Cytogenetic disorders depending on hypermethylation of gene promoters in exposed individuals: final research results

全文:

Совокупность данных мировой литературы позволяет говорить о широком спектре последствий для структурно-функционального статуса клетки, которые имеют место при индукции таких эпигенетических модификаций как изменения метилирования ДНК. Это зависит как от расположения анализируемого CpG-сайта, так и от направленности процесса модификации (гипо-/гиперметилирование). В экспериментальных исследованиях установлено, что гиперметилирование CpG-островков, как правило, приводит к супрессии активно работающих генов [1]. Такие локус-специфические изменения эпигенома могут быть индуцированы генотоксическими факторами, в том числе радиацией, ассоциированы с преждевременным старением организма и возраст-ассоциированными заболеваниями [1–5]. Поэтому рассмотрение гиперметилирования промоторов генов как отдаленных биомаркеров облучения, имеющих прогностическую ценность в отношении здоровья человека, представляется важным и актуальным.

Как было изложено в наших предыдущих работах [6–8], итоговые результаты многолетнего пилотного изучения гиперметилирования промоторов совокупности генов RASSF1A, р14/ARF, p16/INKA, GSTP1, p53, ATM, ESR1, SOD3 в различных когортах облученных лиц свидетельствуют о значимости радиационного фактора в индукции рассматриваемых эпигенетических изменений. Это в целом верифицировано на независимых выборках облученных индивидов. Показана дифференциальная значимость возраста и радиационного воздействия в метилировании CpG-островков промоторов разных генов. Последнее согласуется с данными, полученными позднее некоторыми коллективами в исследованиях эпигенетического статуса других локусов (обследование работников Сибирского химического комбината, жителей прибрежных сел р. Теча) [9–11].

Результаты ROC-анализа и наблюдаемый нами дозозависимый характер рассматриваемых изменений метилирования демонстрируют существенную эффективность выявления облученных лиц с помощью этих эпигенетических маркеров [8]. Очевидно, что рассмотрение гиперметилирования генов как отдаленных биомаркеров облучения подразумевает также оценку их связи с такими цитогенетическими нарушениями, как аберрации хромосомного типа, характерными преимущественно для радиационного воздействия. Отметим, что для последних отсутствуют явные доказательства сопряженности с заболеваемостью [1].

В нашей предыдущей публикации показано увеличение частоты хромосомных нарушений у облученных лиц с возрастанием количества метилированных генов из числа RASSF1A, р14/ARF, p16/INKA, GSTP1 [12]. Цель настоящей работы заключалась в анализе совокупности полученных на протяжении нескольких лет данных, направленном на оценку сопряженности статуса метилирования промоторов восьми генов RASSF1A, р14/ARF, p16/INKA, GSTP1, p53, ATM, ESR1, SOD3 с уровнем цитогенетических повреждений у облученных лиц в отдаленный период после перенесенного радиационного воздействия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

В настоящей работе проводится анализ сопряженности гиперметилирования промоторов восьми генов с цитогенетическим статусом облученных лиц, представляющих собой гетерогенную выборку индивидов, пострадавших в результате аварии на ЧАЭС (101 чел., 24–78 лет: ликвидаторы аварии на Чернобыльской АЭС и взрослые жители территорий, загрязненных радионуклидами 135–688 кБк/м²). Характеристика обследованных индивидов уже подробно приводилась в публикациях [6, 12]. Зарегистрированные дозы облучения у ликвидаторов (если такие сведения имелись) находились в диапазоне от 35 до 480 мЗв. Промежуток времени между окончанием работ в зоне ликвидации и взятием образцов крови составлял более 15 лет. Цитогенетические и эпигенетические исследования проводились на протяжении многих лет в лаборатории экологической генетики ИОГен РАН, их методические подробности и полученные результаты опубликованы в наших предыдущих работах [6–8, 12–14]. Полученная совокупность данных позволила провести итоговый анализ сопряженности между изученными показателями.

Вкратце, анализ хромосомных аберраций лимфоцитов периферической крови включал микроскопирование монохромно окрашенных метафазных пластинок с целью выявления аберраций хроматидного и хромосомного типа. К первым относили одиночные и изохроматидные фрагменты, межхромосомные хроматидные обмены. Вторые включали простые (ацентрические парные фрагменты, центромерные разрывы, делеции, не сопровождающиеся ацентрическими фрагментами) и сложные обменные (дицентрики, центрические и ацентрические кольца, атипичные моноцентрики — симметричные транслокации, инверсии) хромосомные перестройки. Частичный кариотипический анализ с идентификацией гомологичных хромосом/групп гомологичных хромосом проводился с целью выявления делеций, реципрокных транслокаций, инверсий.

Анализ гиперметилирования CpG-островков промоторов генов клеточного цикла (RASSF1A, р16/INK4A, р14/ARF, р53, АТМ), антиоксидантной защиты (GSTP1, SOD3), эстрогенового рецептора (ESR1) выполнен с применением детально описанной ранее оптимизированной и стандартизованной в лаборатории метилчувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР), позволяющей диагностировать 0.1–1% метилированных аллелей в образце ДНК лейкоцитов крови [6, 7]. C помощью эндонуклеазы AciI (“Fermentas“, Литва), гидролизующей только неметилированные участки узнавания (5’…C↓C GC…3’), в общей сложности проанализирован статус метилирования 34 CpG-динуклеотидов генома: для промоторов генов RASSF1A, р16/INK4A, р14/ARF, р53, АТМ, GSTP1, SOD3, ESR1 количество рассматриваемых сайтов составило 7, 2, 3, 4, 6, 4, 6, 2 соответственно. У 80 облученных индивидов изучено гиперметилирование промоторов всех восьми генов, а у 21 человека — только четырех (RASSF1A, р16/INK4A, р14/ARF, GSTP1) локусов.

Так как большинство современных исследований в области эпигенетики старения и возраст-ассоциированных заболеваний человека выполнено с помощью технологии микрочипирования (Illumina), мы предприняли попытку сопоставить проанализированные нами CpG-сайты генома с таковыми, аннотированными Illumina к Infinium Methylation EPIC 850k chip. Для этого были определены координаты проанализированных нами участков генома/позиции проанализированных CpG-сайтов с помощью программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) и сопоставлены с таковыми, аннотированными Illumina. К сожалению, большинство исследованных CpG-сайтов характеризуются расположением на расстоянии от нескольких килобаз (1kb = 1000 нуклеотидов) до сотен килобаз до ближайшего иллюминовского CpG. Следует отметить, что значимая корреляция между уровнями метилирования CpG-сайтов генома отмечается на расстояниях менее 1 kb, а по последним оценкам не более 500 b [15]. Только лишь два CpG-сайта, аннотированные Illumina, расположены в проанализированных нами фрагментах промоторов генов р16/INK4A и SOD3: cg14430974 и cg05706652 соответственно. Сопоставив позиции этих сайтов с таковыми для исследованных нами CpG-динуклеотидов в соответствующих участках генома, получаем, что наименьший интервал между проанализированным и аннотированным Illumina CpG-сайтом составляет 57 b и 4 b для гена р16/INK4A и SOD3 соответственно, что детально показано в табл. 1.

 

Таблица 1. Проанализированные CpG-динуклеотиды, локализованные в геноме вблизи (менее 100 kb) CpG-сайтов, аннотированных Illumina к Infinium Methylation EPIC 850k chip

Table 1. Analyzed CpG-dinucleotides localized in the genome near (less than 100 kb) CpG sites annotated by Illumina to the Infinium Methylation EPIC 850k chip

Показатель		Локус (хромосома)
		p16/CDKN2A (chr9)	SOD3 (chr4)
Позиция проанализированного фрагмента генома (интервал между праймерами)		21995680 — 21995928	24799424 — 24800253
CpG-сайты, аннотированные Illumina	общее число	41	19
	позиция в геноме (интервал)	21966564 — 21995735	24795830 — 24802387
	CpG-сайты, локализованные в проанализированном фрагменте генома (позиция)	cg10848754 (21995733), cg14430974 (21995735)	cg05706652 (24799557)
Проанализированные CpG-сайты (позиция)		21995793, 21995821, 21995907	24799440, 24799489, 24799552, 24799620, 24799634, 24799713
Наименьший интервал (b) между проанализированным и аннотированным Illumina CpG-сайтами		57 b	4 b

 

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программ SPSS 20.0.0. общепринятыми статистическими методами. Непараметрический корреляционный (по Спирмену) и множественный регрессионный анализы были использованы с целью выяснения зависимости между исследуемыми показателями (метилирование промоторов генов, возраст, уровни цитогенетических нарушений). С помощью Н-критерия Краскела–Уоллиса (непараметрический аналог ANOVA теста) были оценены различия между группами облученных лиц, имеющих разный эпигенетический статус, по рассмотренным цитогенетическим показателям.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Наша предыдущая публикация посвящена итогам проводимого в течение нескольких лет изучения гиперметилирования промоторов восьми генов RASSF1A, р14/ARF, p16/INKA, GSTP1, p53, ATM, ESR1, SOD3 у 605 человек, 273 из которых были облучены. Результаты свидетельствуют о значимой сопряженности фактора радиационного воздействия с метилированием совокупности проанализированных генов. Кроме того, результаты мониторинга лиц, подвергшихся радиационному воздействию, свидетельствуют о выраженной поврежденности генома соматических клеток облученных индивидов спустя годы и десятки лет после экспонирования. В первую очередь это проявляется значимо повышенными уровнями аберраций хромосомного типа, как простых, так и сложных обменных, что уже было детально изложено [6–8, 13, 14]. В настоящей работе приводятся итоговые результаты анализа ассоциативной связи между изученными эпигенетическими и цитогенетическими показателями.

В нашей предыдущей публикации приводились соответствующие результаты для первых четырех изученных генов RASSF1A, р14/ARF, p16/INKA, GSTP1 [12]. Позднее проанализированный статус метилирования p53, ATM, ESR1, SOD3 локусов позволяет в настоящей работе рассмотреть его в аспекте связи с поврежденностью генома клеток крови и привести итоговые результаты изучения сопряженности эпигенетических изменений совокупности восьми генов с уровнем цитогенетических повреждений.

В табл. 2 продемонстрированы результаты непараметрического корреляционного анализа между изученными показателями. Так как распределения обследованных лиц по частотам метилированных генов и аберраций хромосом не имели нормального характера, были вычислены соответствующие ранговые корреляции по Спирмену.

 

Таблица 2. Непараметрические корреляции* по Спирмену между метилированием СpG-островков промоторов генов и частотами аберраций хромосом у облученных индивидов

Table 2. Spearman nonparametric correlations between methylation of CpG-islands of gene promoters and frequencies of chromosome aberrations in exposed individuals

Цитогенетические показатели	Гены				Общая частота метилированных генов**
	p53	ATM	ESR1	SOD3
Суммарная частота аберраций хромосом	0.248 (0.026)*	0.240 (0.032)	0.242 (0.030)	0.373 (0.001)	0.434 (5.8Е-6)
Суммарная частота аберраций хромосомного типа	0.331 (0.003)	0.413 (1.4Е-4)	0.451 (2.7Е-5)	0.369 (0.001)	0.614 (8.2Е-12)
частота обменных аберраций хромосомного типа	0.336 (0.002)	0.343 (0.002)	0.322 (0.004)	0.276 (0.130)	0.437 (4.8Е-6)
частота простых аберраций хромосомного типа	0.223 (0.047)	0.326 (0.003)	0.367 (0.001)	0.298 (0.007)	0.500 (1.0Е-7)
Суммарная частота аберраций хроматидного типа	0.018 (0.873)	–0.112 (0.323)	–0.047 (0.680)	0.132 (0.243)	0.071 (0.479)

* Под коэффициентами корреляций в скобках указаны двусторонние уровни значимости (р-value).

** Рассчитана как отношение выявленного количества метилированных генов к общему числу проанализированных локусов (с учетом проанализированных ранее локусов их общее число восемь, т. е. RASSF1A, р14/ARF, p16/INKA, GSTP1, p53, ATM, ESR1, SOD3).

 

Как видно, для всех четырех генов выявлены невысокие, но значимые корреляции гиперметилирования промоторов с суммарной частотой хромосомных повреждений. Эта сопряженность обусловлена именно аберрациями хромосомного типа. Действительно, уровни как простых, так и сложных обменных хромосомных перестроек проявили значимую ассоциативную связь с эпигенетическими нарушениями. Исключение составил ген SOD3 в смысле отсутствия связи гиперметилирования его промотора с частотой обменных аберраций хромосомного типа. В то же время для аберраций хроматидного типа рассматриваемые ассоциации не выявлены (табл. 2).

Показана высокозначимая ассоциативная связь частоты метилированных генов (отношение выявленного количества метилированных генов к общему числу проанализированных локусов) с суммарной частотой аберраций хромосом, цитогенетических нарушений хромосомного типа (как простых, так и обменных), но не с уровнем хроматидных аберраций (табл. 2).

В табл. 3 показаны результаты множественного регрессионного анализа зависимости цитогенетических показателей от возраста индивида и частоты гиперметилированных генов. Как видно, общая частота аберраций хромосом (хроматидные + хромосомные) преимущественно ассоциирована со статусом метилирования (β = 0.457, р = 2.8E-6), хотя с возрастом сопряженность оказалась тоже значимой (β = –0.190, р = 0.041). Как показывает анализ данных, последняя обусловлена вкладом аберраций хроматидного типа: их уровень ассоциирован с возрастом (β = –0.225, р = 0.027), но не с эпигенетическими изменениями (β = 0.138, р = 0.171). Отметим, что переменная “возраст” входит в оба уравнения множественной регрессии (суммарная частота аберраций хромосом ~ частота метилированных генов + возраст и частота аберраций хроматидного типа ~ частота метилированных генов + возраст) с отрицательным коэффициентом.

Суммарная частота аберраций хромосомного типа ассоциирована со статусом метилирования (β = 0.597, р = 1.5E-10), но не с возрастом (β = –0.047, р = 0.576). Высокозначимый угловой коэффициент при переменной “частота метилированных генов”имеет место в уравнениях, описывающих как уровень простых (β = 0.504, р = 1.9E-7), так и сложных обменных хромосомных перестроек (β = 0.349, р = 3.6E-4) (табл. 3).

 

Таблица 3. Зависимость цитогенетических нарушений от возраста и частоты метилированных генов у облученных индивидов (множественный регрессионный анализ)

Table. 3. The dependence of cytogenetic disorders on age and frequency of methylated genes in irradiated individuals (multiple regression analysis)

Показатель	В* (± SE)	β**	t***	p-value
Суммарная частота аберраций хромосом ~ частота метилированных генов + возраст
Константа	0.022 ± 0.004		5.658	1.5E-7
Возраст	–1.5E-4 ± 7.1E-5	–0.190	–2.071	0.041
Метилирование	0.032 ± 0.007	0.457	4.97	2.8E-6
Коэффициент детерминации R2 = 0.208
Суммарная частота аберраций хромосомного типа ~ частота метилированных генов + возраст
Константа	0.006 ± 0.002		2.791	0.006
Возраст	–2.2E-5 ± 3.8E-5	–0.047	–0.560	0.576
Метилирование	0.025 ± 0.004	0.597	7.159	1.5E-10
Коэффициент детерминации R2 = 0.347
Частота обменных аберраций хромосомного типа ~ частота метилированных генов + возраст
Константа	–5.7Е-4 ± 0.001		–0.593	0.555
Возраст	2.9E-5 ± 1.8E-5	0.153	1.618	0.109
Метилирование	0.006 ± 0.002	0.349	3.698	3.6E-4
Коэффициент детерминации R2 = 0.167
Частота простых аберраций хромосомного типа ~ частота метилированных генов + возраст
Константа	0.006 ± 0.002		3.164	0.002
Возраст	–5.1E-5 ± 3.7E-5	–0.122	-1.357	0.178
Метилирование	0.019 ± 0.003	0.504	5.603	1.9E-7
Коэффициент детерминации R2 = 0.243
Частота аберраций хроматидного типа ~ частота метилированных генов + возраст
Константа	0.016 ± 0.003		4.938	3.2E-6
Возраст	–1.365 ± 6.1E-5	–0.225	–2.241	0.027
Метилирование	0.008 ± 0.006	0.138	1.380	0.171
Коэффициент детерминации R2 = 0.057

* Коэффициент линейной регрессии. ** Стандартизованный коффициент линейной регрессии. *** Отношение В/β.

 

Н-критерий Краскела–Уоллиса также продемонстрировал высокозначимые различия между группами облученных лиц, имеющих разный эпигенетический статус, по всем рассмотренным цитогенетическим показателям, за исключением аберраций хроматидного типа. Так, у индивидов, характеризующихся частотами метилированных генов 0, 0.125, 0.25, 0.375, 0.5, средние уровни аберраций хромосом и аберраций хромосомного типа (на 1 клетку) составили соответственно 0.014 ± ± 0.001 и 0.005 ± 0.001, 0.017 ± 0.002 и 0.007 ± 0.001, 0.025 ± 0.002 и 0.012 ± 0.001, 0.022 ± 0.004 и 0.011 ± ± 0.002, 0.024 ± 0.002 и0.016 ± 0.002. Значимость различий между этими группами характеризуется следующими статистическими показателями: χ² = 22.021, df = 4, p = 2E-4 и χ² = 39.690, df = 4, p = 5E-8 для суммарной частоты цитогенетических нарушений и перестроек хромосомного типа, соответственно.

Рис. 1. демонстрирует существенные различия между рассматриваемыми группами по частоте как простых, так и сложных обменных аберраций хромосомного типа: χ² = 28.081, df = 4, p = 1.2E-5 и χ² = 20.634, df = 4, p = 3.7E-4. Отметим, что количество лиц с высокими частотами метилированных генов (0.375 и 0.5) является незначительным (семь и три человека соответственно). Поэтому некоторые цитогенетические показатели не отличались от таковых у индивидов с менее измененным эпигенетическим статусом.

 

Рис. 1. Частоты аберраций хромосом у облученных лиц в зависимости от статуса метилирования промоторов генов: А – простые аберрации хромосомного типа; Б — обменные аберрации хромосомного типа.

Приведенные разбросы соответствуют стандартным ошибкам.

Fig. 1. The frequency of chromosomal aberrations in irradiated individuals depending on the methylation status of gene promoters: A — simple aberrations of the chromosomal type: B — exchange aberrations of the chromosomal type.

The given variations correspond to standard errors (SE).

 

Разброс индивидуальных уровней аберраций хромосом и сопряженность этих цитогенетических нарушений с изменениями метилирования (R² = 0.229, p = 4.3E-7 и R² = 0.145, p = 8.6E-5 для простых и обменных аберраций хромосомного типа соответственно) визуально представлены на рис. 2. Таким образом, уровень цитогенетических нарушений хромосомного типа возрастает с увеличением количества метилированных генов у облученных индивидов.

 

Рис. 2. Зависимость уровня аберраций хромосомного типа от частоты метилированных генов у облученных лиц: А – простые аберрации хромосомного типа; Б — обменные аберрации хромосомного типа.

Fig. 2. Dependence of the level of chromosomal type aberrations on the frequency of methylated genes in exposed individuals: A — simple aberrations of the chromosomal type; B — exchange aberrations of the chromosomal type.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе выявлена сопряженность между частотой генетических и эпигенетических нарушений в клетках крови, регистрируемых, как правило, в отдаленный период после перенесенного радиационного воздействия. А именно, наблюдается невысокая, но высокозначимая прямая корреляционная связь между уровнями аберраций хромосомного типа (как простых, так и сложных обменных) и частотой метилированных генов у облученных индивидов.

Следует подчеркнуть, что нами для исследований были выявлены активно работающие гены основных защитных систем клетки, в большинстве случаев характеризующиеся крайне низким уровнем метилирования CpG-островков промоторов. Примененный рутинный метод простой метилчувствительной ПЦР является качественным, а не количественным. Другими словами, на электрофореграмме может визуализироваться полоса, интенсивность которой соответствует определенному количеству метилированных матриц в образце ДНК (больше 0.1–1%). Причем, чтобы сигнал был положительный, все CpG-динуклеотиды в участках узнавания использованной нами рестриктазы должны быть метилированы. Поэтому при заданных нами условиях амплификации даже в группе облученных индивидов частота лиц с выявляемым метилированием невысока и находится в диапазоне 10–20% в зависимости от гена. Лишь для локуса SOD3 этот показатель составлял более 40% [7, 8].

Как уже было изложено в разделе “Материалы и методика”, два CpG-сайта, аннотированные Illumina, расположены в проанализированных нами фрагментах промоторов генов: cg14430974 (ген р16/INK4A) и cg05706652 (ген SOD3). Так как наименьший интервал между проанализированными нами и аннотированными Illumina CpG-сайтами составляет всего лишь единицы — десятки баз, будем считать, что имеет место значимая корреляция между уровнями метилирования этих CpG-динуклеотидов. В рамках сотрудничества с лабораторией анализа генома ИОГен РАН (научно-техническая Программа Союзного государства “ДНК-идентификация” [16]), А.В. Рубановичем проводился статистический анализ средних уровней метилирования 820 365 CpG-сайтов генома в группе необлученных лиц. Для вышеупомянутого cg14430974 (ген р16/INK4A) этот показатель составил β = 0.0470 и существенно был ниже такового для гена SOD3 (cg05706652, β = 0.8194), что в целом согласуется с наблюдаемой высокой частотой встречаемости метилирования локуса SOD3 в наших исследованиях.

При обследовании облученных работников Сибирского химического комбината выявлена сопряженность степени метилирования промоторов других генов (BAX, APAF1, GADD45A, CASP9, CIDEB) c теми или иными цитогенетическими показателями. Для некоторых локусов (BAD, BID, HRK, CASP9, CIDEB) наблюдалась дозовая зависимость этих эпигенетических нарушений [9, 10]. Слабая корреляция уровня метилирования промотора гена АТМ с дозовой нагрузкой отмечена и у жителей прибрежных сел р. Теча [11].

Наблюдаемая сопряженность между цитогенетическими нарушениями и изменением статуса метилирования промоторов генов, по нашему мнению, вполне согласуется с общностью механизмов индукции и причин сохранения на протяжении многих лет генетических и эпигенетических эффектов радиации. Во-первых, как уже обсуждалось нами ранее, радиационно-индуцированное гиперметилирование генов связано с оксидативным стрессом, что приводит к сверхрегуляции ДНК метилтрансфераз и рекрутированию этих ферментов к специфическим сайтам репарации ДНК. Во-вторых, повреждения генома/эпигенома могут быть связаны как с непосредственным действием квантов радиации/ионизирующих частиц на клетки крови и их стволовые гемопоэтические предшественники, так и с немишенными отсроченными эффектами облучения (радиационно-индуцированная геномная нестабильность и эффект “свидетеля”) [6–8, 12]. С современных позиций, в реализации последних важная роль отводится механизмам хронического оксидативного стресса, связанным с повреждением митохондрий и их дисфункциями [7, 17].

Предполагаемую роль механизмов хронического оксидативного стресса в реализации отдаленных эффектов облучения, например, демонстрируют данные, свидетельствующие о повышенном уровне продуктов липидной пероксидации и 8-гидрокси-2^/-деоксигуанозина (8-OHDG). Это сопряжено с такими показателями нестабильности генома, как уровни аберрации хромосом, ломкость теломер у врачей-радиологов, подвергшихся многолетнему низкоинтенсивному облучению [18]. При обследовании этого контингента облученных лиц показана обратная сопряженность уровня вышеупомянутых повреждений гуанина с тотальным метилированием генома [19].

Ранее нами уже обсуждалось выявленное в нескольких работах других исследователей на животных гиперметилирование генов в отдаленный период после воздействия ионизирующих излучений [1]. В последние годы в экспериментах на растениях и рыбах показано сохранение радиационно-индуцированных изменений статуса метилирования генов в ряду поколений, т. е. трансгенерационная передача этих эпигенетических маркеров перенесенного облучения [20, 21].

Так, через год после хронического воздействия γ-излучения (8.7 мГр/ч, 27 дней) на родительское поколение zebrafish (отряд карпообразные) у потомков F1-генерации (исследование эмбрионов, 5.5 ч после фертилизации) методом полногеномного секвенирования выявлено 5658 дифференциально-метилированных сайтов (DMRs), преимущественно локализованных в регуляторных участках генома — промоторах генов и энхансерах. Гены DMRs были ассоциированы с развитием, апоптозом, индукцией раковых опухолей, причем анализ экспрессии генов показал сопряженность изменений с аналогичными функциями. Показано, что изменения метилирования ДНК частично могут сохраняться на протяжении нескольких поколений: из 19 DMR, выявленных в поколении F1, пять DMR регистрировались вплоть до F3-генерации. По мнению авторов, наблюдаемые эпигенетические модификации могут быть ассоциированы с выявляемыми дефектами развития и нестабильностью генома у потомков облученных родителей [20]. В эксперименте на Arabidopsis thaliana в результате воздействия γ-излучения (30 и 110 мГр/ч)у представителей всех трех поколений растений (родительское поколение — ранее не экспонированные растения, особи поколений 1 и 2 — потомки облученных родителей) наблюдалось увеличение числа ДМР, причем во второй генерации рассматриваемые изменения были наиболее выражены. По мнению авторов, полученные результаты могут указывать на роль метилирования ДНК в регуляции генов, ассоциированных с развитием и различными стрессовыми реакциями, в ответ на воздействие радиации, и обеспечивают адаптацию растений в течение нескольких поколений [21].

В последние годы активно обсуждаются модификации метилирования генома как молекулярного механизма гормезиса при воздействии генотоксических факторов в низких дозах и концентрациях. Они имеют место наряду с такими процессами как модуляция транскрипционного фактора Nrf2, активирующего синтез глутатиона, изменения экспрессии микроРНК и т. д. [22]. Очевидно, что индукция защитного ответа клетки на облучение должна быть ассоциирована с генерализованными изменениями метилирования ДНК. Нами же в отдаленный период после экспонирования выявлено гиперметилирование отдельных CpG-динуклеотидов CpG-стровков промоторов ряда генов, затрагивающее малую фракцию клеточной популяции облученного организма. Так как эти эпигенетические модификации характеризуются зависимостью от дозы и ассоциированы с уровнем цитогенетических нарушений хромосомного типа, поэтому преимущественно является результатом повреждающего действия радиации на молекулы клетки (мишенные и немишенные эффекты облучения) [6–8, 12].

Заслуживает внимания, что сопряженность общей частоты аберраций хромосом (хроматидные + хромосомные) не только с метилированием генов, но и с возрастом оказалась невысокой, но значимой. Эта обратная корреляционная связь обусловлена вкладом аберраций хроматидного типа, уровень которых таким же образом ассоциирован с возрастом. Хотя этот факт объяснить пока сложно, не исключено, что речь идет о проявлениях радиационно-индуцированной нестабильности генома, для которой характерны простые аберрации хромосом, в первую очередь одиночные хроматидные фрагменты и наибольшая выраженность в молодом организме [13]. Наша выборка состояла из облученных лиц, чем моложе они были на момент обследования, тем в более раннем периоде онтогенеза имело место радиационное воздействие.

Вопрос относительно специфичности выявленного гиперметилирования ряда генов для радиационного воздействия остается открытым. Здесь следует подчеркнуть, что мы обследуем людей, заведомо зная о присутствии у них в анамнезе перенесенного облучения, а не выборку индивидов, произвольно отобранную из общей популяции и изученную на предмет наличия у них цитогенетических/эпигенетических нарушений.

В обзоре [23] приводится анализ изменений метилома в клетках крови лиц, подвергшихся воздействию генотоксикантов (в основном химической природы) в результате профессиональной деятельности. К сожалению, авторам не удалось выявить специфические маркеры воздействия тех или иных генотоксических факторов, что объясняется многообразием спектра изученных “кандидатных” генов и самих токсических агентов, а также недостаточностью работ, посвященных длительному мониторингу изменений эпигенома.

В наших исследованиях гиперметилирование промоторов локусов p16/INKA и GSTP1 высоко значимо ассоциировано с радиационным воздействием, что верифицировано на двух тестовых выборках обследованных индивидов [6–8]. В экспериментах на мышах показано индуцированное рентгеновским излучением гиперметилирование CpG-островка гена p16/INKA в клетках желудочно-кишечного тракта, но не p19/ARF. Абсолютно обратная ситуация наблюдается при введении животным нитрозометилмочевины и/или инфицирования их Helicobacter felis H. Felis: эпигенетическая модификация выявлена только у гена p19/ARF. Таким образом, исследователи наблюдали дифференциальный характер метилирования генов p16/INK4A и p19/ARF при воздействии разных канцерогенов [24].

В то же время рассматриваемые эпигенетические модификации этих генов, в первую очередь p16, выявлены в других работах у лиц, подвергшихся экспонированию различных факторов химической природы, причем эффекты носят разнонаправленный характер. Так, гиперметилирование p16 было ассоциировано с воздействием бензена [25], полициклических ароматических углеводородов [26], ультрадисперсных частиц РМ2.5 [27], cвинца [28, 29], каменноугольной смолы [30], никеля [31]. Повышенный уровень метилирования GSTP1 выявлен у лиц, подвергшихся действию пестицидов [32], но не свинца [28, 29]. Кроме того, в работе [33] показана сопряженность гипометилирования этого локуса с воздействием свинца в высоких концентрациях. Гипометилирование промотора гена p53 наблюдалось как результат воздействия полициклических ароматических углеводородов [34], а также частиц РМ2.5 [27]. Воздействие последних ассоциировано и с гипометилированием гена RASSF1A [27].

Хотя, судя по всему, ген клеточного цикла p16 является в наибольшей мере изученным по сравнению с другими локусами, нельзя исключать и его большую “уязвимость” к действию факторов не только радиационной, но и химической природы; отчетливо прослеживается преимущественно одинаковая направленность процесса его эпигенетической модификации при действии разных генотоксикантов.

Следует подчеркнуть, что в ряде вышеупомянутых работ индуцированные теми или иными генотоксикантами эпигенетические модификации генов, имеющие разную направленность, сопряжены с высокой поврежденностью генома (повышенные уровни микроядер, ДНК-аддуктов, укорочение длины теломер) [26, 29, 30, 34].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в отдаленный период после облучения в диапазоне малых и средних доз выявлена положительная ассоциативная связь между поврежденностью генома и гиперметилированием генов основных защитных систем клеток. Полученные данные могут указывать на общие закономерности в механизмах индукции и сохранении на протяжении многих лет рассмотренных генетических и эпигенетических эффектов радиации.

Хотя вопрос относительно специфичности выявленных эпигенетических нарушений именно для радиационного воздействия остается открытым, представляется важным включение в комплексную оценку отдаленных эффектов облучения исследования гиперметилирования промоторов генов с расширением спектра анализируемых локусов. В целом это даст возможность создать высокопрогностическую систему генетических/эпигенетических маркеров, имеющую значительную информативность не только в биоиндикации радиационного воздействия, но и в своевременном выявлении лиц с предикторами преждевременного старения и развития возраст-ассоциированных заболеваний.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа частично выполнена в рамках темы государственного задания Минобрнауки России “Механизмы генетических процессов у микроорганизмов, растений, животных и человека” (№ 122022600163-7), подтемы “Генотоксиканты и антигеноксиканты окружающей среды: маркеры отдаленного воздействия и генетические риски развития широко распространенных заболеваний”.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или Национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией статьи.

作者简介

Nina Kuzmina

N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences; N.N. Semyonov Federal Research Center for Chemical Physics, Russian Academy of Science

编辑信件的主要联系方式.
Email: nin-kuzmin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2441-0122
俄罗斯联邦, Moscow; Moscow

Nellya Lapteva

N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences

Email: nellya912@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0003-3385-5005
俄罗斯联邦, Moscow

Aleksandr Rubanovich

N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences

Email: rubanovich@vigg.ru
ORCID iD: 0000-0002-1251-8806
俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件