Pathomorphological Features of Lung Fibrosis in Individuals Occupationally Exposed to Alpha Radiation

Full Text

Легочный фиброз, развивающийся у работников, подвергшихся профессиональному воздействию α-активных аэрозолей трансурановых элементов (ЛФР), рассматривается как детерминированный эффект (тканевая реакция) [1–5]. Первый случай ЛФР был зарегистрирован в когорте работников Производственного объединения (ПО) “Маяк” [6].

Регистр ЛФР, включающий 188 случаев, подробно описан Т.В. Азизовой и соавт. [5]. Показано, что частота ЛФР в когорте работников ПО “Маяк” значительно возрастает с увеличением суммарной поглощенной в легких дозы внутреннего α-излучения от инкорпорированного плутония-239, и не зависит от дозы внешнего γ-излучения. В работах, в которых представлены результаты исследований эффектов профессионального облучения у работников ПО “Маяк” [5, 7–11], авторы отмечают, что основными преимуществами этой когорты являются длительный период наблюдения, индивидуальные измеренные дозы внешнего и внутреннего облучения, полная медицинская информация за весь период наблюдения и наличие биопрепаратов различных органов и тканей, собранных у 30٪ членов когорты (в том числе 35.2٪ работников с установленным диагнозом ЛФР), которые хранятся в Радиобиологическом репозитории тканей человека (РРТЧ) “Южно-Уральского института биофизики” Федерального медико-биологического агентства [12]. В последние десятилетия опубликовано много работ, посвященных когортным исследованиям работников ПО “Маяк”. В этих работах представлены доказательства связи раковых и нераковых эффектов как с внешним γ-облучением, так и с внутренним α-облучением [8–11, 13, 14]. Показаны статистически значимые зависимости не только для рака легкого, но и для хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) от суммарных поглощенных в легких доз внутреннего α-облучения [8, 15, 16]. Однако механизмы радиационно-индуцированных эффектов остаются пока неясными. Целью настоящего исследования являлся поиск морфологических особенностей радиационно-индуцированного пневмофиброза при сравнении с легочным фиброзом другого генеза, используя биологические образцы ткани легкого работников, подвергшихся внутреннему альфа-облучению.

Материалы и методика

Для изучения морфологических особенностей ЛФР в РРТЧ на основе данных, содержащихся в медико-дозиметрической базе данных “Клиника” [7] идентифицированы биологические образцы ткани легкого (формалин-фиксированные парафиновые блоки (ФФПБ)) у 125 работников ПО “Маяк”. Образцы были разделены на три группы: 1-ю группу составили 56 случаев с ЛФР, 2-ю группу — 34 случая с пневмофиброзом нелучевого генеза, в основном в исходе хронических воспалительных заболеваний легких (не-ЛФР); 3-ю группу — 35 случаев без легочной патологии (БЛП). Следует отметить, что все перечисленные диагнозы были установлены у работников при жизни и подтверждены после проведения аутопсийного исследования. ЛФР был диагностирован у работников, не имевших в анамнезе хронических заболеваний легких или сердца, на основании клинических симптомов и признаков, результатов физикального и рентгенологического обследований (простая рентгенография в двух проекциях и крупнофокусная рентгенография апикальной области и межреберье I–II), лабораторных исследований, исследования функции внешнего дыхания (жизненная емкость легких, мощность вдоха и выдоха, число дыхательных движений и число сердечных сокращений в минуту, диффузионная способность легких, сопротивление дыханию и др.).

Для классификации тяжести повреждения легочной паренхимы использовались критерии оценки легочного фиброза на основе шкалы Эшкрофта [17], модифицированной Хубнером [18]. Критерием включения в исследование принимался легочный фиброз 3-й степени и выше по шкале Ashcroft-Hubner. Для этой степени характерно умеренное утолщение альвеолярных или бронхиолярных стенок без явного повреждения легочной архитектоники.

Дополнительно к оценке степени выраженности легочного фиброза проводилось определение выраженности микроскопических признаков сопутствующих эмфизематозных изменений путем подсчета индекса респираторных бронхиол (ИРБ) [19]. Для этого измерялось соотношение между глубиной альвеол и поперечным сечением проводящего отдела бронхиол. Если Q — поперечное сечение респираторной бронхиолы вместе с альвеолами, X — ширина проводящего отдела, а Y — глубина альвеолы, то Q =Х + 2У. Отсюда ИРБ рассчитывался как

ИРБ = X / 2Y. (1)

Основные характеристики изучаемых групп работников представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Основные характеристики изучаемых групп работников

Table 1. Main characteristics of the studied groups of workers

Характеристика	Группа 1 (ЛФР, n = 56)	Группа 2 (не-ЛФР, n = 34)	Группа 3 (БЛП, n =35)
Доля работников, нанятых до 1960 года, абс. (%)	56 (100.00%)	34 (100.00%)	35 (100.00)
Доля работников, когда-либо работавших на радиохимическом заводе, но никогда не работавших на плутониевом заводе, абс. (%)	4 (7.14%)	20 (58.83%)	25 (71.43)
Доля работников, когда-либо работавших на плутониевом заводе, абс. (%)	52 (92.86%)	6 (17.64%)	2 (5.71)
Доля лиц с измеренной α-активностью плутония в моче, абс. (%)	49 (87.50%)	33 (97.06%)	31 (88.57)
Возраст на момент смерти, лет	60.04 ± 9.20	63.50 ± 10.02	59.37 ± 6.23
Возраст на момент найма, лет Age at hire, years	27.25 ± 6.15	28.97 ± 6.67	25.74 ± 4.92
Продолжительность работы, лет	24.83 ± 7.56	24.73 ± 6.31	28.08 ± 7.08
Поглощенная в легком доза внешнего γ-излучения, Гр	1.27 ± 0.62	1.49 ± 0.72	1.46 ± 0.70
Поглощенная в легком доза внутреннего α-излучения, Гр	5.13 ± 4.77	0.16 ± 0.18	0.15 ± 0.22
Примечание. ЛФР — легочный фиброз; БЛП — без легочной патологии; Mean ± St. Dev обозначает среднее значение ± стандартное отклонение.

 

Следует отметить, что суммарные поглощенные в легких дозы внешнего γ-излучения статистически значимо не различались между изучаемыми группами, а суммарные поглощенные в легких дозы внутреннего α-излучения, были значительно выше у работников с ЛФР (р < 0.05).

Гистологическая обработка материала

Резецированные при аутопсии фрагменты легочной ткани фиксировали в 10٪-ном нейтральном буферезированном формалине 24 ч, затем заливали в парафиновые блоки [20]. Из ФФПБ легких готовили срезы толщиной 5 мкм. Для обзорной микроскопии срезы легких окрашивали гематоксилином и эозином в соответствии со стандартным протоколом [21].

Определение соединительно-тканного каркаса легочной ткани

Для определения соединительно-тканного каркаса легочной стромы и очагов пневмофиброза срезы окрашивали, используя следующие методы [21]: ван Гизона (выявление общего объема коллагеновых волокон); Гомори (выявление ретикулиновых волокон легочной стромы), Вейгерта (выявление эластических волокон легочной стромы). Для идентификации клеточных и стромальных гликопротеинов в структурах легких проводили ШИК-реакцию с постановкой контрольных реакций, использовали альциановый синий (при рН 2.5).

Иммуногистохимическое исследование

Во всех 125 случаях было проведено морфологическое изучение биологических образцов с применением метода иммуногистохимии (ИГХ).

Для определения элементов внеклеточного матрикса (ВКМ) были использованы моно- и поликлональные меченые антитела против коллагена I типа, коллагена IV типа, коллагена V типа. Кроме того, для оценки системы регуляции метаболизма ВКМ были использованы антитела против матриксных металлопротеиназ MMP-2, MMP-9, тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ TIMP-1, TIMP-2. Список использованных клонов антител и их разведения приведены в табл. 2.

 

Таблица 2. Антитела, использованные для иммуногистохимического исследования

Table 2. Antobodies used for the immunohistochemistry examination

Антитело	Клон	Рабочее разведение	Производитель	Каталожный номер
Collagen type I	N.A.	1:100	Abbiotec, USA	251221
Collagen type IV	CIV22	1:100	Cell Marque, USA	239M-16
Collagen type V	N.A.	1:100	Abbiotec, USA	251202
Cytokeratin Cocktail (AE1&AE3)	AE1&AE3	1:200	Cell Marque, USA	313M-16
MMP-2	N.A.	1:250	Epitomics, USA	1842-1
MMP-9	EP1254	1:250	Epitomics, USA	2551-1
TIMP-1	N.A.	1:500	Abbiotec, USA	250883
TIMP-2	N.A.	1:500	Abbiotec, USA	250884
Примечание: N.A. — недоступно или были использованы поликлональные антитела.

 

На первом этапе срезы депарафинировали по стандартной методике: в трех сменах о-ксилола по 10 мин; в трех сменах 95٪-ного этанола по 5 мин; в двух сменах дистиллированной воды по 5 мин. После депарафинирования производили ингибирование эндогенной пероксидазы с помощью 3٪-ного раствора перекиси водорода.

На втором этапе производили демаскировку антигенов путем кипячения предметных стекол с тканевыми срезами в цитратном буфере (рН — 6.0) и буфере ТРИС-ЭДТА (рН — 9.0) в течение 30 мин на водяной бане. Далее срезы охлаждали 30 мин при комнатной температуре и промывали в фосфатно-солевом буфере (pH 7.4). Для иммунного окрашивания использовали пероксидазный метод с полимерной системой детекции (Histofine® SimpleStain MAX PO MULTI, Япония). Срезы инкубировали с моно- и поликлональными антителами во влажной камере 60 мин при температуре 37°С. Во всех случаях проводили дополнительное окрашивание ядер гематоксилином Майера в течение 0.5–2 мин. Контрольные реакции выполняли без первичных специфических антител.

Цифровая визуализация и количественная морфометрическая оценка

Морфометрическое исследование проводилось в соответствии с методикой, описанной в предыдущих работах [22]. Все микропрепараты были проанализированы двойным слепым методом. Количественная оценка результатов ИГХ была основана на микрофотографиях образцов легочной ткани, оцифрованных комплексной системой для микрофотографии, состоящей из микроскопа Сarl Zeiss Axioskop 40, цифровой камеры Jenoptik ProgRes CT3 (Jenoptik Group, Германия), персонального компьютера на базе Intel® Core™ i7, программного обеспечения ProgRes CapturePro 2.5. Захват изображения был выполнен с общим увеличением ×200 (10 для окуляра, 20 для объектива) и ×400 (10 для окуляра, 40 для объектива) при полностью закрытой апертурной диафрагме и приподнятом конденсоре. Время экспозиция составляло 4.11 мс, изображения сохранялись в виде jpeg-файлов с разрешением 1024×768 пикселей.

Изображения паренхимы легкого были отобраны случайным образом. Участки, содержащие дефекты тканей, дефекты окрашивания и артефакты, исключались. В каждом случае было захвачено не менее 10 полей изображений среза. Морфометрические оценки гистологических и ИГХ наблюдений были выполнены для каждого из 10 полей зрения с большим увеличением (площадь поля 0,25 мм²) [23]. Таким образом, были обработаны образцы легочной ткани всех 125 доноров.

Анализ цифровых изображений использовался для количественной оценки морфологических изменений в ткани легкого. Количественное исследование проводили с помощью программы компьютерного анализа изображений “Морфология 5.1” (ВидеоТест, Россия). Окрашенные структуры (коллагеновые, ретикулярные и эластические волокна, а также продукты окрашивания ИГХ реакций) автоматически классифицировались программой на 10 каналов в зависимости от цвета и интенсивности окрашивания. После классификации на исследуемые структуры накладывались псевдоцветные маски (рис. 1) [22].

 

Рис. 1. Использование псевдоцветных масок над изображениями, подчеркивающими экспрессию MMP-9 в эндотелии сосудов и волокнистых элементах легочной стромы, для количественного определения содержания металлопротеиназы в срезе легочной ткани.

Fig. 1. The use of pseudocolor masks above images highlighting MMP-9 expression in vessel endothelium and lung fiber components of the lung stroma for quantification of metalloproteinase content in a lung tissue section.

 

Относительную плотность изучаемых структур рассчитывали по отношению к общей площади исследуемого кадра (мкм²/мкм²), аналогично ранее описанной в [24] методике, выраженную в объемных процентах (об. ٪).

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных производили с использованием пакета прикладных программ “STATISTICA”. В расчетах использовали метод наименьших квадратов для определения параметров нелинейных моделей [25, 26]. Для аппроксимации эмпирических данных использовали модель Вейбулла [27].

Распределение положительных результатов окрашивания исследуемых элементов соединительного каркаса легочной стромы и очагов пневмофиброза, а также внеклеточного матрикса (в объемных процентах от общего объема образца, об. ٪) описывали с помощью функции распределения Вейбулла — F(x):

$F\left(x\right)=1-\exp \left[-\ln 2{\left(\frac{X}{X_{50}}\right)}^V\right],$ (2)

здесь X — объемные проценты (об. ٪) для конкретного показателя, X₅₀ — медианное значение этого показателя, V — параметр формы.

В настоящем исследовании, помимо функции распределения Вейбулла, как дополнительную количественную характеристику использовали плотность распределения – f(x):

$f\left(x\right)=\frac{V\ln 2}{X_{50}}\cdot {\left(\frac{X}{X_{50}}\right)}^{V-1}\cdot \exp \left[-\ln 2{\left(\frac{X}{X_{50}}\right)}^V\right],$ (3)

которая является производной величиной f(x) = F′(x).

Статистически значимыми считали различия при уровне p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Легочный фиброз развивается в межклеточном веществе. Межклеточное вещество состоит из аморфного основного вещества (несульфатированные и сульфатированные мукополисахариды) и волокон (коллагеновых, ретикулярных и эластических).

Исследование образцов 1-й группы показало, что очаги легочного фиброза наблюдались в большем количестве случаев в периферических (“плащевых”) отделах легочной ткани. При этом очаги поражения представляли обширные очаги, сливающиеся в поля, грубой фиброзной ткани. Между описанными зонами поражения определялись прослойки сохранившейся легочной респираторной ткани. В легочной ткани всех исследованных случаев 1-й группы определялся в разной степени выраженности реактивно воспалительный инфильтрат. При обзорной микроскопии в составе инфильтрата определялись лимфоциты, плазматические клетки, сегментоядерные нейтрофилы и гистиоциты.

Участки легочного фиброза в микропрепаратах 2-й группы располагались преимущественно в легочной ткани вокруг бронхов и сосудов. Сохранившаяся респираторная ткань в большинстве препаратов 2-й группы определялась в большем объеме по сравнению с препаратами 1-й группы, а гистоархитектоника легких 2-й группы была менее изменена. Склероз в образцах 2-й группы был преимущественно ретикулярным, в то время как склероз в образцах 1-й группы был крупноочаговым. Так же, как и в 1-й группе, во 2-й группе все образцы демонстрировали полиморфноклеточный воспалительный инфильтрат различной выраженности; состав воспалительного инфильтрата в препаратах обеих групп был сходным.

В микропрепаратах 3-й группы (контроль) очагов пневмосклероза не наблюдалось. В соединительно-тканной строме легкого в 3-й группе преобладали ретикулярные волокна, а не коллагеновые, как в 1-й и 2-й группах. Ретикулярный каркас стромы легких в образцах 3-й группы практически не изменялся. Клеточная инфильтрация в образцах контрольной группы наблюдалась очень редко и содержала отдельные лимфоцитарные и гистиоцитарные элементы.

При анализе структурных компонентов соединительной ткани в препаратах обеих групп с фиброзом обнаружены статистически значимые различия почти всех исследованных показателей (за исключением экспрессии MMP-2). Общая выраженность легочного фиброза более всего определялась в микропрепаратах 1-й группы; общий объем пораженной фиброзом легочной ткани в препаратах 1-й группы был выше на 40٪ по сравнению с группой контроля. Выраженность сопутствующей эмфиземы по результатам измерения ИРБ наиболее представлена в группе не-ЛФР. Также в 1-й и 2-й группах выявлено снижение плотности ретикулярной стромы; однако количество ретикулярных волокон в образцах не-ЛФР было незначительно уменьшено.

Следует отметить, что повышенное содержание эластических волокон наблюдалось как в образцах ЛФР, так и в образцах не-ЛФР. Однако архитектоника эластических волокон образцов была существенно изменена: эластические волокна деформировались, их толщина была неоднородной, и они часто были утолщены. Тем не менее никаких отличительных особенностей не наблюдалось ни в структуре, ни в содержании ретикулярных/эластических волокон в образцах 1-й и 2-й групп.

Для различения соединительно-тканных и эпителиальных структурных элементов проводили ИГХ определение белков цитоскелета цитокератинов, содержащихся в клетках альвеолярного и бронхиального эпителия.

Коллагены типов I и V выявлялись преимущественно в стенках легочных сосудов, тогда как в очагах легочного фиброза преобладал коллаген типа IV (рис. 2). Уровень экспрессии коллагена типа I в образцах с фиброзом тканей исследуемых групп существенно не различался. То же самое наблюдалось для коллагена типа IV, в то время как уровень коллагена типа V был значительно выше в образцах ЛФР. В контрольной группе коллагены типов I и V обнаруживались только в стенках легочных сосудов, а коллаген типа IV можно было наблюдать в базальных мембранах альвеол и бронхиол. Статистически значимые различия между 1-й и 2-й группами обнаружены по коллагену типа V (p < 0.05); его объем в легочной ткани был значительно больше в образцах ЛФР по сравнению с образцами не-ЛФР. Статистическое сравнение 1-й и 3-й групп выявило статистически значимые различия в общем количестве коллагена, эластических волокон, эпителиальных структур и коллагена типа V (табл. 3).

 

Рис. 2. Экспрессия коллагенов типов I, IV и V при ЛФР и не-ЛФР. Иммуногистохимический метод с антителами против Collagen type I, Collagen type IV, Collagen type V полимерная тест-система. Увеличение ×50. Маркер 500 μm. ЛФР и ППФ — радиационный легочный фиброз, не-ЛФР — нерадиационный легочный фиброз, ГС — группа сравнения (не-ЛФР).

Fig. 2. Expression of collagens type I, IV and V in LF and non-LF specimens. Immunohistochemistry with antibodies against Collagen type I, Collagen type IV, Collagen type V, polymer test-system. Magnification ×50. Scale 500 μm. LF and ППФ denotes plutonium-induced lung fibrosis, non-LF denote lung fibrosis of a different origin, ГС denotes control (no pulmonary pathology).

 

Таблица 3. Описательные характеристики образцов легочной ткани (об%) изучаемых групп

Table 3. Descriptive characteristics of lung tissue specimens (Vol%) of the studied groups

Показатель, об%	Статистические характеристики
	n	Mean	Med	Min	Max	LQ	UQ	Var	St.dev
Общий объем коллагеновых волокон	56 34 35	13.185** 10.984 9.529	12.234 10.837 8.626	2.284 2.999 3.195	30.532 18.745 20.663	8.446 8.798 6.259	17.106 12.999 11.422	41.834 14.550 16.609	6.468 3.814 4.075
Ретикулиновые волокна	56 34 35	8.791 7.195 9.311	7.960 7.525 9.061	1.124 0.644 1.115	22.729 17.651 16.404	5.142 2.266 5.585	10.957 9.992 12.196	22.435 22.397 15.918	4.737 4.732 3.989
Эластические волокна	56 34 35	8.623** 7.207 6.514	7.677 7.305 5.991	2.245 2.689 1.680	21.738 13.049 14.690	5.529 5.387 4.326	10.519 8.194 7.990	20.278 7.676 7.800	4.503 2.771 2.793
Эпителиальные структуры	56 34 35	4.363** 4.039 5.627	3.318 3.678 5.608	0.488 0.959 0.716	14.217 9.167 13.194	2.190 2.549 2.689	6.456 4.890 7.681	9.299 4.108 9.695	3.049 2.027 3.114
Collagen type I	56 34 35	2.160 1.851 7.428	2.058 1.777 7.184	0.204 0.364 1.666	6.616 3.674 13.703	0.927 1.106 4.804	3.026 2.529 10.344	2.065 0.905 9.755	1.437 0.951 3.123
Collagen type IV	56 34 35	7.511 9.000 2.485	7.309 8.121 1.856	1.015 2.454 0.117	17.319 33.131 7.123	4.691 5.297 1.294	9.789 11.244 3.926	12.142 29.911 3.252	3.484 5.469 1.803
Collagen type V	56 34 35	3.099*,** 1.891 2.235	2.600 1.415 1.775	0.594 0.347 0.084	7.624 5.574 6.367	1.780 1.013 0.888	4.319 2.618 3.522	3.055 1.544 2.531	1.748 1.243 1.591
MMP-2	56 34 35	0.999* 2.473 1.199	0.998 1.413 0.837	0.091 0.156 0.067	4.356 9.088 4.636	0.247 0.527 0.484	1.518 3.403 1.762	0.924 6.585 1.210	0.961 2.566 1.099
MMP-9	56 34 35	5.390 5.097 1.036	4.729 4.171 0.857	1.508 0.573 0.068	15.905 13.934 3.571	3.197 3.304 0.525	7.106 6.545 1.466	8.659 9.545 0.582	2.942 3.089 0.763
TIMP-1	56 34 35	0.770* 1.390 0.746	0.534 0.872 0.645	0.023 0.217 0.176	3.043 8.080 2.031	0.308 0.599 0.384	1.087 1.526 0.913	0.456 2.279 0.255	0.675 1.510 0.504
TIMP-2	56 34 35	1.217* 0.668 0.695	0.935 0.568 0.614	0.101 0.110 0.056	3.421 2.149 1.815	0.461 0.402 0.314	1.967 0.817 0.872	0.793 0.190 0.244	0.891 0.436 0.494
ИРБ	56 34 35	1.274* 1.500 1.077	1.255 1.410 1.090	0.460 0.610 0.750	2.580 2.600 1.390	1.015 1.190 1.000	1.545 1.850 1.190	0.156 0.221 0.027	0.395 0.470 0.164
Примечание. Изучаемые группы: 1-я группа (n = 56), 2-я группа (n = 34) и 3-я группа (контроль) (n = 35). * Статистически значимое различие средних (p < 0.05) между 1-й и 2-й группами; ** cтатистически значимое различие средних (p < 0.05) между 1-й и 3-й группами.

 

Экспрессия матриксных металлопротеиназ MMP-2 и MMP-9 выявлялась в клеточной цитоплазме, преимущественно в элементах воспалительного клеточного инфильтрата. Кроме этого, экспрессия металлопротеиназ в различной степени обнаруживалась в структурах ВКМ, в том числе в эндотелии сосудов и волокнистых элементах легочной стромы (рис. 3). При этом во 2-й группе содержание MMP-2 и ТИМР-1 значительно преобладало над содержанием соответствующих показателей 1-й группы (табл. 3).

 

Рис. 3. Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов при ЛФР и не-ЛФР. Иммуногистохимический метод с антителами против MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, полимерная тест-система. Увеличение ×400. Маркер 50 μm. ЛФР и ППФ — радиационный легочный фиброз, не-ЛФР — нерадиационный легочный фиброз, ГС — группа сравнения (не-ЛФР).

Fig. 3. Expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in LF and non-LF specimens. Immunochistochemistry with antibodies against MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, the polymer test-system. Magnification ×400. Scale 50 μm. LF and ППФ denote plutonium-induced LF, non-LF denote lung fibrosis of a different origin, ГС denotes controls (no pulmonary pathology).

 

Тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ TIMP-1 и TIMP-2 выявлялись в клеточной цитоплазме клеток воспалительного инфильтрата стромы, преимущественно макрофагов и нейтрофилов, а также в структурах ВКМ. Содержание ингибиторов металлопротеиназы TIMP-2 в образцах 1-й группы превалировало над образцами 2-й группы, содержание TIMP-1, напротив, показывало обратную картину (табл. 3).

Модель Вейбулла хорошо согласовывалась с эмпирическими данными (коэффициенты детерминации в обеих группах варьировали от 0.95 до 0.99) (табл. 4).

 

Таблица 4. Параметрические характеристики распределений при аппроксимации моделью Вейбулла показателей в 1-й и 2-й группах

Table 4. Parameter characteristics of distributions in the approximation of indicators estimated for groups 1 and 2 using the Weibull’s model

Показатель	Характеристики W-model						Значимость различий
	Группа 1 (n = 56)			Группа 2 (n = 34)			Модуль Me	Уровень значимости	Модуль V	Уровень значимости
	Me ± ∆	V ± ∆V	R2	Me ± ∆Me	V ± ∆V	R2	|Me1–Me2|	P	|V1– V2|	P
Общий объем коллагеновых волокон	12.331 ± 0.050	2.172 ± 0.030	0.997	10.872 ± 0.068	3.153 ± 0.0114	0.989	1.459	<10-4	0.981	<10-4
Ретикулиновые волокна	8.004 ± 0.042	2.156 ± 0.040	0.994	6.213 ± 0.224	1.259 ± 0.086	0.954	1.791	<10-4	0.897	<10-4
Эластические волокна	7.640 ± 0.057	2.353 ± 0.065	0.986	6.892 ± 0.062	3.084 ± 0.154	0.980	0.748	<10-4	0.731	<10-4
Эпителиальные структуры	3.587 ± 0.042	1.493 ± 0.039	0.986	3.658 ± 0.025	2.271 ± 0.056	0.993	0.071	0.291	0.778	<10-4
Collagen type I	7.113 ± 0.031	2.297 ± 0.034	0.996	7.967 ± 0.057	2.259 ± 0.054	0.993	0.854	<10-4	0.038	0.532
Collagen type IV	1.860 ± 0.017	1.458 ± 0.030	0.992	1.695 ± 0.013	1.916 ± 0.044	0.994	0.165	<10-4	0.458	<10-4
Collagen type V	2.740 ± 0.023	1.750 ± 0.038	0.990	1.573 ± 0.025	1.606 ± 0.062	0.982	1.167	<10-4	0.144	0.038
MMP-2	0.650 ± 0.014	0.878 ± 0.024	0.983	1.477 ± 0.035	0.928 ± 0.030	0.987	0.827	<10-4	0,.050	0,200
MMP-9	4.80 ± 0.040	2.018 ± 0.053	0.987	4.424 ± 0.060	1.804 ± 0.070	0.984	0.377	<10-4	0.214	0,016
TIMP-1	0.559 ± 0.006	1.175 ± 0.025	0.991	0.926 ± 0.016	1.511 ± 0.066	0.982	0.367	<10-4	0.335	<10-4
TIMP-2	0.967 ± 0.011	1.169 ± 0.022	0.992	0.571 ± 0.006	1.865 ± 0.063	0.989	0.396	<10-4	0.696	<10-4
ИРБ	1.254 ± 0.003	4.057 ± 0.059	0.996	1.457 ± 0.011	3.732 ± 0.174	0.978	0.203	<10-4	0.325	0.039
Примечание. Статистически значимое различие параметров распределений (Me и V) в 1-й и во 2-й группах оценивалось с помощью двухстороннего t-критерия Стьюдента.

 

Анализ кумулятивных кривых показал, что параметры распределения (медиана и параметр формы) значимо различались между группами для всех исследуемых показателей, за исключением медианного объема (об. ٪) эпителиальных структур и параметра формы модели для коллагена типа IV (табл. 4). Особенно обращает внимание, что суммарные кривые распределения объемной доли (٪) коллагена типа V, значительно различались по медианным значениям (рис. 2) и параметрам формы модели Вейбулла между образцами ЛФР и не-ЛФР.

Результаты анализа корреляционных взаимосвязей изучаемых параметров выявили в 1-й группе (ЛФР) положительную корреляционную связь умеренной степени между суммарной поглощенной в легких дозой внутреннего α-облучения и огрубением тонкого ретикулярного легочного каркаса (r = 0.34; p = < 0.05), а также отрицательную корреляционную связь умеренной степени с экспрессией коллагена типа V (r = -0.33; p < 0.05). Во 2-й группе была выявлена положительная корреляционная связь умеренной степени между суммарной поглощенной в легких дозой внутреннего α-облучения и экспрессией коллагена типа V имела характер (r = 0.53; p < 0.05).

В результате регрессионного анализа выявлены статистически значимые линейные зависимости указанных выше показателей. В 1-й группе (ЛФР) выявлена статистически значимая положительная зависимость уровня экспрессии ММР-9 от уровня экспрессии TIMP-1 (MMP-9 = (4.117 ± 0.559) + (1.653 ± 0.549)). В свою очередь, экспрессия TIMP-1 прогрессивно уменьшалась с увеличением суммарной поглощенной в легких дозы внутреннего α-излучения (TIMP1 = (1.256 ± 0.196) – (0.385 ± 0.139)).

Дополнительные расчеты с помощью моделей нелинейного регрессионного анализа не дали положительных результатов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее неоднократно было показано, что условия труда в первые годы работы ПО “Маяк” (1948–1958 гг.) были крайне неблагоприятными [28]. Невозможность обеспечения полной герметизации технологического оборудования, частые ремонты, монтажно-демонтажные работы, низкий уровень автоматизации привели к высоким уровням α-активных аэрозолей в воздухе производственных помещений. Поскольку средства индивидуальной защиты органов дыхания на ПО “Маяк” не использовались до 1960-х годов, значительное количество α-активных частиц попадали в организм работников, преимущественно ингаляционным путем, накапливаясь в органах основного депонирования (легкие, печень и скелет) [3, 29].

Большое количество α-треков и их агрегатов («солнечных вспышек») в рубцах соединительной ткани при авторадиографии регистрировали у работников с ЛФР, а единичные α-треки в периваскулярной и перибронхиальной тканях и во внутрилегочных лимфатических узлах — у работников с пневмофиброзом другого генеза (не-ЛФР) [30].

Исследования распределения плутония в организме работников ПО “Маяк”, основанные на анализе биологических образцов тканей легких, показали, что большая часть α-активности депонируется в легких и трахеобронхиальных лимфатических узлах [3, 30, 31].

В литературе описаны случаи и патогенез пневмонита и легочного фиброза после лучевой терапии [4, 29, 32–34]. Патогенез легочного фиброза вследствие воздействия альфа-излучения также всесторонне изучался в экспериментах на животных [15, 35, 36]. Изменения, произошедшие на ранней стадии развития ЛФР, включали инфильтрацию очагов фиброза мононуклеарными клетками, окружающими альвеолы, альвеолярные протоки и бронхиолы; повышение уровня клеток альвеолярного эпителия типа II и накопление экссудата. В дальнейшем наблюдались скопления гистиоцитов, поглощающих экссудативный выпот. Имелось значительное утолщение альвеолярных перегородок за счет отека; образование соединительной ткани; и накопление тучных, плазматических и альвеолярных клеток. Разрастание соединительной ткани вокруг альвеол представляет собой морфологическую основу ЛФР [4, 29, 37]. Показано, что общий объем соединительной ткани в образцах легких при ЛФР увеличен на 40٪ по сравнению с тканями легких без очагов легочного фиброза [38]. По мнению исследователей, макрофаги по-прежнему остаются основными клетками-мишенями в легочной ткани при воздействии α-излучения от инкорпорированного плутония, независимо от физико-химических свойств соединений плутония и, вероятно, играют ведущую роль в развитии раннего повреждения легочной ткани [37].

Динамическое наблюдение за работниками ПО “Маяк” позволило выявить профессиональные заболевания (в том числе реакции легочной ткани) на ранних стадиях их развития [8, 9, 1, 2].

Отложение белков ВКМ, таких как коллагены, со структурными искажениями, утолщением альвеолярных стенок и перибронхиолярным и субплевральным фиброзом являются отличительными признаками легочного фиброза. Во время процесса рубцевания баланс между синтезом и деградацией ВКМ смещается в сторону повышенного синтеза, опосредованного факторами роста, включая TGF-b1. Помимо увеличения продукции коллагена фибробластами, TGF-b1 может также способствовать отложению коллагена в легких за счет подавления секреции ММР или стимуляции секреции ее ингибиторов, за счет усиления пролиферации и миграции фибробластов, за счет секреции факторов роста (например, тромбоцитарный фактор роста), или путем индукции эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) [39].

В настоящем исследовании использованы биологические образцы тканей легких (взятые при аутопсии) работников ПО “Маяк”, которым был поставлен клинический диагноз ЛФР прижизненно, и сравнивали их с образцами тканей легких работников с диагнозом “не-ЛФР” (по результатам аутопсии). Выявлено снижение плотности ретикулярной стромы (коллаген III типа) в обеих исследуемых группах с фиброзом. В то же время очаги ЛФР и не-ЛФР демонстрировали повышенное содержание эластических волокон; при этом их структура была изменена. Никаких отличительных особенностей ни в структуре, ни в составе ретикулярных и эластических волокон не наблюдалось ни в одной из исследуемых групп. Таким образом, сравнительный анализ показал, что изменения соединительнотканного каркаса легких, индуцированные ЛФР, не отличаются от соответствующих изменений, обусловленных легочным фиброзом другой этиологии.

Однако статистический анализ выявил качественные и количественные отличительные морфологические особенности ЛФР по сравнению с не-ЛФР. Результаты статистического анализа подтвердили вывод о том, что ЛФР представляет собой особый тип легочного фиброза с гиперпродукцией коллагена типов IV и V, которые играют ключевую роль в развитии фиброза. В отличие от легочного фиброза, вызванного внутренним α-излучением от инкорпорированных радионуклидов, легочный фиброз, развившийся в результате исхода хронических заболеваний легких, характеризуется сходными уровнями коллагенов типов в I, IV и V фиброзных очагах.

TGF-b1 играет важную роль в развитии легочного фиброза. Повышенная экспрессия TGF-b1 приводит к рекрутированию моноцитов и макрофагов в очаг воспаления, усиливает созревание и активацию фибробластов и стимулирует ЭМП. Сообщалось, что хроническое радиационно-индуцированное поражение легких увеличивает экспрессию и активацию TGF-b1, что приводит к истощению паренхиматозных клеток и избыточному фиброзу [40]. ЭМП играет важную роль в опосредованном TGF фиброгенезе [41]. Результаты этого исследования позволяют предположить, что хроническое воздействие α-активных нуклидов на легочную ткань индуцирует опосредованную TGF-b1 выработку коллагена типа V при формировании очагов ЛФР. Между тем не-ЛФР, в основном вызванный хроническим воспалением, не демонстрирует повышенных уровней какого-либо определенного типа коллагена в пораженных фиброзом тканях.

Коллаген V типа имеет второстепенное значение, дополняя коллаген типа I, который является основным коллагеном тканей легких. В здоровых легких коллаген типа V расположен в периваскулярной и перибронхиальной соединительной ткани [42, 43]. Коллаген типа V продуцируется в различных мезенхимальных клетках, и экспрессия его генов опосредована TGF. Сообщалось, что коллаген типа V участвует в развитии легочного фиброза вследствие аутоиммунных заболеваний, опосредованных Т-хелперами (Th17), системного склероза [44, 45]. Нарушение регуляции коллагена V типа во время ремоделирования внеклеточного матрикса может объяснить измененную архитектуру фибриллярных коллагенов в интерстиции легких, выступающих в качестве критического промотора легочного фиброза. Активация коллагена типа V наблюдалась при карциномах кожи, раке молочной железы и колоректальном раке [46].

Коллаген типа I является основным фибриллярным компонентом ряда тканей. Скорость резорбции и продукция коллагена типа I увеличиваются примерно в равной степени у пациентов с диагнозом рака легкого, а стимулированный опухолевыми клетками лизис коллагена типа I сопровождается усиленной выработкой того же типа коллагена в тканях легких [47]. Коллаген типа I образует толстые коллагеновые волокна, что было выявлено гистологически, и составляет основную часть коллагена в организме. Этот тип составляет большую часть органической матрицы оснований, но также является основным структурным белком в легких.

Коллаген типа IV был охарактеризован в структурах, идентифицированных морфологически как базальные мембраны. Общепризнано, что коллаген типа IV не образует волокон или фибрилл, видимых при световом микроскопическом исследовании. Кроме того, сообщалось о роли коллагена типа IV в развитии рака легкого [48].

Изменения ВКМ наблюдались в исследованиях легочного фиброза, индуцированного ХОБЛ, идиопатического легочного фиброза и экспериментальных моделей фиброза, индуцированного блеомицином. Во всех исследованиях было выявлено ремоделирование легочной паренхимы с изменением соотношения коллагенов типов I / III [49–55].

В настоящем исследовании мы наблюдали повышенное содержание коллагена V типа в очагах ЛФР по сравнению с не-ЛФР. В целом наблюдаемые структурные изменения паренхимы легкого в группе не-ЛФР согласуются с результатами других исследований.

Матриксные металлопротеиназы MMP-2 и MMP-9 по своему биологическому действию являются желатиназами и имеют точкой приложения своего воздействия коллаген типа IV и денатурированный коллаген [56]. В литературе отводится большая роль воздействию MMP в развитии пневмосклероза различного генеза, в том числе при системных заболеваниях соединительной ткани, наследственных синдромах, экспериментальном пневмофиброзе и др. [57, 58]. Протеолитическая активность ММР в основном связана с деградацией компонентов ВКМ. Новые данные показывают, что, помимо ремоделирования ВКМ, MMP играют ключевую роль в воспалении, клеточной пролиферации и повреждении сосудов. Следовательно, избыток ММР может способствовать воспалительной реакции и приводить к активации фибробластов, что приводит к ускорению развития фиброза [59].

Активность ММР обычно ингибируется эндогенными тканевыми ингибиторами металлопротеиназ, которые также играют важную роль в поддержании мезенхимального гомеостаза. При этом, опубликованные данные о функциональной роли TIMP-1 в фиброгенезе неоднозначны, хотя преобладают данные, подтверждающие профибротическую функцию TIMP-1 [60]. Кроме того, TIMP-1 оказывает антиапоптотическое действие в лимфоцитах и эпителиальных клетках, а сверхэкспрессия TIMP-1 в клетках рака молочной железы способствует VEGF-опосредованному ангиогенезу [61, 62]. Как антиапоптотический, так и проангиогенный эффекты часто рассматриваются как механизмы развития опухоли.

Полученные в настоящем исследовании результаты хорошо согласуются с результатами предыдущих исследований, показывающими повышенные уровни MMP в легочной ткани при предопухолевой и опухолевой патологии легких у лиц, длительное время подвергавшихся радиационному воздействию [56].

Мы признаем, что результаты этого исследования следует интерпретировать с осторожностью в связи с его небольшой статистической мощностью. Мы планируем продолжить исследования ВКМ и ЭМП в этих уникальных биологических образцах, собранных у работников, подвергшихся внутреннему альфа-облучению в высоких дозах.

До сих пор существует ряд вопросов, например, могут ли специфические повреждения легочной ткани вследствие внутреннего α-облучения способствовать повышению риска развития рака легкого, о котором сообщалось ранее в эпидемиологических исследованиях когорты работников ПО “Маяк” [14, 16, 63]. Следует отметить, что к концу периода наблюдения (31.12.2018 г.) рак легкого был зарегистрирован у 36.2٪ работников с ЛФР [5].

Лучшее понимание молекулярных механизмов развития легочного фиброза при профессиональном хроническом облучении может помочь в поиске новых биологических маркеров и идентификации биологических мишеней для широкого круга заболеваний, связанных с легочным фиброзом различной этиологии [64].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Патогенез фиброза представляет собой многостадийный процесс, инициируемый повреждением органа и приводящий к интегральной реакции с участием воспалительных клеток, активации каскада цитокинов, факторов роста и в конечном итоге — к ремоделированию внеклеточного матрикса.

В результате проведенного исследования обнаружены качественные и количественные морфологические особенности ЛФР при сравнении с ЛФ другого генеза, позволяющие заключить, что ЛФР — это особый тип пневмофиброза, при котором отмечены особенности локализации и архитектоники очагов фиброза легочной ткани, нарушения содержания коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон легочной стромы. Анализ показал, что гиперпродукция коллагена типа V играет ключевую роль в развитии ЛФР. Кроме этого, в развитии пневмофиброза важную роль играет нарушение баланса между экспрессией ММР и их ингибиторов. Высокий уровень ММР в очагах пневмофиброза у лиц, подвергшихся профессиональному хроническому внутреннему α-облучению, может способствовать разрушению белков экстрацеллюлярного матрикса и базальных мембран и ремоделированию соединительной ткани легких. В результате деградации матрикса под действием ММР образуются биологически активные соединения, оказывающие влияние на дифференцировку и пролиферацию клеток. Таким образом, нельзя исключить влияние дисбаланса в системе ММР на развитие неопластических процессов в легочной ткани. Возможно, нарушение регуляции экспрессии коллагена V типа при ремоделировании внеклеточного матрикса может объяснить нарушенную архитектуру фибриллярных коллагенов легочного интерстиция и является критическим фактором, способствующим развитию легочного фиброза.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального медико-биологического агентства России в рамках контракта от 11 июня 2021 г. № 27.501.21.2 “Модернизация высокотехнологичных методов, направленных на выявление медицинских последствий радиационных воздействий на персонал ПО “Маяк” и население Уральского региона” (шифр: “Медицинские последствия-21”).

The work was financially supported by the Federal Medical and Biological Agency under contract No. 27.501.21.2 dated June 11, 2021 “Modernization of high-tech methods aimed at identifying the medical consequences of radiation exposure on the personnel of the Mayak Production Association and the population of the Ural region” (code “Medicinskie posledstviya-21”).

About the authors

Gleb V. Sychugov

South Ural State Medical University affiliated, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: docsgv@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3251-6944
Russian Federation, Chelyabinsk

Tamara V. Azizova

Southern Urals Biophysics Institute affiliate, Federal Medical Biological Agency

Author for correspondence.
Email: clinic@subi.su
ORCID iD: 0000-0001-6954-2674
Russian Federation, Ozyorsk

Sergey V. Osovets

Southern Urals Biophysics Institute affiliate, Federal Medical Biological Agency

Email: osovets1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6180-2061
Russian Federation, Ozyorsk

Evgeniy L. Kazachkov

South Ural State Medical University affiliated, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: doctorkel@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4512-3421
Russian Federation, Chelyabinsk

Evgeniya S. Grigoryeva

Southern Urals Biophysics Institute affiliate, Federal Medical Biological Agency

Email: grig@subi.su
ORCID iD: 0000-0003-1806-9922
Russian Federation, Ozyorsk

Alexsander G. Sychugov

South Ural State Medical University affiliated, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: docsgv@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0004-4803-1022
Russian Federation, Chelyabinsk

References

Supplementary files