрольные (Ctrl, n = 14); (2) постстатусные без терапии (SE, n = 9), (3) постстатусные с терапией анакинрой (SE+A, n = 10).

Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией

Через 7 дней после эпилептического статуса крыс декапитировали, мозг быстро извлекали и замораживали при температуре –80°С. Дорзальную и вентральную области гиппокампа, а также височную кору выделяли с помощью замораживающего микротома OTF5000 (Bright Instruments, Великобритания) в соответствии с атласом мозга крыс [40]. Тотальную РНК экстрагировали при помощи реагента ExtractRNA (Евроген, Россия) согласно инструкции производителя. Затем образцы обрабатывали 1 ед. RQ1 ДНКазы (Promega, США) для удаления возможных остатков геномной ДНК. Концентрацию и чистоту РНК оценивали спектрофотометрически на основе поглощения при 260 нм и коэффициента поглощения 260/280 с использованием спектрофотометра NanoDrop™ Lite (Thermo Fisher Scientific, США).

Для синтеза кДНК использовали 1 мкг тотальной РНК, 0.5 мкг олиго-dT праймеров, 0.25 мкг 9-мерных случайных праймеров (ООО «ДНК-Синтез», Москва, Россия) и 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV (Евроген, Россия) в общем объеме 20 мкл согласно инструкции производителя. Все образцы были разбавлены в 10 раз перед стадией ПЦР.

ПЦР проводили в общем объеме 6 мкл с использованием 0.8 мкл кДНК, 0.5 ед. TaqM-полимеразы (Алкор Био, Санкт-Петербург, Россия), 3.5 мМ MgCl₂, специфических прямого и обратного праймеров и зондов (TaqMan) (см. табл. 1, все нуклеотиды синтезированы ООО «ДНК-Синтез», Россия). В ходе работы праймеры подбирались с помощью программы Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) к последовательностям кДНК генов Tgfb1, Lcn2, S100a10, Nlrp3, Gbp2, Ptx3, S100b, Gja1, Glul, полученных из базы данных RefSeq Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Для конструирования зондов использовали программу Primer3Plus (https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi). Основными параметрами при конструировании праймеров были размер продукта (в пределах 50–140 нуклеотидов), температура отжига (58–63°С) и разница температур отжига (не более 3°С). Зонд конструировался с учетом следующих параметров: длина (18–7 нуклеотидов), содержание GC (20–80%), отсутствие нуклеотида G на 5’ конце. Температура плавления зонда превышала температуру плавления праймеров на 5–10°С.

 

Таблица 1. Использованные последовательности праймеров и зондов

Ген	Последовательность праймеров и зондов 5′ → 3′	Финальные концентрации, нМ	Ссылка
Actb NM_031144	TGTCACCAACTGGGACGATA GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA FAM-CGTGTGGCCCCTGAGGAGCAC-BHQ1	200 200	[41] (праймеры) [42] (зонд)
Gapdh NM_017008	TGCACCACCAACTGCTTAG GGATGCAGGGATGATGTTC R6G-ATCACGCCACAGCTTTCCAGAGGG-BHQ2	200 100	[43]
B2m NM_012512	TGCCATTCAGAAAACTCCCC GAGGAAGTTGGGCTTCCCATT ROX-ATTCAAGTGTACTCTCGCCATCCACCG-BHQ1	200 100	[44]
Rpl13a NM_173340	GGATCCCTCCACCCTATGACA CTGGTACTTCCACCCGACCTC FAM-CTGCCCTCAAGGTTGTGCGGCT-BHQ1	200 100	[45] (праймеры) [42] (зонд)
Sdha NM_130428	AGACGTTTGACAGGGGAATG TCATCAATCCGCACCTTGTA R6G-ACCTGGTGGAGACGCTGGAGCT-BHQ2	200 100	[46] (праймеры) [42] (зонд)
Ppia NM_017101	AGGATTCATGTGCCAGGGTG CTCAGTCTTGGCAGTGCAGA ROX-CACGCCATAATGGCACTGGTGGCA-BHQ1	200 100	[47]
Hprt1 NM_012583	TCCTCAGACCGCTTTTCCCGC TCATCATCACTAATCACGACGCTGG FAM-CCGACCGGTTCTGTCATGTCGACCCT-BHQ1	200 100	[48] (праймеры) [42] (зонд)
Pgk1 NM_053291	ATGCAAAGACTGGCCAAGCTAC AGCCACAGCCTCAGCATATTTC R6G-TGCTGGCTGGATGGGCTTGGA-BHQ2	200 100	[49] (праймеры) [42] (зонд)
Ywhaz NM_013011	GATGAAGCCATTGCTGAACTTG GTCTCCTTGGGTATCCGATGTC ROX-TGAAGAGTCGTACAAAGACAGCACGC-BHQ1	200 100	[49] (праймеры) [42] (зонд)
Il1b NM_031512	CACCTCTCAAGCAGAGCACAG GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC FAM-TGTCCCGACCATTGCTGTTTCCTAG-BHQ1	400 200	[50]
Aif1 NM_017196.3	CAACACACTGCAGCCTCATC AAGCTTTTCCTCCCTGCAAA Cy5-CCCCACCTAAGGCCACCAGCGTCTGA-BHQ3	200 100	[51]
Il1rn NM_022194.2	GGGGACCTTACAGTCACCTAAT GGTTAGTATCCCAGATTCTGAAGG ROX-AGTCAGCTGGCCACCCTGCTGGGA-BHQ2	400 100	[51]
Nlrp3 NM_001191642	CAGACCCTCATGTTGCCTGT AGACCTCGGCAGAAGCTAGA FAM-CCAGACTGGTGAACTGCTGCCTCA-BHQ1	200 100	Эта статья
Lcn2 NM_130741.1	AGCTACGATGTGCAAGTGGC CCCCTTGGTTCTTCCGTACA FAM-CGACACTGACTACGACCAGTTTGCCA-BHQ1	200 150	Эта статья
Arg1 NM_017134.3	AGCTGGGAATTGGCAAAGTG AACTCAGGTGAATGGGCCTT HEX-TGGAAGAGACCTTCAGCTACCTGC-BHQ2	300 100	[52] (праймеры) Эта статья (зонд)
S100a10 NM_031114.1	CATTTCACAGGTTTGCAGGGG GCACTGGTCCAGGTCTTTCA Cy5-AGGACCCTCTGGCTGTGGACA-BHQ3	200 250	Эта статья
Tgfb1 NM_021578.2	CTGCTGACCCCCACTGATAC AGCCCTGTATTCCGTCTCCT FAM-TGTCCGGCAGTGGCTGAACCA-BHQ1	200 100	Эта статья
Ptx3 NM_001109536.2	AAACTTCGCCTCTCCAGCAA CATGGTGTGGGGTCCTCG HEX-TGCTCTCTGGTCTGCAGTGTTGGC-BHQ2	400 200	Эта статья
Gbp2 NM_133624.2	AGTCAATGGGCCACGTCTAA AGTGGGTGATGGCCTTTTGT HEX-AGCAGTGGGTCTCTCCCCTGCA-BHQ2	200 100	Эта статья
Nos2 NM_012611.3	CAGAAGCAGAATGTGACCATCAT CGGAGGGACCAGCCAAATC ROX-CCACCACACAGCCTCAGAGTCCTT-BHQ2	400 200	[53]
Gja1 NM_012567.2	CAGCCTCCAAGGAGTTCCAC GTCCAGAAGCTTCCCCAAGG FAM-ACTTTGGCGCGCCGGCTTCAC-BHQ1	200 100	Эта статья
S100b NM_013191.2	AAGTCCACACCCAGTCCTCT AGGCTCCTGGTCACCTTTTG HEX-ACACCGAAGCCAGAGAGGACTCCGG-BHQ2	200 100	Эта статья
Slc1a3 NM_019225.2	GCGCTGTCATTGTGGGTACA CAGAAGCTCCCCAGGAAAGG Cy5-CCTTGGATTTGCCCTCCGACCGT-BHQ3	200 100	Эта статья
Glul NM_017073.4	CCTTTCGGCTGGCCTTCTAA GCTCCCACACCGCAGTAATA ROX-TGGCTTCCCTGGACCCCAAGGACC-BHQ2	200 150	Эта статья

 

ПЦР проводили в термоциклере C1000 Touch в сочетании с системой обнаружения ПЦР в реальном времени CFX384 Touch™ (BioRad, США) в тетраплетах. Были использованы следующие мультиплексы: Nlrp3 + Aif1, Lcn2 + Arg1 + S100a10, S100b + Cx43. Отдельно для данной работы были проведены ПЦР для генов: S100b + Gja1 + Glul, Tgfb1 + Slc1a3. Эффективность реакций для генов интереса проверяли методом серийных разведений [54]. Оптимизированные нами ПЦР показали оптимальную эффективность в диапазоне 90–100%. Для генов домашнего хозяйства были использованы ранее описанные мультиплексы: Actb + Gapdh + B2m, Rpl13a + Ppia + Sdha, Hprt1 + Pgk1 + Ywhaz [42].

Относительная экспрессия генов была рассчитана с использованием метода 2^−ΔΔCt [55]. Данные нормировали по отношению к среднему геометрическому для трех наиболее стабильных референсных генов: Gapdh, Ywhaz, Pgk1 для дорзального и вентрального гиппокампа, Hprt1, Gapdh, Pgk1 для височной коры. Референсные гены для нормализации были выбраны на основе ранжирования, полученного с помощью онлайн-инструмента RefFinder (https://blooge.cn/RefFinder/).

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ был выполнен с помощью SPSS Statistics 23 (IBM, США) и GraphPad Prism (GraphPad Software, США). Идентификация выбросов в данных производилась с помощью квартильного метода. Критерий Шапиро–Уилка использовался для проверки нормальности распределения. Однородность дисперсии проверялась методом Ливиня. Для нормально распределенных данных использовали ANOVA с апостериорным критерием Тьюки. Дисперсионный анализ Уэлча и апостериорный тест Геймса–Хоуэлла использовали при неоднородности дисперсий.

Для всех тестов групповые различия считались статистически значимыми на уровне p < 0.05. На графиках данные представлены в логарифмической шкале в виде индивидуальных значений с минимальным и максимальным значениями (усы ошибок), медианой выборки (горизонтальная линия), первым и третьим квартилями.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Литий-пилокарпиновый эпилептический статус приводит к увеличению экспрессии генов маркеров активации астроцитов и микроглиальных клеток

Вначале для анализа активации глиальных клеток после длительных судорог мы провели оценку относительного уровня продукции мРНК наиболее широко используемых маркеров глиальных клеток: Aif1 для микроглии и S100b для астроглии [56, 57]. Во всех исследованных структурах было выявлено достоверное увеличение экспрессии двух генов вне зависимости от применения анакинры (рис. 1). Это указывает на реактивацию астроцитов и микроглиальных клеток. Для ответа на вопрос о функциональном состоянии реактивных глиальных клеток мы провели анализ экспрессии соответствующих генов.

 

Рис. 1. Относительная экспрессия генов маркеров активации астроцитов (S100b) и микроглиальных клеток (Aif1) в височной коре (TC), дорзальном (DH) и вентральном (VH) гиппокампе крыс через 7 дней после эпилептического статуса. * р < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 в ANOVA с апостериорным критерием Тьюки или ANOVA с поправкой Уэлча и апостериорным критерием Геймса – Хоуэлла. S100b: TC: F(2, 27) = 12.5, р = 0.002; DH: F(2, 23) = 18.9, р < 0.001; VH: F(2, 25) = 60.3, р < 0.001; Aif1: TC: F(2, 11.9) = 31.3, р < 0.001; DH: F(2, 9.6) = 168.6, р < 0.001; VH: F(2, 13.4) = 697.7, р < 0.001.

 

На седьмые сутки после эпилептического статуса в гиппокампе крыс повышается экспрессия генов белков, вовлеченных в транспорт и метаболизм глутамата

Для оценки функционального состояния астроцитов в первую очередь мы сосредоточились на анализе звеньев, участвующих в транспорте и метаболизме глутамата. Глутамат является основной возбуждающей аминокислотой, повышение внеклеточной концентрации которой показано в гиппокампе после судорог, вызванных пилокарпином [58]. Астроциты экспрессируют переносчики возбуждающих аминокислот с высокой аффинностью к глутамату (EAAT), принадлежащие семейству генов Slc1 [15]. В данной работе мы провели анализ экспрессии гена Slc1a3, кодирующего EAAT1, и выявили повышение его относительной экспрессии в дорзальном и вентральном гиппокампе. Применение анакинры не оказало значимого влияния на выявленную гиперэкспрессию (рис. 2). В связи с этим увеличение экспрессии гена Slc1a3 может свидетельствовать о развитии компенсаторных механизмов, направленных на уменьшение концентрации глутамата во внеклеточном веществе.

 

Рис. 2. Относительная экспрессия генов транспортера глутамата EAAT1 (Slc1a3), глутаминсинтетазы (Glul) и белка семейства щелевых контактов коннексина 43 (Gja1) в височной коре (TC), дорзальном (DH) и вентральном (VH) гиппокампе крыс через 7 дней после эпилептического статуса. * р < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 в ANOVA с апостериорным критерием Тьюки или ANOVA с поправкой Уэлча и апостериорным критерием Геймса – Хоуэлла. Slc1a3: TC: F(2, 26) = 2.3, р = 0.12; DH: F(2, 23) = 11.3, р < 0.001; VH: F(2, 14.34) = 73.06, р < 0.001; Glul: TC: F(2, 25) = 1.36, р = 0.27; DH: F(2, 20) = 20.8, р < 0.001; VH: F(2, 16.25) = 33.56, р < 0.001; Gja1: TC: F(2, 12.65) = 9.47, р < 0.01; DH: F(2, 21) = 8.54, р < 0.01; VH: F(2, 29) = 41.8, р < 0.001.

 

Далее мы проанализировали изменение экспрессии гена Glul, кодирующего глутаминсинтетазу (GS), являющуюся ключевым ферментом глутамат-глутаминового цикла, необходимого для нормального функционирования глутаматергического синапса [18]. Было выявлено увеличение экспрессии Glul в дорзальном и вентральном отделах гиппокампа. Аналогичные изменения отмечались и в группе SE+A (рис. 2). Это, в свою очередь, также может указывать на компенсаторный механизм, направленный на преобразование глутамата в неактивную форму.

Кроме того, был проведен анализ экспрессии гена коннексина Cx43, участвующего в перераспределении глутамата между астроцитами [17]. Мы выявили повышение экспрессии гена Gja1 в дорзальной и вентральной областях гиппокампа через 7 дней после эпилептического статуса (рис. 2). В височной коре увеличение продукции мРНК гена Gja1 было обнаружено только в группе SE+A по сравнению с контрольными животными, но достоверной разницы между группами SE и SE+A выявлено не было. Полученные данные могут свидетельствовать о функциональной реорганизации астроцитарного синцития.

Применение анакинры способствовало снижению гиперэкспрессии гена провоспалительного цитокина Il1b

Анализ интенсивности нейровоспаления был проведен с помощью оценки относительной экспрессии генов цитокинов (Il1b, Il1rn и Tgfb1) и Nlrp3. Во всех исследованных структурах мозга было обнаружено повышение относительной продукции мРНК трех генов: Nlrp3 – гена инфламмасомного белка NLRP3, активация которого запускает каскад реакций, приводящий к высвобождению активной формы IL-1β; Il1rn – гена противовоспалительного цитокина IL-1Ra, который конкурирует за связывание с рецептором IL-1R1 и блокирует передачу воспалительного сигнала; Tgfb1 – гена плейотропного цитокина TGF-β1 с разнообразным действием в ЦНС, включая участие в воспалительной реакции. Применение анакинры не повлияло на экспрессию перечисленных генов (рис. 3). После эпилептического статуса в мозге крыс во всех исследованных структурах также было выявлено повышение экспрессии гена Il1b, кодирующего провоспалительный цитокин IL-1β (рис. 3). Однако в случае данного цитокина применение анакинры значительно снижало выявленную гиперэкспрессию, особенно в височной коре и вентральном гиппокампе.

 

Рис. 3. Относительная экспрессия генов основного белка инфламмасом Nlrp3, провоспалительного цитокина Il1b, противовоспалительного цитокина Il1rn и плейотропного цитокина Tgfb1 в височной коре (TC), дорзальном (DH) и вентральном (VH) гиппокампе крыс через 7 дней после эпилептического статуса. * р < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 в ANOVA с апостериорным критерием Тьюки или ANOVA с поправкой Уэлча и апостериорным критерием Геймса – Хоуэлла. Nlrp3: TC: F(2, 28) = 36.7, р < 0.001; DH: F(2, 21) = 66.1, р < 0.001; VH: F(2, 12.2) = 152.9, р < 0.001; Il1b: TC: F(2, 27) = 8.4, р < 0.01; DH: F(2, 19) = 13.85, р < 0.001; VH: F(2, 12.5) = 51.67, р < 0.001; Il1rn: TC: F(2, 28) = 10.46, р < 0.001; DH: F(2, 23) = 67.58, р < 0.001; VH: F(2, 13.97) = 326.4, р < 0.001.

 

Применение анакинры не повлияло на экспрессию генов маркеров поляризации астроцитов

Для оценки состояния активации астроглиальных клеток в конце первой недели эпилептогенеза мы проанализировали относительную продукцию мРНК маркеров поляризации состояний A1 (Lcn2, Gbp2) и A2 (S100a10, Ptx3). Было выявлено увеличение экспрессии всех исследованных генов в трех структурах, при этом применение анакинры не повлияло на продукцию генов поляризации астроцитов (рис. 4). Таким образом, можно сделать вывод, что через 7 дней после литий-пилокарпинового SE происходит активация обоих типов состояний астроглиальных клеток, а баланс этих состояний не зависит от активации пути IL-1β.

 

Рис. 4. Относительная экспрессия генов маркеров поляризации астроцитов: маркеры состояний А1 (Lcn2, Gbp2) и А2 (S100a10, Ptx3) в височной коре (TC), дорзальном (DH) и вентральном (VH) гиппокампе крыс через 7 дней после эпилептического статуса. * р < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 в ANOVA с апостериорным критерием Тьюки или ANOVA с поправкой Уэлча и апостериорным критерием Геймса – Хоуэлла. Lcn2: TC: F(2, 24) = 14.82, р < 0.001; DH: F(2, 21) = 16.0, р < 0.001; VH: F(2, 15.45) = 89.87, р < 0.001; Gbp2: TC: F(2, 27) = 7.58, р < 0.01; DH: F(2, 22) = 17.37, р < 0.001; VH: F(2, 12.38) = 101.2, р < 0.001; S100a10: TC: F(2, 28) = 16.65, р < 0.001; DH: F(2, 10.25) = 22.68, р < 0.001; VH: F(2, 14.02) = 199.9, р < 0.001; Ptx3: TC: F(2, 13.88) = 17.65, р < 0.001; DH: F(2, 9.8) = 12.21, р < 0.01; VH: F(2, 26) = 25.74, р < 0.001.

 

Применение анакинры восстановило экспрессию гена маркера противовоспалительного состояния микроглиальных клеток

Эффективными маркерами полярных состояний активации микроглии являются ферменты, использующие аргинин в качестве субстрата, в частности, индуцибельная NO-синтаза (iNOS) и аргиназа-1 [9]. Для М1 характерно повышение продукции гена iNOS, синтезирующей NO, участвующий в реакциях окислительного стресса и нейровоспаления, имеющих место при эпилептогенезе [8, 9]. Мы оценили относительную экспрессию гена Nos2, кодирующего iNOS, и обнаружили снижение его продукции в височной коре, при этом применение анакинры способствовало более выраженному уменьшению экспрессии данного гена (рис. 5). Маркером состояния М2 является аргиназа-1, которая эффективно конкурирует с iNOS и превращает аргинин в орнитиновом цикле в орнитин и мочевину, что ведет к иммуносупрессии в связи с истощением содержания аргинина [10]. При анализе относительной экспрессии гена Arg1, кодирующего аргиназу-1, было выявлено снижение его экспрессии в дорзальном гиппокампе. Применение анакинры восстанавливало экспрессию данного гена до контрольных значений, что может указывать на смещение состояния активации микроглиальных клеток в сторону противовоспалительного фенотипа М2 (рис. 5).

 

Рис. 5. Относительная экспрессия генов маркеров поляризации микроглиальных клеток: маркеры состояний М1 (Nos2) и М2 (Arg1) в височной коре (TC), дорзальном (DH) и вентральном (VH) гиппокампе крыс через 7 дней после эпилептического статуса. * р < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 в ANOVA с апостериорным критерием Тьюки или ANOVA с поправкой Уэлча и апостериорным критерием Геймса – Хоуэлла. Nos2: TC: F(2, 28) = 11.07, р < 0.001; DH: F(2, 21) = 0.53, р = 0.596; VH: F(2, 23) = 0.063, p = 0.94; Arg1: TC: F(2, 13.96) = 5.183, р < 0.05; DH: F(2, 22) = 15.59, р < 0.001; VH: F(2, 28) = 1.322, р = 0.283.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе был проведен анализ экспрессии генов различных астро- и микроглиальных белков в латентную фазу литий-пилокарпиновой модели на седьмые сутки после эпилептического статуса. Для выяснения роли сигнального пути IL-1β в поляризации глиальных клеток при эпилептогенезе производилось введение анакинры (IL-1Ra) в течение всего периода после эпилептического статуса и до дня анализа экспрессии генов. Для анализа были выбраны гены-маркеры активации астроглии (S100b) и микроглии (Aif1), гены белков, участвующих в транспорте и метаболизме глутамата (Slc1a3, Glul, Gja1), гены пути IL-1β (Nlrp3, Il1b, Il1rn) и Tgfb1, гены-маркеры поляризации астроглии (Lcn2, Gbp2, S100a10, Ptx3) и микроглии (Arg1, Nos2).

Уровень экспрессии мРНК S100b и Aif1 значимо возрос во всех исследованных структурах, и введение анакинры не снизило их гиперэкспрессию. В наших предыдущих исследованиях также было выявлено повышение экспрессии Gfap, являющегося классическим маркером активации астроглии [59]. В совокупности данные об экспрессии маркеров глиальных клеток позволяют сделать вывод о том, что на седьмые сутки после индуцированного пилокарпином эпилептического статуса наблюдается активация астроглиальных и микроглиальных клеток, что согласуется с литературными данными о нейровоспалении в период эпилептогенеза [60].

Предполагается, что вызванная эпилептическим статусом реактивация и дисфункциональное ремоделирование астроцитов может являться одной из причин эпилептогенных нарушений [5]. В качестве ее основного механизма рассматривается нарушение регуляции работы глутаматергического синапса вследствие снижения поглощения синаптического глутамата астроцитами, а также нарушения глутамат-глутаминового цикла [14]. Транспортеры глутамата EAAT1 и EAAT2, характерные для астроцитов, имеют разную локализацию на мембране клетки. EAAT1 располагается на соме астроцитов и по длине их отростков, а EAAT2 закреплен каркасными белками на перисинаптической части астроцитарного отростка, непосредственно контактирующей с глутаматергическим синапсом, и осуществляет обратный захват глутамата, высвобождаемого пресинапсом [16]. Ранее в наших работах было показано снижение продукции белка EAAT2 в дорзальном гиппокампе крыс на седьмые сутки после эпилептического статуса при отсутствии значимых изменений экспрессии гена Slc1a2 [21], что может свидетельствовать об ухудшении синаптической функции астроцитов [61]. В настоящем исследовании мы провели анализ экспрессии гена Slc1a3, кодирующего белок EAAT1, который располагается в основном на отростках и соме астроцитов, и гена глутаминсинтетазы (Glul), осуществляющей превращение глутамата в глутамин и локализованной преимущественно в астроцитах. В дорзальном и вентральном гиппокампе была выявлена повышенная экспрессия генов Slc1a3 и Glul, что может свидетельствовать о развитии общего компенсаторного механизма поглощения и превращения глутамата астроцитами. Ранее было показано, что продукция белков EAAT1 и EAAT2 снижается в гиппокампе пациентов с эпилепсией [62, 63]. И хотя в наших предыдущих работах введение анакинры приводило к изменению экспрессии Slc1a2 в вентральном гиппокампе и височной коре, что, как мы предположили, являлось одним из механизмов нейропротекции, в настоящем исследовании введение анакинры не оказало значимого влияния на продукцию Slc1a3 и Glul. Это означает, что увеличение экспрессии данных генов в латентной фазе литий-пилокарпиновой модели не определяется активацией пути IL-1β. В то же время IL-1β способствовал снижению экспрессии генов глутамат-глутаминового цикла в модели рассеянного склероза [64]. Это может указывать на присутствие в эпилептогенезе других механизмов, вклад которых в изменение экспрессии Glul оказывается более существенным.

Данные о роли щелевых соединений и коннексинов в эпилептогенезе противоречивы [19]. Функциональные щелевые контакты между астроцитами образованы полуканалами каждого из двух контактирующих астроцитов. Считается, что в случае тяжелого реактивного астроглиоза щелевые контакты распадаются, становясь полуканалами, что затрудняет быстрое перераспределение ионов и малых молекул и способствует их утечке из астроцитов, что может приводить к повышению возбудимости нейронов [65]. Ингибирование Cx43-содержащих щелевых контактов предотвращало эпилептиформную активность в срезах или снижало ее интенсивность за счет снижения астроцитарной синхронизации [66]. При эпилепсии реактивный астроглиоз сопровождается ростом экспрессии генов коннексинов Cx43 [19, 22, 67]. В нашей работе также было отмечено повышение продукции мРНК Gja1 на седьмые сутки после литий-пилокарпинового эпилептического статуса, что может свидетельствовать о функциональной реорганизации астроцитарного синцития. При этом введение анакинры не повлияло на гиперэкспрессию Gja1 в гиппокампе, но способствовало повышению экспрессии Gja1 в височной коре крыс после эпилептического статуса. Можно предположить, что активация пути IL-1β оказывает влияние на функционирование Cx43. Подобная связь была обнаружена при моделировании болезни Альцгеймера, где обработка IL-1β культуры первичных астроцитов способствовала увеличению уровня дефосфорилированного Cx43 [68]. Однако по уровню мРНК в ткани можно сделать лишь ограниченные выводы о функциональном состоянии щелевых контактов и их вкладе в развитие эпилепсии, так как решающую роль при эпилептогенезе играет структурная организация белковых молекул. Совместно с анализом экспрессии Gja1 и Slc1a2/Slc1a3 уместно в будущих исследованиях оценить относительную экспрессию генов калиевых каналов Kir4.1 и аквапоринов AQP4, так как перечисленные каналы являются звеньями одной системы, участвующей в клиренсе глутамата и K⁺ и поддержании внеклеточного гомеостаза [19].

Для анализа активации провоспалительного пути IL-1β в условиях введения анакинры мы оценили экспрессию генов основных участников данного пути и обнаружили увеличение экспрессии Nlrp3, Il1b и Il1rn во всех исследованных структурах на седьмые сутки после эпилептического статуса. В результате применения анакинры наблюдалось подавление гиперэкспрессии только гена Il1b в височной коре и вентральном гиппокампе. Экспрессия гена Nlrp3 не изменилась в результате системного введения анакинры, следовательно, снижение экспрессии гена Il1b связано с последующими механизмами регуляции провоспалительного ответа, в частности, рецептора IL-1R1. Согласно литературным данным, изменение соотношения IL-1β (запуск провоспалительного каскада при связывании с рецептором IL-1R1) и IL-1Ra (ингибирование развития противовоспалительного каскада) в пользу второго может способствовать снижению интенсивности воспаления и развитию комплекса противовоспалительных реакций [69]. Следует заметить, что в мозге крыс после эпилептического статуса наряду с повышением экспрессии Il1b было выявлено и повышение экспрессии Il1rn, что отражает работу собственных механизмов регуляции интенсивности нейровоспаления, которые, по-видимому, оказываются недостаточными после литий-пилокарпинового эпилептического статуса для снижения интенсивности воспалительных процессов.

Мы также выявили повышение экспрессии гена Tgfb1 в гиппокампе и височной коре крыс через 7 дней после эпилептического статуса. Функции TGF-β1 неоднозначны [70], с одной стороны, он рассматривается как плейотропный цитокин, продуцируемый микроглией и являющийся маркером состояния M2, с другой стороны, как рос- товой фактор. Гиперэкспрессия Tgfb1 может быть звеном компенсаторного механизма для снижения интенсивности нейровоспалительных реакций, ранее было показано, что TGF-β1 регулирует степень пролиферации астроцитов и микроглии [71]. С другой стороны, при нарушении целостности гематоэнцефалического барьера TGF-β1 опосредует индуцируемое альбумином патологическое ремоделирование матрикса и повышение возбудимости нейронов [72]. Таким образом, выводы о функциональном значении гиперэкспрессии Tgfb1 можно делать только на основании комплексных морфологических и молекулярных данных.

На основе анализа генов-маркеров А1/А2 поляризации астроцитов (Lcn2, Gbp2 и S100a10, Ptx3 соответственно) мы делаем вывод, что на седьмые сутки после SE имеет место активация обоих полярных состояний астроцитов. Более того, поскольку введение анакинры не оказало влияния на гиперэкспрессию изучаемых генов, мы предполагаем, что баланс этих состояний зависит не от активации пути IL-1β, а определяется другими механизмами.

Активированная микроглия представлена спектром переходящих состояний, где М1/М2 являются обозначениями крайних полярных состояний активации, но редко встречаются в чистом виде in vivo [73, 74]. Считается, что на начальных этапах развития нейровоспаления преобладает провоспалительный или нейротоксический фенотип М1, направленный на удаление продуктов клеточной гибели, а также инфекционных агентов. На завершающих этапах воспалительных реакций, направленных на пролиферацию клеток и репарацию тканей, происходит переключение на M2 – так называемый альтернативный или противовоспалительный фенотип. Однако когда противовоспалительный ответ не дает результата, постоянное присутствие и продолжающаяся продукция провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода может привести к гибели клеток и дальнейшему повреждению тканей [6]. По данным экспрессии маркерных генов полярных фенотипов мы можем говорить о равновесии про- и противовос- палительных процессов в целом. В нашем исследовании было обнаружено снижение экспрессии гена Nos2 в височной коре, что может свидетельствовать об уменьшении провоспалительной активации микроглии на седьмые сутки после эпилептического статуса. При этом введение анакинры способствовало более выраженному подавлению экспрессии данного гена в височной коре. Напротив, в дорзальном гиппокампе – одной из основных структур эпилептогенеза в литий-пилокарпиновой модели – было выявлено снижение экспрессии гена Arg1, что может указывать на ослабление противовос- палительных процессов, реализуемых микроглией, это способствует эпилептогенезу, поскольку ингибирование активности или экспрессии аргиназы приводит к увеличению продукции NO [8, 9]. Восстановление продукции Arg1 при применении анакинры может отражать один из механизмов противоэпилептогенного эффекта IL-1Ra, показанного ранее [59]. Можно предположить, что в совокупности сохранение повышенной экспрессии противовоспалительных факторов IL-1Ra и TGF-β1, восстановление экспрессии гена Arg1 и снижение гиперэкспрессии Il1b могут значимо смещать баланс реакций активного нейровоспаления в сторону нейропротекции и репарации нервной ткани. Известно, что активация противовоспалительного фенотипа микроглии лежит в основе благоприятного исхода болезней, в патогенезе которых ключевую роль играет нейровоспаление [6].

Таким образом, системное введение анакинры не повлияло на интенсивность активации астроглии и микроглии, но позволило сдвинуть баланс между про- и противовоспалительными процессами в сторону противовоспалительных реакций в активированной микроглии. Это позволяет предположить, что поляризация микроглии зависит от активации пути IL-1β, а влияние на этот путь может быть перспективным подходом к модификации эпилептогенеза и терапии эпилепсии.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

SE – status epilepticus, эпилептический статус

EAAT1 и EAAT2 – Excitatory Amino Acid Transporter 1 и 2

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и разработка дизайна исследования (М. В. З., О. Е. З., А. В. З.), проведение экспериментальной работы (М. В. З., А. А. К., А. В. Д., А. М. И.), анализ и интерпретация данных (М. В. З., А. А. К., А. В. Д.), статистическая обработка данных (М. В. З., А. А. К.), написание и редактирование рукописи (А. В. Д., М. В. З., А. А. К., О. Е. З., А. В. З.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств гранта Российского научного фонда, номер проекта 23-25-00242. Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований и в соответствии с Руководством по обращению с лабораторными животными, действующим в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (номер этического разрешения: 13-к-а от 15 февраля 2018 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Sobre autores

M. Zakharova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Email: aleksey_zaitsev@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

A. Dyomina

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Email: aleksey_zaitsev@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

A. Kovalenko

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Email: aleksey_zaitsev@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

O. Zubareva

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Email: aleksey_zaitsev@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

A. Ischenko

Saint-Petersburg Pasteur Institute

Email: aleksey_zaitsev@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

A. Zaitsev

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Autor responsável pela correspondência
Email: aleksey_zaitsev@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

Bibliografia

Arquivos suplementares