Functional derivatives of chitosan, soluble in neutral medium as drugs and genetic material carrier: preparation and properties

全文:

Комплекс уникальных свойств хитозана (ХТЗ), его биологическая активность, биосовместимость, биодеградируемость, а также низкая токсичность, обусловливают его широкое биомедицинское применение. На основе ХТЗ уже созданы многочисленные продукты разного типа: от покрытий на раны и ожоги до систем доставки лекарственных препаратов [1–5]. В настоящее время задачей является повышение эффективности действия и расширение области применения продуктов на основе ХТЗ за счет придания им чувствительности к действию внешних факторов, создания так называемых «смарт»-систем. Для успешного применения ХТЗ в подобных системах возникает необходимость введения в цепи полисахарида дополнительных функциональных групп, а поскольку необходимым условием использования подобных систем является совместимость с физиологическими средами, для их создания предпочтительны водорастворимые формы ХТЗ, среди которых наиболее перспективным представляется N-[(2-гидрокси‑3-триметиламмоний)пропил] ХТЗ хлорид (N-мХТЗ). В отличие от кватернизованных производных ХТЗ, полученных прямым метилированием аминогрупп, N-мХТЗ является не только высоко заряженным, но и структурно гомогенным поликатионом, сочетающим биосовместимость, биодеградируемость исходного полисахарида с растворимостью во всем диапазоне рН. Каждое модифицированное звено N-мХТЗ помимо кватернизованной аминогруппы содержит вторичную аминогруппу, заряд которой зависит от кислотности среды. Структура и свойства кватернизованного ХТЗ и закономерности его взаимодействия с синтетическими и нуклеиновыми кислотами изучены в цикле предыдущих работ [6–8]. Были получены комплексы N-мХТЗ с ДНК и малыми интерферирующими РНК (миРНК), которые обеспечивали большую эффективность трансфекции в экспериментах in vitro, чем известные системы на основе ХТЗ [9]. Однако следует отметить, что наряду со всеми преимуществами N-мХТЗ их получение сопровождается превращением первичных аминогрупп хитозана во вторичные. Между тем первичные аминогруппы необходимы для обеспечения возможности дальнейшей модификации полисахарида и повышения стабильности его комплексов с отрицательно заряженными соединениями. Кроме того, первичные аминогруппы обусловливают проявление рН-чувствительности поликатиона: в кислых средах количество зарядов на его цепях увеличивается за счет ионизации этих групп. Это обстоятельство может стать решающим для осуществления трансфекции комплексами модифицированного ХТЗ (мХТЗ) с нуклеиновыми кислотами, обеспечивая выход нуклеиновой кислоты из эндосом и лизосом по механизму протоновой губки. Известно так же, что первичные аминогруппы играют важную роль в обеспечении антиоксидантной активности ХТЗ [10]. Таким образом, задача получения растворимого во всем диапазоне рН полисахарида с сохранением первичных аминогрупп в его звеньях остается актуальной. Проведение модификации ХТЗ (2,3-эпоксипропил)триметиламмоний хлоридом (глицидилтриметиламмоний хлоридом, (ГТМАХ)) по гидроксильным группам полисахарида представляется одним из возможных способов решения задачи. Однако, несмотря на многочисленные попытки, не удалось получить растворимые в нейтральных средах производные ХТЗ. Степень модификации полисахарида при проведении реакции в щелочных средах была незначительна, около 10% [11–13], и не превышала 30% для производных, полученных в нейтральных средах с предварительной защитой аминогруппы органическими соединениями или ионными ПАВ [11,  14,  15], что не позволило получить растворимые в нейтральных средах продукты. Кроме того, получение О-кватернизованных производных с использованием в качестве прекурсоров бензилиден- или фталоил-хитозанов было сопряжено со сложностями снятия защиты аминогруппы в жестких условиях, что приводило к частичной деструкции полисахарида. Таким образом, получение растворимых производных хитозана с сохранением первичных аминогрупп остается актуальной задачей, решение которой и является целью настоящей работы.

Методика

Материалы. ХТЗ производства ЗАО “Биопрогресс” (Россия) (степень деацетилирования исходного хитина 90%, массовая доля золя 5%) очищали осаждением раствором щелочи из кислых растворов, промывали дистиллированной водой до нейтрального значения рН и лиофильно высушивали. N-кватернизованный хитозан получали по модифицированной методике, описанной в работе [16]. Значения молекулярной массы (Мw) образцов исходного ХТЗ и N-мХТЗ, определенное методом статического светорассеяния в 0.33 М уксусной кислоте, содержащей 0.2 моль/л ацетата натрия, составили соответственно 280 × 103 и 250 × 103 Да.

Полистиролсульфонат натрия (ПССNa) (“Du Pont”, Франция — США) с Мw = 74 × 103 Дa, ГТМАХ, додецилсульфат натрия (ДДС), концентраты буферов РВS, TRIS, HEPES and MES (“Sigma-Aldrich”, США), а также хлористый натрий, едкий натр, уксусную и соляную кислоту квалификации “х.ч.” (“ЛабТех”, Россия), ацетон и диметилсульфоксид (ДМСО) квалификации “х.ч.” (“Экос‑1”, Россия), а также этиловый спирт (“Химмед”, Россия) применяли без дополнительной очистки. Для приготовления водных растворов использовали бидистиллированную воду.

Натриевую соль ДНК из тимуса теленка (~10000 пар оснований) фирмы “Sigma” (США) применяли без дополнительной очистки. Концентрацию фосфатных групп [P] в растворах нуклеиновой кислоты определяли с помощью УФ-спектрофотомерии, используя закономерности работы [17].

Получение прекурсора ДДС/ХТЗ. Комплексы ДДС/ХТЗ различного состава (1/1; 3/2; 2/1) получали, смешивая кислые растворы ХТЗ и ДДС согласно методике, описанной в работе [18]. Состав комплексов выражали в мольных отношениях сульфонатных групп ДДС к первичным аминогруппам ХТЗ. Например, для приготовления комплекса ДДС/ХТЗ состава 1 : 1, раствор ДДС (2.5 г (8.67ммоль) в 35мл 2%-ной уксусной кислоты) медленно приливали к раствору ХТЗ (1.5 г (8.2 ммоль) в 100 мл 2%-ной уксусной кислоты) при непрерывном перемешивании. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч, продолжая перемешивать. Выпавший осадок собирали на фильтре Шотта, многократно промывали дистиллированной водой, сушили при 70С до постоянного веса. Соотношение серы к азоту определяли методом спектроскопии ЯМР1Н.

Синтез О- и N, O-кватернизованных хитозанов. К раствору комплекса ДДС/ХТЗ (1.0 г) в 40 мл ДМСО добавляли ГТМАХ равными порциями по 0.7 мл 3 раза с интервалом 2 ч. Реакцию проводили в термостатируемом ректоре при температуре 70С и непрерывном перемешивании в течение 14 ч; реакционную смесь выдерживали при 4С 12 ч. Осадок собирали с помощью центрифугирования при 5000 об/мин, 15 мин. Продукт промывали этанолом, осаждали на центрифуге, декантировали жидкую фазу; промывку осадка этанолом повторяли 4–5 раз. После сушки продукт растворяли в 16 мл 0.7 н раствора NaOH и осаждали этанолом (70 мл), собирали осадок с помощью центрифугирования, подсушивали. Повторно переосаждали продукт из щелочного раствора этанолом и высушивали. Полученный осадок растворяли в воде (20 мл). Раствор помещали в диализный мешок “SERVA MWCO 10000” (“Spectra”, США) и проводили диализ против воды, которую многократно меняли. Отмывку проводили до достижения нейтральных значений рН промывных вод; отсутствию поглощения при длине волны 230 нм в их УФ-спектрах. Раствор мХТЗ высушивали лиофильно.

Для потенциометрических измерений использовали рН-метр “Beckman Φ‑70” с комбинированным электродом “Futura Plus” (США). Растворы навесок модифицированного хитозана (концентрация в пробе 1 мг/мл) в 0.007 н растворе соляной кислоты титровали 0.1 М раствором щелочи с интервалом 3 мин между добавлением порций титранта при постоянном перемешивании в токе аргона и при температуре 22C.

Измерения æ-потенциала и размеров частиц, образующихся в смесях полимеров, проводили при 25C на приборе “Zetasizer NanoZD” (“Malvern Instruments”, Англия) в буферных растворах. Концентрация аминогрупп мХТЗ в образце до титрования раствором ПССNa ([ПССNa] = 5 × 10–3 моль/л)была одинаковой и равной 6.0 × 10–4 моль/л.

Комплексы модифицированных ХТЗ с ДНК готовили в 0.01 М растворах буферов TRIS, HEPES и MES при рН 9.0, 7.4 и 5.5 при разных мольных соотношениях компонентов, выраженных как [N] : [P], где [N] — концентрация аминогрупп мХТЗ, [P] — концентрация фосфатных групп ДНК.

ИК-спектры образцов исходного ХТЗ и мХТЗ регистрировали на приборе “Perkin Elmer Spectrum Оne” (США), оснащенном универсальной приставкой ATR с однократным отражением от поверхности кристалла Diamant Zn–Se.

Cпектры ЯМР растворов исходного ХТЗ и мХТЗ в дейтерированной соляной кислоте и D2O соответственно регистрировали на спектрометре “VNMR400” (“Varian”, США) с рабочей частотой 400 МГц на ядрах 1Н и 100 МГц на ядрах 13С. Химические сдвиги измеряли относительно остаточных протонов растворителя.

Результаты и их обсуждение

Для решения задачи получения растворимых производных хитозана с сохранением его первичных аминогрупп был выбран 2-стадийный способ модификации (рис. 1), предусматривающий предварительную защиту аминогрупп на 1 стадии, взаимодействие ГТМАХ с гидроксильными группами полисахарида на второй и последующее снятие защиты с аминогруппы [11]. В метод были внесены существенные изменения, касающиеся стадий кватернизации и очистки продуктов модификации, позволившие значительно повысить эффективность процесса. Для защиты аминогруппы использовали ДДС как реагент, обеспечивающий наиболее простой способ проведения защиты аминогрупп путем получения комплекса ДДС/ХТЗ, а также ее снятия разрушением комплекса. Получение комплекса ДДС/ХТЗ проводили в ДМСО при различных соотношениях компонентов. В табл. 1 приведены данные о влиянии состава исходной смеси на соотношение сульфо- и аминогрупп в комплексе, определенное по данным протонного магнитного резонанса (ПМР) как отношение интегральных интенсивностей сигналов с химическими сдвигами при 0.85 и 2.85 ррm, относящихся к группам СН3 ДДС и группам Н2 ХТЗ соответственно.

 

Рис. 1. Схема двухстадийного синтеза мХТЗ.

 

Таблица 1. Состав реакционной смеси и прекурсоров ДДС/ХТЗ

Образец	[SO3] : [NH2]
	в реакционной смеси	в прекурсоре
мХТЗ‑1	1 : 1	1 : 1.6
мХТЗ‑2	3 : 2	1 : 1.1
мХТЗ‑3	2 : 1	1 : 1

 

Согласно полученным результатам для полного экранирования первичных аминогрупп ХТЗ необходим двойной избыток ДДС, что совпадает с данными, полученными ранее в работах [11, 18].

На второй стадии проводили реакцию полученных прекурсоров — комплексов ДДС/ХТЗ с ГТМАХ. Продукты реакции выделяли, удаляли защиту с аминогрупп, растворяя полученные продукты в 1н NaOH с последующим переосаждением полученного раствора этанолом, процедуру повторяли несколько раз. Для полного удаления ДДС требовалось проведение дополнительной очистки продукта диализом. Следует отметить, что предложенный в работах [11, 18] способ выделения и очистки продукта с использованием только диализа против 15%-ного раствора TRIS не позволял полностью удалить защиту с аминогрупп.

Растворимость образцов модифицированного ХТЗ определяли методом турбидиметрического титрования. Согласно данным, приведенным на рис. 2, образец мХТЗ‑3, полученный с полной защитой аминогрупп, при соотношении [SO3]/[NH2], равном 2 : 1, ограниченно растворялся в водных средах, тогда как образец с частичной защитой аминогруппы мХТЗ‑1 обладал растворимостью сопоставимой с растворимостью N-модифицированных продуктов. Это позволило предположить, что в этом случае реакция с ГТМАХ протекала также и по аминогруппам.

 

Рис. 2. Оптическая плотность при 450 нм водных растворов образцов N-мХТЗ (1), мХТЗ 1 (2), мХТЗ 3 (3) в средах с различными значениями рН.

 

Структуру полученных продуктов анализировали спектральными методами. На рис. 3 приведены ИК-спектры исходного ХТЗ и продуктов его модификации, полученных прямой реакцией по аминогруппе и двухстадийным способом с частичной и полной защитой аминогрупп. О наличии четвертичной аминогруппы в продуктах модификации свидетельствовало появление интенсивной полосы при 1477 см‑1, относящейся к метильным группам при четвертичном атоме азота [16, 19–21]. Основное различие между спектрами производных ХТЗ, полученных разными способами, заключалось в интенсивности полосы 1590 см‑1, относящейся к первичной аминогруппе. В табл. 2 приведены данные об относительных интенсивностях характеристических полос в ИК-спектрах всех исследуемых образцов, определенные с использованием в качестве внутреннего стандарта полосы 1415 см‑1. Там же приведены значения степеней модификации продуктов, определенные по данным ПМР, и значения содержания аминогрупп, рассчитанные по данным потенциометрического титрования.

 

Рис. 3. ИК-Фурье-спектры образцов ХТЗ (1), N-мХТЗ (2), мХТЗ 1 (3).

 

Таблица 2. Относительные интенсивности характеристических полос в ИК-спектрах образцов ХТЗ и мХТЗ, значения степеней кватернизации и содержания NH2-групп

Образец	Аотн 1580 см‑1 NH2	Аотн 1477 см‑1 N(CH3)3	Степень кватернизации, % масс.*	Содержание NH2, % масс.**
Хитозан	1.3	0	0	90
N-мХТЗ	0	1.27	99.5	0
мХТЗ‑3	1.3	1.05	40.5	88
мХТЗ‑1	1.04	1.24	90	54

*По данным ЯМР1Н; **по данным потенциометрического титрования.

 

Интенсивность полосы 1580 см‑1 первичных аминогрупп в спектрах исходного ХТЗ и мХТЗ‑3 была практически одинаковой, что подтверждало эффективность защиты аминогрупп выбранным способом. В спектре N-замещенных производных, полученных одностадийной реакцией, этой полосы нет. В то же время в спектре продуктов, полученных при частичном экранировании первичных аминогрупп мХТЗ‑1, эта полоса присутствовала, и ее интенсивность была пропорциональна степени замещения первичных аминогрупп. Данные хорошо согласуются с результатами определения количества первичных аминогрупп методом потенциометрического титрования, представленными на рис. 4. Значения степени кватернизации, рассчитанные из данных потенциометрии, для продуктов, полученных одностадийным и двухстадийным синтезом при полном экранировании аминогруппы, составили 99.5 и 40% соответственно. Высоких степеней замещения удалось достичь за счет дробного внесения ГТМАХ в реакционную среду, что позволило сократить его потери из-за частичного разрушения эпоксидных циклов в условиях реакции. Однако данные ИК-спектроскопии не позволяют однозначно определить положение кватернизованного фрагмента, поэтому структуру продуктов модификации, полученных разными способами, исследовали методом спектроскопии ЯМР.

 

Рис. 4. Кривые потенциометрического титрования образцов N-мХТЗ (1), мХТЗ 1 (2), мХТЗ 3 (3), исходный ХТЗ (4).

 

На рис. 5 приведены спектры ЯМР 13С модифицированных продуктов, полученных одностадийным способом и при различных степенях защиты первичной аминогруппы, а в табл. 3 — положение сигналов углерода, при отнесении которых пользовались литературными данными [22, 23]. В спектрах всех образцов присутствовали сигналы с химическим сдвигом 54.6 ррm, соответствующие углероду метильной группы при атоме азота. Вместе с тем сигналы áСН2, 2СН, 6СН2 различались по положению в спектрах образцов N-мХТЗ и О-замещенных продуктов с полной защитой NН2-групп мХТЗ‑3. В спектрах продуктов с частичной защитой аминогруппы мХТЗ‑1 присутствовали сигналы двух типов, что подтверждало протекание реакции как по гидроксильной, так и по аминогруппе.

 

Рис. 5. Спектры ЯМР 13С модифицированных продуктов N-мХТЗ (а), мХТЗ 1 (б) и мХТЗ 3 (в) в D2O.

 

Таблица 3. Положение сигналов углерода в спектрах ЯМР 13С модифицированных продуктов

Образец	Группа/положение сигнала, ррm
	áСН2	2 СН	6 СН2	СН3(N)
N-мХТЗ	52.3	62.9	61.7	54.6
мХТЗ‑3	74.6	58.2	72.4	56.7
мХТЗ‑1	52.2 и 75.3	57.1 и 62.9	60.9 и 69.6	54.6

 

Таким образом, частичная защита аминогруппы до реакции с ГТМАХ приводила к получению продуктов с высокими степенями модификации, содержащих при этом первичные аминогруппы. Очевидно, что именно кватернизация части аминогрупп позволила получить продукты, обладающие растворимостью во всем диапазоне рН.

Смешанный тип замещения не только обеспечивал растворимость при разных рН, но и приводил к получению поликатионов, несущих на цепях три типа аминогрупп: первичные, вторичные и четвертичные, наличие которых могло существенно влиять на характер образования и свойства их комплексов с отрицательно заряженными соединениями. Исследование поведения модифицированных продуктов в реакциях комплексообразования проводили на примере модельного полианиона — ПССNa, являющегося сильным полиэлектролитом, заряд которого не зависит от pH среды, что значительно упростило интерпретацию полученных результатов. Готовили комплексы разного состава в средах с разными значениями pH (9.0, 7.4, 5.5) и измеряли x-потенциал полученных частиц. Концентрация [–SO3–] групп в полианионе была постоянной и составляла 6 × 10–4 моль/л; измерения проводили при 25C. Выбор сред для исследования был обусловлен практическими соображениями. Для возможного применения систем на основе этих поликатионов в медицине важны среды с pH 7.4, отвечающие физиологическим условиям, и слабокислые среды с pH 5.5, характерным для некоторых клеточных органелл, например лизосом, а также для патологических клеток. Щелочные среды с pH 9.0 выбраны для выявления вклада четвертичных аминогрупп модифицированных ХТЗ, поскольку при таких значениях рН именно они определяют заряд поликатиона. В нейтральных и слабокислых средах заряжаются как первичные, так и вторичные аминогруппы, внося свой вклад в процесс образования комплексов.

Составы комплексов модифицированных ХТЗ и ПССNa, отвечающих точке нейтрализации, то есть равному количеству положительных и отрицательных зарядов в комплексах, представлены в табл. 4. При титровании поликатионов в слабощелочных средах, где заряжены только их четвертичные аминогруппы, для достижения точки эквивалентности как для N-мХТЗ, так и для мХТЗ‑1 необходимо добавить эквивалентное количество групп –SO3–. При переходе в нейтральные среды для нейтрализации поликатионов требуется избыточное количество полианиона: для N-мХТЗ, в молекулах которого присутствуют вторичные аминогруппы, необходимо добавить избыток в 0.17 моля, а для мХТЗ‑1, который содержит и вторичные и первичные аминогруппы, необходим избыток в 0.6 моля. Еще значительнее эта разница становится в кислых средах, где степень ионизации первичных аминогрупп возрастает.

 

Таблица 4. Состав комплексов ПССNa/мХТЗ в точке нейтрализации в средах с различными значениями рН

Образец	Соотношение –/+ в точке нейтрализации*
	9.0	7.4	5.5
мХТЗ‑1	1.0	1.6	2.2
N-мХТЗ	1.0	1.17	2.0

*(–/+) — мольное отношение сульфонатных групп ПССNa к аминогруппам мХТЗ.

 

Полученные результаты показали зависимость состава комплексов, соответствующих точке нейтрализации, от рН среды и хорошо согласовывались с содержанием первичных аминогрупп, определенным по результатам потенциометрического титрования (табл. 2).

Как уже упоминалось выше, одним из возможных применений модифицированных ХТЗ является создание на их основе систем трансфекции — полиплексов, при этом ключевым параметром для достижения эффективности действия являются размеры полиплексов. Влияние структуры поликатионов на образование и свойства их комплексов с ДНК изучали на примере ДНК тимуса теленка. Были приготовлены растворы комплексов с образцами N-мХТЗ и мХТЗ‑1 в фосфатном буфере и методом динамического светорассеяния определены их размеры. На рис. 6 приведены размеры комплексов, полученных при разном мольном соотношении компонентов. Как видно из рис. 6, размеры комплексов с образцом мХТЗ‑1 были меньше, чем с N-мХТЗ при всех соотношениях компонентов. Поскольку содержание четвертичных аминогрупп в образцах имеет близкие значения, можно предположить, что уменьшение размеров обусловлено вкладом первичных аминогрупп в связывание и, вероятно, более компактной конформацией макромолекул мХТЗ‑1.

 

Рис. 6. Размеры частиц полиплексов, полученных при разном соотношении компонентов мХТЗ/ДНК (фосфатный буфер, рН 7.4): 1 — N-мХТЗ; 2 — мХТЗ 1.

 

Стабильность полиплексов в физиологических условиях является параметром, определяющим возможность их практического использования. Была исследована стабильность комплексов мХТЗ-ДНК в фосфатном буфере. На рис. 7 приведены размеры комплексов, определенные при различных концентрациях соли в буферном растворе. Увеличение концентрации соли до ее значений в физиологических условиях (0.14 М) не приводило к увеличению размеров частиц или появлению мультимодальности, то есть к разрушению полиплексов. Более того, размеры комплексов практически не изменялись и при высоких концентрациях соли — вплоть до 0.8 моль/л. Полученные данные позволяют сделать вывод, что полиплексы обладают стабильностью в условиях близких к физиологическим.

 

Рис. 7. Размеры частиц полиплексов состава мХТЗ/ДНК = 8 : 1 в растворах фосфатного буфера с рН 7.4 при различной концентрации соли NaCl: 1 — N-мХТЗ/ДНК, 2 — мХТЗ 1/ДНК.

 

***

Таким образом, разработан метод получения производных ХТЗ, содержащих три типа аминогрупп (первичные, вторичные и четвертичные) и обладающих растворимостью во всем диапазоне рН. Структура полученных продуктов изучена спектральными методами. Показано, что для получения растворимых продуктов необходимо наличие ∼50% кватернизованных аминогрупп. Разница в рН-чувствительности N- и N-, O-модифицированных продуктов выявлена на примере их комплексов с модельным полианионом — ППСNa. Продемонстрирована возможность получения на основе мХТЗ комплексов с ДНК — полиплексов, обладающих стабильностью в условиях близким к физиологическим. Показано, что наличие первичных аминогрупп на цепях поликатионов приводит к уменьшению размеров полиплексов. Полученные результаты могут составить основу для разработки систем доставки лекарственных средств и генетического материала.

Авторы выражают благодарность сотрудникам АО “Институт пластмасс” И.М. Шелониной и С.Г. Алексеевой за выполнение спектральных исследований.

Финансирование работы. Работа выполнена в рамках государственного задания Института нефтехимического синтеза РАН за счет средств бюджета института. Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

Соблюдение этических стандартов. В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

作者简介

M. Gorshkova

A. V. Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis RAS

编辑信件的主要联系方式.
Email: mgor@ps.ac.ru
俄罗斯联邦, 119991, Moscow

E. Gigoryan

A. V. Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis RAS

Email: mgor@ps.ac.ru
俄罗斯联邦, 119991, Moscow

I. Volkova

A. V. Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis RAS

Email: mgor@ps.ac.ru
俄罗斯联邦, 119991, Moscow

参考

补充文件