Удлинение линкерных последовательностей между антиген-узнающими модулями обеспечивает более эффективную наработку биспецифичных наноантител в периплазме E. coli

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Использование технологии получения однодоменных антител (молекул NANOBODY®, также обозначаемых как наноантитела, нАТ, или молекул на основе других стабильных белковых структур) и их производных для решения актуальных задач биомедицины становится всё более популярным. Действительно, формат одного небольшого хорошо растворимого белка со стабильной структурой, полнофункционального в плане специфического узнавания, очень удобен как модуль для создания мультивалентных, би-/олигоспецифичных таргетных генно-инженерных молекул и структур. Наработка нАТ в периплазме бактерии E. coli является очень удобным и достаточно универсальным способом получения аналитических количеств нАТ для первичного изучения свойств этих молекул и выбора наиболее перспективных вариантов. Сложнее пока обстоит дело с наработкой в таких же условиях би- и мультивалентных производных первично отбираемых нАТ. В данной работе разработаны и применены удлинённые линкерные последовательности (52 и 86 а.о.) между антиген-узнающими модулями в клонируемых экспрессионных конструкциях с целью повышения эффективности наработки биспецифичных наноантител (бсНТ) в периплазме бактерий E. coli. Три варианта модельных бсНТ, описанные в этом исследовании, были наработаны в периплазме бактерий и выделены в растворимом виде с сохранением функциональности всех белковых доменов. Если ранее наши попытки наработать в периплазме бсНТ с традиционными линкерами длиной не более 30 а.о. были безуспешными, то применённые здесь удлинённые линкеры обеспечили существенно более эффективную наработку бсНТ, сравнимую по эффективности с традиционной наработкой исходных мономерных нАТ. Использование сильно удлинённых линкеров, предположительно, может быть полезным для повышения эффективности наработки также и других бсНТ, и подобных им молекул в периплазме бактерий E. coli.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

С. В. Тиллиб

Институт биологии гена РАН; Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: tillib@genebiology.ru
Россия, 119334, Москва; 119991, Москва

О. С. Горяйнова

Институт биологии гена РАН; Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tillib@genebiology.ru
Россия, 119334, Москва; 119991, Москва

Список литературы

  1. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, E. B, Bendahman, N., and Hamers, R. (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 363, 446-448, https://doi.org/ 10.1038/363446a0.
  2. Flajnik, M. F., and Kasahara, M. (2010) Origin and evolution of the adaptive immune system: genetic events and selective pressures, Nat. Rev. Genet., 11, 47-59, https://doi.org/10.1038/nrg2703.
  3. Bannas, P., Hambach, J., and Koch-Nolte, F. (2017) Nanobodies and nanobody-based human heavy chain antibodies as antitumor therapeutics, Front Immunol., 8, 1603, https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01603.
  4. Jovčevska, I., and Muyldermans, S. (2020) The Therapeutic Potential of Nanobodies, BioDrugs, 34, 11-26, https:// doi.org/10.1007/s40259-019-00392-z.
  5. Тиллиб С. В. (2020) Перспективы использования однодоменных антител в биомедицине, Мол. Биол., 54, 362-373, https://doi.org/10.31857/S0026898420030167.
  6. Stone, E., Hirama, T., Tanha, J., Tong-Sevinc, H., Li, S., MacKenzie, C. R., and Zhang, J. (2007) The assembly of single domain antibodies into bispecific decavalent molecules, J. Immunol Methods, 318, 88-94, https://doi.org/10.1016/ j.jim.2006.10.006.
  7. Hultberg, A., Temperton, N. J., Rosseels, V., Koenders, M., Gonzalez-Pajuelo, M., Schepens, B., Ibañez, L. I, Vanlandschoot, P., Schillemans, J., Saunders, M., Weiss, R. A., Saelens, X., Melero, J. A., Verrips, C. T., Van Gucht, S., and de Haard, H. J. (2011) Llama-derived single domain antibodies to build multivalent, superpotent and broadened neutralizing anti-viral molecules, PLoS One, 6, e17665, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017665.
  8. Tillib, S., Ivanova, T. I., Vasilev, L. A., Rutovskaya, M. V., Saakyan, S. A., Gribova, I. Y., Tutykhina, I. L., Sedova, E. S., Lysenko, A. A., Shmarov, M. M., Logunov, D. Y., Naroditsky, B. S., and Gintsburg, A. L. (2013) Formatted single-domain antibodies can protect mice against infection with influenza virus (H5N2), Antiviral Res., 97, 245-254, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2012.12.014.
  9. Huet, H. A., Growney, J. D., Johnson, J. A., Li, J., Bilic, S., Ostrom, L., Zafari, M., Kowal, C., Yang, G., Royo, A., et al. (2014) Multivalent nanobodies targeting death receptor 5 elicit superior tumor cell killing through efficient caspase induction, mAbs, 6, 1560-1570, https://doi.org/10.4161/19420862.2014.975099.
  10. Laursen, N. S., Friesen, R. H. E., Zhu, X., Jongeneelen, M., Blokland, S., Vermond, J., van Eijgen, A., Tang, C., et al. (2018) Universal protection against influenza infection by a multidomain antibody to influenza hemagglutinin, Science, 362, 598-602, https://doi.org/10.1126/science.aaq0620.
  11. Efimov, G. A., Kruglov, A. A., Khlopchatnikova, Z. V., Rozov, F. N., Mokhonov, V. V., Rose-John, S., Scheller, J., Gordon, S., Stacey, M., Drutskaya, M. S., Tillib, S. V., and Nedospasov, S. A. (2016) Cell-type-restricted anti-cytokine therapy: TNF inhibition from one pathogenic source, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 3006-3011, https://doi.org/10.1073/pnas.1520175113.
  12. Hanke, L., Das, H., Sheward, D. J., Perez Vidakovics, L., Urgard, E., Moliner-Morro, A., Kim, C., Karl, V., Pankow, A., Smith, N. L., Porebski, B., Fernandez-Capetillo, O., et al. (2022) A bispecific monomeric nanobody induces spike trimer dimers and neutralizes SARS-CoV-2 in vivo, Nat. Commun., 13, 155, https://doi.org/10.1038/s41467-021-27610-z.
  13. Liu, Y., Ao, K., Bao, F., Cheng, Y., Hao, Y., Zhang, H., Fu, S., Xu, J., and Wu, Q. (2022) Development of a bispecific nanobody targeting CD20 on B-cell lymphoma cells and CD3 on T cells, Vaccines (Basel), 10, 1335, https://doi.org/10.3390/vaccines10081335.
  14. Ma, H., Zhang, X., Zeng, W., Zhou, J., Chi, X., Chen, S., Zheng, P., Wang, M., Wu, Y., Zhao, D., et al. (2022) A bispecific nanobody dimer broadly neutralizes SARS-CoV-1 & 2 variants of concern and offers substantial protection against Omicron via low-dose intranasal administration, Cell Discov., 8, 132, https://doi.org/10.1038/s41421-022-00497-w.
  15. De Marco, A. (2015) Recombinant antibody production evolves into multiple options aimed at yielding reagents suitable for application-specific needs, Microb. Cell Factories, 14, 125, https://doi.org/10.1186/s12934-015-0320-7.
  16. Sandomenico, A., Sivaccumar, J. P., and Ruvo, M. (2020) Evolution of Escherichia coli expression system in producing antibody recombinant fragments, Int. J. Mol. Sci., 21, 6324, https://doi.org/10.3390/ijms21176324.
  17. Huleani, S., Roberts, M. R., Beales, L., and Papaioannou, E. H. (2022) Escherichia coli as an antibody expression host for the production of diagnostic proteins: significance and expression, Crit. Rev. Biotechnol., 42, 756-753, https://doi.org/10.1080/07388551.2021.1967871.
  18. Skerra, A., and Plückthun, A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli, Science, 240, 1038-1041, https://doi.org/10.1126/science.3285470.
  19. Le Gall, F., Reusch, U., Little, M., and Kipriyanov, S. M. (2004) Effect of linker sequences between the antibody variable domains on the formation, stability and biological activity of a bispecific tandem diabody, Protein Eng. Des. Sel., 17, 357-366, https://doi.org/10.1093/protein/gzh039.
  20. Wang, Q., Chen, Y., Park, J., Liu, X., Hu, Y., Wang, T., McFarland, K., and Betenbaugh, M. J. (2019) Design and production of bispecific antibodies, Antibodies (Basel), 8, 43, https://doi.org/10.3390/antib8030043.
  21. Huang, C., Huang, J., Zhu, S., Tang, T., Chen, Y., and Qian, F. (2023) Chem. Eng. Sci., 270, 118521, https://doi.org/ 10.1016/j.ces.2023.118521.
  22. Roobrouck, A., and Stortelers, C. (2015) Bispecific nanobodies. Applicant – ABLYNX NV (Belgium). WIPO/PCT patent publication number WO2015044386 A1. Publication date April 2, 2015.
  23. Zettl, I., Ivanova, T., Zghaebi, M., Rutovskaya, M. V., Ellinger, I., Goryainova, O., Kollárová, J., Villazala-Merino, S., Lupinek, C., Weichwald, C., Drescher, A., Eckl-Dorna, J., Tillib, S. V., and Flicker, S. (2022) Generation of high affinity ICAM-1-specific nanobodies and evaluation of their suitability for allergy treatment, Front. Immunol., 13, 1022418, https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1022418.
  24. Zettl, I., Ivanova, T., Strobl, M. R., Weichwald, C., Goryainova, O., Khan, E., Rutovskaya, M. V., Focke-Tejkl, M., Drescher, A., Bohle, B., Flicker, S., and Tillib, S. V. (2022) Isolation of nanobodies with potential to reduce patients’ IgE binding to Bet v 1, Allergy, 77, 1751-1760, https://doi.org/10.1111/all.15191.
  25. Горяйнова О. С., Иванова Т. И., Рутовская М. В., Тиллиб С. В. (2017) Метод параллельного и последовательного генерирования однодоменных антител для протеомного анализа плазмы крови человека, Мол. Биол., 51, 985-996.
  26. Conrath, K. E., Lauwereys, M., Galleni, M., Matagne, A., Frère, J. M., Kinne, J., Wyns, L., and Muyldermans, S. (2001) Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae, Antimicrob. Agents Chemother., 45, 2807-2812, https://doi.org/10.1128/AAC.45.10.2807-2812.2001.
  27. Тиллиб С. В., Горяйнова О. С.(2024) Биспецифичные нанотела с удлиненными линкерными последовательностями между антиген-узнающими модулями для наработки в периплазме E. coli. Заявка на патент РФ № 2024101830 (от 25.01.2024), ФИПС, Москва.
  28. Baral, T. N., and Arbabi-Ghahroudi, M. (2012) Expression of single-domain antibodies in bacterial systems, Methods Mol Biol., 911, 257-275, https://doi.org/10.1007/978-1-61779-968-6_16.
  29. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема используемой экспрессионной конструкции для синтеза бсНТ и последовательности линкеров, разделяющих последовательности, кодирующие нАТ. Слева направо в конструкции обозначены: лактозный промоторный участок (Plac/operator); участок связывания с рибосомой (RBS); начало трансляции (стрелка); сигнальный пептид для периплазматической локализации (pelB); последовательности, кодирующие нАТ (VHH1 и VHH2), разделённые линкерной последовательностью (аминокислотные последовательности использованных линкеров указаны в нижней части рисунка); последовательности HA-тага (YPYDVPDYA) и шесть остатков гистидина на самом конце. ILZ – тримеризующийся домен, «изолейциновая молния»

Скачать (95KB)
Метаданные
3. Рис. 2. SDS-PAGE и иммуноферментный анализ бсНТ aBet-л1-aICAM1 и aICAM1-л1-aBet. а – Электрофоретическое разделение в 5–19%-ном градиентном SDS-полиакриламидном геле белков периплазматических экстрактов (1, 2) и аффинно очищенных нАТ (3, 4). Стрелкой показано положение бсНТ. В крайней левой дорожке нанесён маркер (М) и указаны (в кДа) размеры маркерных полос. б – Иммуноанализ связывания полученных бсНТ в концентрации 0,4 мкг/мл с иммобилизованными рекомбинантными антигенами. Представлены усреднённые данные трёх измерений с указанием области разброса данных

Скачать (75KB)
Метаданные
4. Рис. 3. SDS-PAGE и иммуноферментный анализ бсНТ aHA-л2-E7(aIgA), также обозначаемого (HN-E7)x3. а – Электрофоретическое разделение в 5–19%-ном градиентном SDS-полиакриламидном геле аффинно очищенного бсНТ, исходного (1), проскока на фильтре с номинальным отсечением по молекулярной массе 100 кДа (2), очищенного от мелких примесей и, предположительно, тримеризованного бсНТ (3), задержанного над фильтром с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Стрелкой показано положение мономерного бсНТ. В крайней правой дорожке нанесён маркер (М) и указаны (в кДа) размеры маркерных полос. б – Иммуноанализ связывания полученных бсНТ (HN-E7)x3, а также контрольных моновалентных нАТ (E7 – против IgA и HN13 – против гемагглютинина HA-H5 вируса птичьего гриппа) в концентрации 1 мкг/мл с иммобилизованными рекомбинантными антигенами (IgA и HA-H5). Контрольные лунки были без антигена (столбцы «без АГ»). Представлены усреднённые данные трёх измерений с указанием области разброса данных

Скачать (75KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».