Comparison of the Efficiency of Various Promoters for the Production of Secreted β-Mannanase by Bacillus subtilis by Cells of the Methylotrophic Yeast Ogataea haglerorum

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

In this article, strong promoters of thermotolerant methylotrophic yeast Ogataea haglerorum have been characterized. Promoters play a key role in the regulation of gene expression; therefore, they are the important element of expression vectors. Strong and strictly regulated promoters are a powerful tool for creating highly productive strains — producers of recombinant proteins. To expand the potential of the O. haglerorum expression system natural methanol-induced promoters of the OhMOX and OhFMD genes and the constitutive promoter of the OhGAP gene were studied in comparison with the promoter of the MOX gene from O. polymorpha yeast. A gene encoding recombinant β-mannanase was used as a reporter gene. It has been shown that in O. haglerorum yeast cells, the expression level (strength) of the pOhMOX promoter is about 1.4–1.9 times higher relative to the pOpMOX promoter from O. polymorpha yeast. The obtained data on the strength of promoters from yeast O. haglerorum can be useful in designing producers of recombinant proteins and optimizing metabolic pathways in methylotrophic yeast O. haglerorum.

Texto integral

Метилотрофные дрожжи родов Komagataella (Pichia) и Ogataea (Hansenula) широко используются для продукции рекомбинантных белков благодаря их способности достигать высокой плотности клеток при культивировании в минимальной среде в биореакторе и наличию сильных промоторов для эффективной экспрессии гетерологичных генов. Термотолерантные дрожжи рода Ogataea применяются для получения белков при повышенной температуре, 37°C и выше, что позволяет снизить вероятность контаминации, длительность ферментации, а также затраты на охлаждение биореактора [1].

Метилотрофные дрожжи используют общий путь метаболизма метанола. Первый фермент этого пути окисляет метанол до формальдегида и перекиси водорода. В дрожжах рода Ogataea этот этап контролируется метанолоксидазой, кодируемой геном MOX. Регуляция экспрессии гена MOX осуществляется на уровне транскрипции. Во время роста дрожжей на метаноле доля метанолоксидазы составляет 30–40% от клеточного белка [2], поэтому промотор гена MOX (pMOX) является одним из наиболее сильных индуцируемых промоторов, широко используемых в системе экспрессии O. polymorpha. При использовании промотора pMOX получен широкий ассортимент белковых препаратов, например частицы антигена вируса гепатита B человека [3], белки ротавируса VP6 [4], папилломовируса HPV-16 [5], человеческий сывороточный альбумин [6], в последнем случае выход продукта в ферментере достигал 5.1 г/л. Другой сильный метанол-индуцируемый промотор, который используют для экспрессии гетерологичных генов в дрожжах O. polymorpha, — промотор гена FMD, кодирующего формиатдегидрогеназу. Показано, что штаммы-продуценты O. polymorpha, содержащие под контролем промотора pFMD ген глюкоамилазы из Schwanniomyces occidentalis [7] или ген CON фитазы [8], продуцируют, соответственно, 1.4 или 13.49 г/л целевого фермента при культивировании в ферментере.

Промоторы эукариот, как правило, имеют больший размер, чем промоторы прокариот, и содержат коровый элемент (core) и специфические регуляторные последовательности — UAS (upstream activation sequences) и URS (upstream repressing sequence). Коровый элемент TATA-бокс — это сайт связывания TATA-связывающего белка (TBP), субъединицы транскрипционного фактора TFIID, включенного в процесс инициации транскрипции [9]. Последовательности UAS и URS — cis-действующие элементы — представляют собой сайты связывания с транскрипционными факторами, которые усиливают (активатор) или ослабляют (репрессор) силу промотора [10, 11]. Экспериментально было показано, что в 5′-регуляторном регионе промотора гена MOX из дрожжей O. polymorpha имеются последовательности, которые могут быть идентифицированы как UAS1, UAS2 и URS1 [2].

Механизм, с помощью которого метанол индуцирует транскрипцию генов, участвующих в пути утилизации метанола, не изучен до конца. Исследования в этом направлении проводят обычно на промоторе гена AOX1 из дрожжей K. phaffii. Были идентифицированы позитивные регуляторы промотора pAOX1 в ответ на метанол — Mxr1p, Mit1p и Prm1 [12, 13], которые не взаимодействуют друг с другом и имеют различные сайты связывания [14].

Альтернативой индуцируемым промоторам являются конститутивные промоторы, под контролем которых синтез рекомбинантных белков осуществляется без применения токсичного метанола. Одним из наиболее сильных конститутивных промоторов является промотор гена GAP, кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Однако сила промотора pGAP сильно варьирует в зависимости от источника углерода в среде культивирования, что было показано в дрожжах P. pastoris и O. thermomethanolica [15, 16]. Промотор pGAP применяли, например, для экспрессии человеческого сывороточного альбумина [17] или фитазы [16].

Хотя системы экспрессии на метилотрофных дрожжах рода Ogataea хорошо разработаны, появляются новые их представители, потенциал которых не изучен. Вид Ogataea haglerorum выделен из дрожжей рода Ogataea в 2017 г. в результате проведения комплексного молекулярно-генетического анализа [18]. Для O. haglerorum разработаны технологии конструирования штаммов-продуцентов, включая экспрессионный вектор и метод введения ДНК в клетки реципиента [19]. Прежде для экспрессии гетерологичных генов использовали промотор гена MOX (pOpMOX) из дрожжей O. polymorpha. На основе штамма O. haglerorum ВКПМ Y-2584 были получены высокопродуктивные штаммы-продуценты β-маннаназы и фитазы, способные продуцировать ферменты при температуре 37°C [20, 21].

Цель данной работы — характеристика промоторов pOhMOX, pOhFMD и pOhGAP из штамма O. haglerorum ВКПМ Y-2584 в сравнении с промотором pOpMOX из дрожжей O. polymorpha.

МЕТОДИКА

Штамм дрожжей Ogataea haglerorum (G. I. Naumov, E. S. Naumova, C. F. Lee) ВКПМ Y-2584 получен из коллекции Биоресурсного центра Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ, НИЦ “Курчатовский институт”, Москва, Россия). Для клонирования промоторов и наработки плазмид использовали штамм E. coli XL1 blue (“Stratagene”, США).

Дрожжи O. haglerorum выращивали на среде YPD (дрожжевой экстракт — 10 г/л, пептон — 20 г/л, глюкоза — 20 г/л) при 37°C.

E. coli XL1 blue выращивали на среде LB (дрожжевой экстракт — 5 г/л, триптон — 10 г/л, NaCl — 5 г/л) при 37°C, при необходимости в среду добавляли ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.

Основные генно-инженерные методы работы с ДНК выполнялись согласно методическим указаниям [22]. Хромосомную ДНК из дрожжей выделяли с использованием набора для выделения ДНК из дрожжей (“diaGene”, “Диа-М”, Россия). Правильность сборки всех плазмид проверяли секвенированием на секвенаторе “3500 Genetic Analyzer” (“Applied Biosystems”, “Hitachi”, Япония) в ЦКП НИЦ “Курчатовский институт” (Россия). Названия и последовательности всех использованных в работе праймеров указаны в таблице в Дополнительных материалах 1. Амплификация производилась на амплификаторе Thermal Cycler T100 (“Bio-Rad”, США) с использованием Kapa-полимеразы (“KapaBiosystems”, США).

Конструирование плазмид. Вектор pOpMOX-Km (рис. 1a) был сконструирован на основе коммерческого вектора pBluescript II KS+ (X52327, “Stratagene”, США). На его основе были созданы используемые в работе плазмиды pOhMOX–MANS-HARS, pOpMOX–MANS-HARS, pOhFMD-MANS-HARS и pOhGAP-MANS-HARS (рис. 1б), конструирование которых описано ниже.

 

Рис. 1. Схема экспрессионного вектора pOpMOX-Km (а) и плазмиды pOhMOX-MANS-HARS (б). Промоторы pOhFMD, pOhGAP и pOpMOX содержат плазмиды pOhFMD-MANS-HARS (7986 п. н.), pOhGAP-MANS-HARS (8091 п. н.) и pOpMOX-MANS-HARS (7993 п. н.) соответственно.

 

Первоначально были подобраны праймеры: MOX-up-F и MOX-dn-R для амплификации локуса MOX размером 3.8 тыс. п. н. на основе последовательностей GenBank: AEOI02000008 (O. parapolymorpha DL-1) и GenBank: AECK01000003.1 (O. polymorpha NCYC495 leu1.1). Праймеры FMD-up-F и FMD-dn-R использовали для амплификации 5′-нетранслируемой области гена FMD размером 900 п. н. на основе GenBank: AEOI02000010.1 (O. parapolymorpha DL-1) и AECK01000001.1 (O. polymorpha NCYC495 leu1.1); GAP-up-F и GAP-dn-R — для амплификации 5′-нетранслируемой области гена GAP размером 800 п. н. на основе последовательностей GenBank: AEOI02000010.1 (O. parapolymorpha DL-1) и AECK01000001.1 (O. polymorpha NCYC495 leu1.1). Амплификация производилась с использованием хромосомной ДНК O. haglerorum в качестве матрицы.

На основании полученных нуклеотидных последовательностей, в которых при помощи программы AlignX (“Vector NTI”, США) определены содержащие промоторы области, были подобраны праймеры: pMOX-2584-F и pMOX-2584-R для амлификации промотора pOhMOX размером 464 п. н.; pFMD2584-F и pFMD2584-MF-R для амплификации промотора pOhFMD размером 492 п. н.; pGAP2584-F и pGAP2584-MF-R для амплификации промотора pOhGAP размером 603 п. н. Полученные ПЦР-фрагменты встраивали в вектор pOpMOX-Km по сайтам SacI и BamHI с замещением фрагмента ДНК, содержащего промотор pOpMOX.

Далее в вектор по сайтам EcoRI и NotI встраивали синтетический ген MANS (OP897818.1) с оптимизацией кодонов для метилотрофных дрожжей, кодирующий β-маннаназу из B. subtilis (КФ 3.2.1.78). Ген MANS размером 1032 п. н. был синтезирован в компании ООО “Иннова плюс” (Россия). Затем в вектор по сайтам Eco32.I и SalI встраивали фрагмент с HARS размером 526 п. н., который амплифицировали с хромосомной ДНК дрожжей O. haglerorum с праймеров HARS-F и HARS-R. В результате были получены плазмиды pOhMOX-MANS-HARS, pOpMOX-MANS-HARS, pOhFMD-MANS-HARS и pOhGAP-MANS-HARS (рис. 1б).

Трансформация дрожжей O. haglerorum. Трансформацию дрожжей O. haglerorum осуществляли как описано в работе [23]. Электропорацию проводили с использованием электропоратора GenePulserXcellTM (“Bio-Rad”, США), параметры: 1500 В; 25 мкФ; 200 Ом. Трансформанты отбирали на плотной среде YPD с добавлением генетицина (G418, “Gibco”, Великобритания) в количестве 200 мкг/мл.

Тест на митотическую стабильность. Трансформанты растили в неселективных условиях (жидкая YPD) в глубоколуночных планшетах Deepwell Plate (“Eppendorf”, Германия) при 37°C в шейкере-инкубаторе Innova 44 (“New Brunswick”, Германия) в течение 24 ч. Затем культуру рассевали для получения отдельных колоний на чашках Петри с неселективной средой. С помощью репликатора отбирали по 100 независимых колоний и анализировали их на способность расти на средах YPD и YPD с генетицином (200 мкг/мл). Появление колоний, не растущих на среде YPD с генетицином, указывало на то, что плазмида не интегрирована в геном реципиента и содержится в клетках трансформанта в виде автономно реплицирующейся ДНК.

Изоляция плазмид из трансформантов O. hagle- rorum. Из биомассы трансформантов O. haglerorum, выращенных в 2 мл среды YPD с генетицином (200 мкг/мл), выделяли ДНК с использованием набора GeneJet Plasmid Miniprep (“ThermoScientific”, Литва), которой трансформировали клетки E. coli XL1 blue. Из одного трансформанта со среды LB с ампициллином выделяли плазмидную ДНК и анализировали размер плазмиды методом электрофореза.

Экспрессия гена MANS в дрожжах O. haglerorum. Культивирование трансформантов, содержащих ген MANS под контролем метанол индуцируемых промоторов, проводили следующим образом. Отдельную колонию засевали в 5 мл жидкой селективной среды YPD с генетицином в количестве 200 мкг/мл и выращивали при 37°C в шейкере-инкубаторе Innova 44 в течение 20 ч. Полученным инокулятом засевали пробирки с 5 мл селективной среды в соотношении 1: 10. Пробирки инкубировали при 37°C и 250 об/мин в течение 120 ч. Метанол (3%) добавляли к культуре через 24 и 48 ч культивирования.

Для культивирования трансформантов, содержащих ген MANS под контролем конститутивного промотора pOhGAP, инокулятом засевали пробирки с 5 мл селективной среды в соотношении 1: 10. Пробирки инкубировали при 37°C и 250 об/мин. в течение 72 ч. Глюкозу в количестве 2% добавляли через 24 и 48 ч культивирования. Отсутствие остаточной глюкозы в супернатанте проверяли методом ВЭЖХ на хроматографе Alliance (“Waters”, США) с рефрактометрическим детектором Waters 2414 с использованием колонки YMC-Pack Polyamine II (“YMC”, Япония).

По окончании культивирования биомассу отделяли центрифугированием при 1700 g в течение 10 мин. Супернатант использовали для измерения активности β-маннаназы и анализа ПААГ с ДДС-Na, который проводили в 12%-ном полиакриламидном геле в камере для вертикального электрофореза Mini-PROTEAN Tetra (“Bio-Rad”, США). Для визуализации белков использовали Кумасси бриллиантовый синий R250.

Определение активности β-маннаназы. Активность β-маннаназы определяли по методу Миллера с динитросалициловой кислотой (ДНС), используя маннозу (“Sigma”, США) в качестве стандарта [24]. В качестве субстрата использовали галактоманнан Locust bean gum from Ceratonia (LBG, “Sigma”, Италия). К 100 мкл 1%-ной суспензии LBG в 0.1 М ацетатном буфере (pH 5.0) добавляли 100 мкл супернатанта, содержащего фермент, и инкубировали при температуре 55°C в течение 10 мин. Затем к реакционной смеси добавляли 300 мкл ДНС, прогревали при 99°C в течение 5 мин. Измеряли содержание образующихся в результате ферментативной реакции редуцирующих сахаров спектрофотометрически при длине волны 540 нм на спектрофотометре Multiskan spectrum (“Thermo scientific”, США). За 1 ед. ферментативной активности β-маннаназы принимали количество фермента, действующего на субстрат с высвобождением 1 мкМ восстанавливающих сахаров (в пересчете на маннозу) за 1 мин в условиях эксперимента. Все измерения проводились трижды.

Выделение РНК и анализ транскрипции гена MANS под контролем промоторов pOhMOX и pOpMOX методом ПЦР в реальном времени. Для выделения РНК посевной культурой засевали 50 мл селективной среды YP (дрожжевой экстракт — 10 г/л, пептон — 20 г/л) с генетицином (200 мкг/мл), содержащей глюкозу (1%) или метанол (1%) в колбах на 0.75 л до начальной оптической плотности OD600 равной 0.1. Колбы, содержащие среду с метанолом, засевали и культивировали при 37°C и 250 об./мин. в течение 12 и 20 ч, а среду с глюкозой — 12 ч. Биомассу отделяли от среды центрифугированием при 6000 об./мин. в течение 10 мин и использовали для выделения РНК.

РНК выделяли при помощи набора RNeasy (“Qiagen”, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Полученную тотальную РНК доводили до концентрации 500 нг/мкл, обрабатывали ДНКазой (“Thermo”, Литва) и использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции при помощи ревертазы из набора MMLT (“Евроген”, Россия) и Oligo-dT праймеров. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для реакции ПЦР в реальном времени. Амплификацию проводили при помощи набора qPCRmix-HS SYBR (“Евроген”, Россия) на приборе 7500 Fast Real-Time PCR System (“Applied Biosystems”, США). В реакционную смесь добавляли 1 мкл кДНК-матрицы (50 мкг/мл), по 1 мкл раствора каждого из праймеров (10 нМ/мл) и доводили объем до 20 мкл деионизированной водой. Использовали следующую программу ПЦР: 5 мин при 95°C (1 цикл), 30 с при 95°C, 20 с при 65°C и 30 с при 72°C (40 циклов). Определяли величину экспрессии гена MANS в образцах по методу ddCT [25]. Для амплификации транскриптов гена MANS размером 210 п. н. использовали праймеры RT-MANS-F и RT-MANS-R. В качестве референсного гена домашнего хозяйства использовали ген актина (ACT) из штамма O. haglerorum (нуклеотидная последовательность гена ACT указана в Дополнительных материалах 2). Для амплификации транскриптов референсного гена размером 180 п. н. использовали праймеры RT-ACT-F и RT-ACT-R.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ последовательности локуса, кодирующего метанолоксидазу из дрожжей O. haglerorum. Основываясь на предположении о консервативности генов, кодирующих пути метаболизма метанола в метилотрофных дрожжах рода Ogataea, были подобраны праймеры на основе последовательностей локуса MOX из дрожжей O. polymorpha NCYC495 leu1.1 и O. parapolymorpha DL-1 из базы данных NCBI. В результате амплификации предположительного локуса MOX из O. haglerorum был получен ПЦР-фрагмент размером 3.8 т. п. н., нуклеотидная последовательность которого была определена секвенированием. В данной последовательности была определена предположительная открытая рамка считывания метанолоксидазы (Mox), кодирующая белок размером 664 аминокислотных остатка, последовательность которого идентична на 99.2% Mox из штамма O. polymorpha NCYC495 leu1.1 (NCBI: XP_018211707.1) и на 99.7% Mox из штамма O. parapolymorpha DL-1 (NCBI: XP_013934137.1). Высокое сходство говорит об обнаружении локуса OhMOX. Здесь и далее последовательности исследованных локусов указаны в таблице Дополнительные материалы 2.

Был проведен анализ последовательности размером 946 п. н., локализованной перед ATG кодоном гена OhMOX, содержащей промотор pOhMOX и регуляторные элементы из O. haglerorum (рис. 2). В 5′-области гена OhMOX были выявлены предполагаемые регуляторные области URS (upstream repression sequence), две последовательности UAS (UAS1 и UAS2, upstream activation sequence) и предполагаемый TATA-бокс по гомологии с этими элементами, выявленными экспериментальным путем в 5′ регуляторном регионе дрожжей O. polymorpha [2]. Локализация последовательностей URS (–907 до –883) и TATA-бокса одинакова в дрожжах O. haglerorum и O. polymorpha, но имеются отличия в нуклеотидной последовательности URS: GGACGTCGTTAAAGGAGGGCGCCAC в дрожжах O. haglerorum и GGACGTCGTTGAACGAGGGGGCCAC в дрожжах O. polymorpha. Консервативные последовательности UAS1 (–460 до –447) и UAS2 (–723 до –709) располагаются ближе к старт-кодону, чем в дрожжах O. polymorpha, из них только последовательность UAS1 (TCCTTGCACCGCCT) незначительно отличается от таковой (TCCTTGCACCGCAA) в O. polymorpha. В 5′-регионе гена OhMOX имеется также консенсус последовательность TGTCAGTTTCTCCACAGTGCA (–215 до –195), содержащая ключевой элемент CYCC (CTCC), которая предположительно является сайтом связывания с белком Mxr1p (methanol expression regulator 1). Транскрипционный фактор Mxr1p является ключевым активатором генов путей метаболизма метанола и биогенеза пероксисом в дрожжах P. pastoris [12, 14]. Предполагаемый сайт для связывания с Mxr1p выявлен в промоторе pOtMOX дрожжей O. thermomethanolica [26]. Предполагается, что Mxr1p является гомологом регуляторного фактора Adr1 из Saccharomyces cerevisiae, поскольку эти белки имеют сходство N-конца, а также показано участие Adr1 в активации промотора pOpMOX при его использовании в S. cerevisiae [27].

 

Рис. 2. Последовательность, локализованная перед ATG кодоном гена OhMOX. Подчеркиванием выделена область между открытыми рамками считывания соседних генов. Предполагаемые последовательности URS (upstream repressing sequence), UAS1, UAS2 (upstream activator sequences) и TATA-box выделены жирным шрифтом. Предполагаемый сайт связывания с core-последовательностью CYCC гомолога Mrx1 выделен курсивом и жирным шрифтом. Стартовый кодон открытой рамки считывания для метанолоксидазы (ATG) выделен жирным шрифтом. Местоположение отсутствующего участка размером 22 п. н. обозначено ломаной линией.

 

Экспрессионная плазмида pOhMOX-MANS-HARS содержит промотор pOhMOX размером 464 п. н. В качестве промотора была взята последовательность, расположенная между открытой рамкой считывания гена MOX и соседним геном, за исключением участка последовательности, содержащего TATA-бокс последнего. Было проведено сравнение последовательности промотора pOhMOX (464 п. н.), клонированного в плазмиду, с последовательностями промоторного региона генов MOX из штаммов O. polymorpha (NCYC495 leu1.1), O. parapolymorpha (DL1) и O. angusta с использованием программы Clustal Omega (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Результаты выравнивания последовательностей представлены в Дополнительных материалах 3. Последовательность промотора pOhMOX идентична последовательностям аналогичных промоторов из O. polymorpha, O. parapolymorpha и O.angusta на 80.0, 82.7 и 80.0% соответственно. В промоторе pOhMOX отсутствует участок размером 22 п. н. (ACCAGAGCAGCAGAGGGCCGAT) на расстоянии –236 п. н. от ATG-кодона и 21 п. н. до предположительного сайта связывания транскрипционного регулятора Mxr1p.

Анализ последовательности промоторного региона гена GAP, кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из дрожжей O. haglerorum. Проанализировали последовательность нуклеотидов размером около 800 п. н., амплифицированную с хромосомной ДНК O. haglerorum с использованием праймеров, подобранных на основе консервативных участков локуса GAP в штаммах O. parapolymorpha DL-1 и O. polymorpha NCYC495 leu1.1. Амплифицированный фрагмент имел высокое сходство с локусом GAP из штаммов DL-1 и NCYC495. По аналогии с локусом MOX амплифицировали более протяженный участок региона GAP (см. Дополнительные материалы 2), содержащий открытую рамку считывания, кодирующую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу — фермент, состоящий из 335 аминокислотных остатков, который идентичен на 96.7% Gap из штаммов O. polymorpha NCYC495 leu1.1 (NCBI: XP_018209147.1) и O. parapolymorpha DL-1 (GenBank: AAC08320.1) и на 92.3% Gap из штамма O. thermomethanolica BCC16875 (GenBank: AGL39758.1).

Сравнение последовательности промотора pOhGAP с аналогичными промоторами из родственных организмов O. polymorpha, O. parapolymorpha и O. angusta не выявило каких-либо существенных структурных различий. Выравнивание последовательностей представлено в дополнительных материалах 3 к статье.

Анализ последовательности промоторного региона гена FMD, кодирующего формиатдегидрогеназу из дрожжей O. haglerorum. На основе консервативных регионов локуса FMD в штаммах O. parapolymorpha DL-1 и O. polymorpha NCYC495 leu1.1 были подобраны праймеры для амплификации 5′-нетранслируемой области гена FMD с частью последовательности структурной области гена. В результате был получен ПЦР-фрагмент размером около 900 п. н., содержащий предполагаемый промотор гена FMD, кодирующего формиатдегидрогеназу из дрожжей O. haglerorum, с высоким сходством к аналогичному региону в родственных штаммах. По аналогии с локусом MOX амплифицировали более протяженный участок региона FMD (см. Дополнительные материалы 2), содержащий открытую рамку считывания для формиатдегидрогеназы — фермента, состоящего из 362 аминокислотных остатков, который идентичен на 96.1% Fmd из штамма O. polymorpha NCYC495 leu1.1 (NCBI: XP_018212858.1) и на 97.2% Fmd из штамма O. parapolymorpha DL-1 (NCBI: XP_013932954.1).

При сравнении последовательности промотора pOhFMD с аналогичными промоторами из родственных организмов O. polymorpha, O. parapolymorpha и O. angusta было выявлено отсутствие участка размером 18 п. н. от –494 до –476 п. н. относительно последовательности O. polymorpha. Выравнивание промоторов представлено в Дополнительных материалах 3.

Экспрессия гена MANS под контролем промоторов pOhMOX, pOpMOX, pOhFMD и pOhGAP. Плазмидами pOhMOX-MANS-HARS, pOhFMD-MANS-HARS, pOhGAP-MANS-HARS и pOpMOX-MANS-HARS (рис. 1, б), содержащими HARS и различающимися промотором перед геном MANS трансформировали дрожжи O. haglerorum. Известно, что в дрожжах O. polymorpha наличие HARS на плазмиде способствует поддержанию ее в эписомном состоянии [28], а интегративные плазмиды способны выщепляться из генома хозяина, захватывая участки ДНК, функционирующие как HARS и обеспечивающие автономную репликацию рекомбинантных плазмид [29]. В дрожжах O. polymorpha плазмиды, содержащие HARS, также могут интегрировать в геномную ДНК [30]. Для проведения исследования нами было отобрано по 12 трансформантов, в клетках которых содержались автономно реплицирующиеся плазмиды, сходные по размеру с исходными плазмидами (см. Дополнительные материалы 4). Подобный подход уже использовался ранее в исследованиях на дрожжах O. polymorpha [31, 32]. Эписомная локализация плазмид была подтверждена в тесте на митотическую стабильность. Отобранные трансформанты имели сходные ростовые характеристики: оптическая плотность культуры (OD600) составила 25 ± 2 ед. через 20 ч культивирования в селективной среде в пробирках.

По 12 трансформантов с каждой плазмидой культивировали в пробирках. Определяли активность β-маннаназы в супернатанте. Среднее значение активности β-маннаназы в супернатанте 12 трансформантов, содержащих плазмиду pOpMOX–MANS-HARS с промотором pOpMOX, составило 1900 ед./мл (См. Дополнительные материалы 5). В этих же образцах до индукции метанолом активность β-маннаназы не превышала 20–30 ед./мл. Поскольку конструкции экспрессионных плазмид (рис. 1б) отличаются только промоторной областью, то по разнице в активности β-маннаназы в супернатанте анализируемых трансформантов можно косвенно судить о силе промоторов. Активность β-маннаназы составляет 170, 93 и 89% в образцах, содержащих плазмиды с промоторами, соответственно, pOhMOX, pOhFMD и pOhGAP из O. haglerorum по сравнению с pOpMOX из O. polymorpha (рис. 3).

 

Рис. 3. Уровень активности маннаназы (ед./мл) в образцах с геном MANS под контролем промоторов: 1 — pOpMOX; 2 — pOhGAP; 3 — pOhFMD; 4 — pOhMOX. Пределы погрешностей показывают стандартное отклонение среднего значения активности 12 трансформантов. p < 0.05, ns — несущественное различие.

 

Проведение SDS-PAGE электрофореза показало, что β-маннаназа, секретированная трансформантами O. haglerorum, мигрирует в виде двух форм с молекулярной массой около 38 и 40 кДа, возможно из-за разной степени гликозилирования (рис. 4). В последовательности ManS имеется один сайт для N-гликозилирования согласно программе NetNGlyc 1.0 (www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/). Концентрация β-маннаназы в супернатанте трансформантов с промотором pOhMOX выше, чем с другими промоторами, и по количеству секретируемого белка в сторону снижения промоторы можно расположить следующим образом: pOhMOX, pOpMOX, pOhFMD, pOhGAP.

 

Рис. 4. Электрофорез в ПААГ с ДДС-Na рекомбинантной β-маннаназы, секретированной трансформантами O. haglerorum, содержащими плазмиды с промоторами pOhMOX, pOpMOX, pOhFMD и pOhGAP. 1, 7 — маркер молекулярной массы, кДа, 2 — pOhMOX, 3 — pOpMOX, 4 — pOhFMD; 5 — pOhGAP; 6 — образец с промотором pOpMOX в условиях без индукции.

 

Далее исследовали уровень транскрипционной активности гена MANS, контролируемого промоторами pOpMOX и pOhMOX, методом ПЦР в реальном времени (рис. 5). В шести независимых трансформантах с каждым из промоторов определяли изменение экспрессии (количества транскриптов) гена MANS после 12 и 20 ч индукции метанолом относительно образцов без индукции. За 100% был принят уровень экспрессии гена MANS под контролем промотора pOpMOX через 12 ч культивирования в среде с метанолом. Через 20 ч доля транскриптов гена MANS с промотора pOpMOX увеличилась приблизительно на 30%. Уровень транскрипции гена MANS с промотора pOhMOX оказался выше как через 12 ч, так и 20 ч индукции метанолом. Промотор pOhMOX из O. haglerorum активнее промотора pOpMOX из O. polymorpha приблизительно в 1.4–1.9 раз в этих условиях культивирования.

 

Рис. 5. Относительный уровень транскрипции гена MANS (%), находящегося под контролем промоторов pOhMOX (II) или pOpMOX (I). Показан средний уровень транскрипции гена MANS в 6 трансформантах с каждым из промоторов при культивировании в среде с метанолом в течение 12 (1) и 20 ч (2). Уровень транскрипции гена MANS под контролем pOpMOX через 12 ч индукции принят за 100%. Пределы погрешностей показывают стандартное отклонение для трех независимых экспериментов, p < 0.05.

 

Полученные нами данные свидетельствуют об увеличенной силе промотора pOhMOX по сравнению с pOpMOX при экспрессии в клетках O. haglerorum. Одним из возможных объяснений различий в уровне экспрессии этих промоторов является их структурная организация. Оба промотора, клонированные в плазмиды pOhMOX–MANS-HARS и pOpMOX–MANS-HARS, содержат TATA-бокс, предполагаемый сайт связывания с Mrx1 и UAS1 регуляторный элемент, однако в промоторе pOhMOX отсутствуют 22 п. н. на расстоянии –236 п. н. от стартового кодона ATG в непосредственной близости от сайта связывания транскрипционного регулятора Mxr1 (рис. 2). Возможно, отсутствие 22 п. н. приводит к усилению связывания Mxr1 с core-сайтом, повышая силу промотора pOhMOX в сравнении с промотором pOpMOX.

Результаты сравнения промоторов pOhMOX и pOhFMD по активности β-маннаназы согласуются с результатами, полученными Suppi et al., которые исследовали аналогичные промоторы из дрожжей O. polymorpha по активности гетерологичной β-глюкуронидазы из E. coli. [32]. Также нами показано, что активность конститутивного промотора pOhGAP сравнима с активностями индуцируемых промоторов pOpMOX и pOhFMD, что согласуется с работой Yan et al. [33].

Таким образом, нами были идентифицированы в дрожжах O. haglerorum гены MOX, FMD и GAP, определены последовательности соответствующих промоторов, которые были охарактеризованы в сравнении с pMOX из O. polymorpha на примере активности β-маннаназы, секретируемой из клеток трансформантов O. haglerorum. Промоторы pOhMOX и pOpMOX сравнили также по относительному уровню транскрипции гена MANS методом ПЦР в реальном времени, подтвердив, что промотор pOhMOX сильнее промотора гена MOX из дрожжей O. polymorpha в клетках дрожжей O. haglerorum. Полученные результаты расширяют спектр знаний о промоторах термотолерантных дрожжей рода Ogataea и позволят оптимизировать систему экспрессии метилотрофных дрожжей Ogataea haglerorum для продукции рекомбинантных белков.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации: грант Курчатовского центра геномных исследований № 075-15-2019-1659.

×

Sobre autores

D. Podpletnev

NRC «Kurchatov Institute»

Email: m_tarutina@mail.ru
Rússia, Moscow, 123182

A. Lapteva

NRC «Kurchatov Institute»

Email: m_tarutina@mail.ru
Rússia, Moscow, 123182

S. Sineoky

NRC «Kurchatov Institute»

Email: m_tarutina@mail.ru
Rússia, Moscow, 123182

M. Tarutina

NRC «Kurchatov Institute»

Autor responsável pela correspondência
Email: m_tarutina@mail.ru

Kurchatov Genomic Center

Rússia, Moscow, 123182

Bibliografia

  1. Abdel-Banat B.M.A., Hoshida H., Ano A., Nonklang S., Akada R. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 85. P. 861–867. https://doi.org/10.1007/s00253-009-2248-5
  2. Gödecke S., Eckart M., Janowicz Z. A., Hollenberg C. P. // Gene. 1994. V. 139. № 1. P. 35–42. https://doi.org/10.1016/0378-1119(94)90520-7
  3. Xu X., Ren S., Chen X., Ge J., Xu Z., Huang H. et al. // Virologica Sinica. 2014. V. 29. P. 403–409. https://doi.org/10.1007/s12250-014-3508-9.
  4. Bredell H., Smith J. J., Prins W. A., Gorgens J. F., van Zyl W. H. // FEMS Yeast Research. 2016. V. 16. № 2. https://doi.org/10.1093/femsyr/fow001.
  5. Bredell H., Smith J. J., Gorgens J. F., van Zyl W. H. // Yeast. 2018. V. 35. № 9. P. 519–529. https://doi.org/10.1002/yea.3318.
  6. Youn J. K., Shang L., Kim M. I., Jeong C. M., Chang H. N., Hahm M. S. et al. // J. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 20. № 11. P. 1534–1538. https://doi.org/10.4014/jmb.0909.09046
  7. Gellissen G., Janowicz Z. A., Merckelbach A., Piontek M., Keup P., Weydemann U. et al. // Bio/Technology. 1991. V. 9. № 3. P. 291–295. https://doi.org/10.1038/nbt0391-291
  8. Mayer A. F., Hellmuth K., Schlieker H., Lopez-Ulibarri R., Oertel S., Dahlems U. et al. // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 63. № 3. P. 373–381. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0290(19990505)63:3<373:: aid-bit14>3.0.co;2-t
  9. Smale S. T., Kadonaga J. T. // Annu. Rev. Biochem. 2003. Vol. 72. № 1. P. 449–479. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.72.121801.161520
  10. Portela R. M. C., Vogl T., Kniely C., Fischer J. E., Oliveira R., Glieder A. // ACS Synth. Biol. 2017. V. 6. № . 3. P. 471–484. https://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00178
  11. Bar-Ziv R., Brodsky S., Chapal M., Barkai N. // Cell Rep. 2020. V. 30. № 12. P. 3989–3995. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.02.114
  12. Lin-Cereghino G. P., Godfrey L., de la Cruz B. J., Johnson S., Khuongsathiene S., Tolstorukov I. et al. // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 3. P. 883–897. https://doi.org/10.1128/MCB.26.3.883-897.2006.
  13. Wang X. Wang Q., Wang J., Bai P., Shi L., Shen W., Ca M. // J. Biol. Chem. 2016. V. 291. № 12. P. 6245–6261. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.692053.
  14. Kranthi B. V., Kumar R., Kumar N. V., Rao D. N., Rangarajan P. N. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1789. № 6–8. P. 460–468. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2009.05.004
  15. Waterham H. R., Digan M. E., Koutz P. J., Lair S. V., Cregg V. // Gene. 1997. V. 186. № 1. P. 37–44. https://doi.org/10.1016/s0378-1119(96)00675-0
  16. Harnpicharnchai P., Promdonkoy P., Sae-Tang K., Roongsawang N., Tanapongpipat S. // Ann. Microbiol. 2014. V. 64. P. 1457–1462. https://doi.org/10.1007/s13213-013-0765-z
  17. Heo J. H., Hong W. K., Cho E. Y., Kim M. W., Kim J. Y., Kim C. H. et al. // FEMS Yeast Res. 2003. V. 4. № 2. P. 175–184. https://doi.org/10.1016/S1567-1356(03)00150-8
  18. Naumov G. I., Naumova E. S., Lee C. F. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017. V. 67. № 7. P. 2465–2469. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.002012.
  19. Тарутина М. Г., Каширская М. Д., Лазарева М. Н., Лаптева А. Р., Синеокий С.П // Биотехнология. 2019. Т. 35. № 6. С. 51–56.
  20. Патент РФ. 2022. № RU2764793 C1.
  21. Патент РФ. 2022. № RU2785901 C1.
  22. Sambrook J., Russell D. W. Molecular Сloning a Laboratory Manual. / Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
  23. Saraya R., Gidijala L., Veenhuis M., van der Klei I. J. // Methods Mol. Biol. 2014. P. 43–62. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0563-8_3
  24. Miller G. L. // Anal. Chem. 1959. V. 31. № 3. P. 426–428. https://doi.org/10.1021/ac60147a030
  25. Livak K. J., Schmittgen T. D. // Methods. 2001. V. 25. № 4. P. 402–408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
  26. Promdonkoy P., Tirasophon W., Roongsawang N., Eurwilaichitr L., Tanapongpipat S. // Curr. Microbiol. 2014. V. 69. P. 143–148. https://doi.org/10.1007/s00284-014-0568-x
  27. Pereira G. G., Hollenberg C. P. // Eur. J. Biochem. 1996. V. 238. № 1. P. 181–191. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1996.0181q.x.
  28. Roggenkamp R., Hansen H., Eckart M., Janowicz Z., Hollenberg C. P. // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 202. P. 302–308. https://doi.org/10.1099/00221287-132-12-3459
  29. Bogdanova A. I., Agaphonov M. O., Ter-Avanesyan M. D. // Yeast. 1995. V. 11. № 4. P. 343–353. https://doi.org/10.1002/yea.320110407
  30. Kim S. Y., Sohn J.-H., Bae J.-H., Pyun Y.-R., Agaphonov M. O., Ter-Avanesyan M.D., Choi E. S. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 8. P. 4448–4454. https://doi.org/10.1128/AEM.69.8.4448-4454.2003
  31. Amuel C., Gellissen G., Hollenberg C. P., Suckow M. // Biotechnol. Bioprocess Eng. 2000. V. 5. P. 247–252. https://doi.org/10.1007/BF02942181
  32. Suppi S., Michelson T., Viigand K., Alamae T. // FEMS Yeast Res. 2013. V. 13. № 2. P. 219–232. https://doi.org/10.1111/1567-1364.12023
  33. Yan C., Yu W., Yao L., Guo X., Zhou Y. J., Gao J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2022. V. 106. № 9–10. P. 3449–3464. https://doi.org/10.1007/s00253-022-11948-5

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Fig. 1. The scheme of the expression vector pOpMOX-Km (a) and the plasmid pOhMOX-MANS-HARS (b). The promoters of pOhFMD, pOhGAP and pOpMOX contain the plasmids pOhFMD-MANS-HARS (7986 bp), pOhGAP-MANS-HARS (8091 bp) and pOpMOX-MANS-HARS (7993 bp), respectively.

Baixar (197KB)
Metadados
3. Fig. 2. The sequence localized before the ATG codon of the OhMOX gene. The region between the open reading frames of adjacent genes is underlined. The putative sequences of URS (upstream repressing sequence), UAS1, UAS2 (upstream activator sequences) and TATA-box are highlighted in bold. The putative binding site for the CYCC core sequence of the Mrx1 homologue is shown in bold and italics. The start codon of the open reading frame for methanol oxidase (ATG) is shown in bold. The location of the missing 22 bp region is shown as a broken line.

Baixar (519KB)
Metadados
4. Fig. 3. Mannanase activity levels (U/ml) in samples with the MANS gene under the control of the promoters: 1 — pOpMOX; 2 — pOhGAP; 3 — pOhFMD; 4 — pOhMOX. Error bars show the standard deviation of the mean activity of 12 transformants. p < 0.05, ns — not significant difference.

Baixar (81KB)
Metadados
5. Fig. 4. SDS-PAGE electrophoresis of recombinant β-mannanase secreted by O. haglerorum transformants containing plasmids with pOhMOX, pOpMOX, pOhFMD, and pOhGAP promoters. 1, 7 — molecular weight marker, kDa, 2 — pOhMOX, 3 — pOpMOX, 4 — pOhFMD; 5 — pOhGAP; 6 — sample with pOpMOX promoter under conditions without induction.

Baixar (83KB)
Metadados
6. Fig. 5. Relative transcription level of the MANS gene (%) under the control of the pOhMOX (II) or pOpMOX (I) promoters. The average transcription level of the MANS gene in 6 transformants with each promoter during cultivation in a medium with methanol for 12 (1) and 20 h (2) is shown. The transcription level of the MANS gene under the control of pOpMOX after 12 h of induction is taken as 100%. Error bars show the standard deviation for three independent experiments, p < 0.05.

Baixar (81KB)
Metadados

Declaração de direitos autorais © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».