Extending linker sequences between antigen-recognition modules provides more effective production of bispecific nanoantibodies in the periplasma of E. coli

Мұқаба

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Ашық рұқсат Ашық рұқсат
Рұқсат жабық Рұқсат берілді
Рұқсат жабық Тек жазылушылар үшін

Аннотация

The use of technology for the production of single-domain antibodies (NANOBODY® molecules, also referred to as nanoantibodies, nAb, or molecules based on other stable protein structures) and their derivatives to solve current problems in biomedicine is becoming increasingly popular. Indeed, the format of one small, highly soluble protein with a stable structure, fully functional in terms of specific recognition, is very convenient as a module for creating multivalent, bi-/oligo-specific genetically engineered targeting molecules and structures. The production of nAb in the periplasm of the E. coli bacterium is a very convenient and fairly universal way to obtain analytical quantities of nAb for the initial study of the properties of these molecules and the selection of the most promising nAb options. The situation is more complicated with the production of bi- and multivalent derivatives of initially selected nAbs under the same conditions. In this work, extended linker sequences (52 and 86 aa) between antigen-recognition modules in cloned expression constructs were developed and applied in order to increase the efficiency of production of bispecific nanoantibodies (bsNB) in the periplasm of E. coli bacteria. Three variants of model bsNBs described in this study were produced in the periplasm of bacteria and isolated in soluble form with preservation of the functionality of all protein domains. If earlier our attempts to produce bsNB in the periplasm with traditional linkers no longer than 30 aa were unsuccessful, the extended linkers used here provided a significantly more efficient production of bsNB, comparable in efficiency to the traditional production of the original monomeric nAbs. The use of highly elongated linkers can presumably be useful for increasing the efficiency of production of other bsNBs and similar molecules in the periplasm of E. coli bacteria.

Толық мәтін

Рұқсат жабық

Авторлар туралы

S. Tillib

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: tillib@genebiology.ru
Ресей, 119334, Moscow; 119991, Moscow

O. Goryainova

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: tillib@genebiology.ru
Ресей, 119334, Moscow; 119991, Moscow

Әдебиет тізімі

  1. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, E. B, Bendahman, N., and Hamers, R. (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 363, 446-448, https://doi.org/ 10.1038/363446a0.
  2. Flajnik, M. F., and Kasahara, M. (2010) Origin and evolution of the adaptive immune system: genetic events and selective pressures, Nat. Rev. Genet., 11, 47-59, https://doi.org/10.1038/nrg2703.
  3. Bannas, P., Hambach, J., and Koch-Nolte, F. (2017) Nanobodies and nanobody-based human heavy chain antibodies as antitumor therapeutics, Front Immunol., 8, 1603, https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01603.
  4. Jovčevska, I., and Muyldermans, S. (2020) The Therapeutic Potential of Nanobodies, BioDrugs, 34, 11-26, https:// doi.org/10.1007/s40259-019-00392-z.
  5. Тиллиб С. В. (2020) Перспективы использования однодоменных антител в биомедицине, Мол. Биол., 54, 362-373, https://doi.org/10.31857/S0026898420030167.
  6. Stone, E., Hirama, T., Tanha, J., Tong-Sevinc, H., Li, S., MacKenzie, C. R., and Zhang, J. (2007) The assembly of single domain antibodies into bispecific decavalent molecules, J. Immunol Methods, 318, 88-94, https://doi.org/10.1016/ j.jim.2006.10.006.
  7. Hultberg, A., Temperton, N. J., Rosseels, V., Koenders, M., Gonzalez-Pajuelo, M., Schepens, B., Ibañez, L. I, Vanlandschoot, P., Schillemans, J., Saunders, M., Weiss, R. A., Saelens, X., Melero, J. A., Verrips, C. T., Van Gucht, S., and de Haard, H. J. (2011) Llama-derived single domain antibodies to build multivalent, superpotent and broadened neutralizing anti-viral molecules, PLoS One, 6, e17665, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017665.
  8. Tillib, S., Ivanova, T. I., Vasilev, L. A., Rutovskaya, M. V., Saakyan, S. A., Gribova, I. Y., Tutykhina, I. L., Sedova, E. S., Lysenko, A. A., Shmarov, M. M., Logunov, D. Y., Naroditsky, B. S., and Gintsburg, A. L. (2013) Formatted single-domain antibodies can protect mice against infection with influenza virus (H5N2), Antiviral Res., 97, 245-254, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2012.12.014.
  9. Huet, H. A., Growney, J. D., Johnson, J. A., Li, J., Bilic, S., Ostrom, L., Zafari, M., Kowal, C., Yang, G., Royo, A., et al. (2014) Multivalent nanobodies targeting death receptor 5 elicit superior tumor cell killing through efficient caspase induction, mAbs, 6, 1560-1570, https://doi.org/10.4161/19420862.2014.975099.
  10. Laursen, N. S., Friesen, R. H. E., Zhu, X., Jongeneelen, M., Blokland, S., Vermond, J., van Eijgen, A., Tang, C., et al. (2018) Universal protection against influenza infection by a multidomain antibody to influenza hemagglutinin, Science, 362, 598-602, https://doi.org/10.1126/science.aaq0620.
  11. Efimov, G. A., Kruglov, A. A., Khlopchatnikova, Z. V., Rozov, F. N., Mokhonov, V. V., Rose-John, S., Scheller, J., Gordon, S., Stacey, M., Drutskaya, M. S., Tillib, S. V., and Nedospasov, S. A. (2016) Cell-type-restricted anti-cytokine therapy: TNF inhibition from one pathogenic source, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 3006-3011, https://doi.org/10.1073/pnas.1520175113.
  12. Hanke, L., Das, H., Sheward, D. J., Perez Vidakovics, L., Urgard, E., Moliner-Morro, A., Kim, C., Karl, V., Pankow, A., Smith, N. L., Porebski, B., Fernandez-Capetillo, O., et al. (2022) A bispecific monomeric nanobody induces spike trimer dimers and neutralizes SARS-CoV-2 in vivo, Nat. Commun., 13, 155, https://doi.org/10.1038/s41467-021-27610-z.
  13. Liu, Y., Ao, K., Bao, F., Cheng, Y., Hao, Y., Zhang, H., Fu, S., Xu, J., and Wu, Q. (2022) Development of a bispecific nanobody targeting CD20 on B-cell lymphoma cells and CD3 on T cells, Vaccines (Basel), 10, 1335, https://doi.org/10.3390/vaccines10081335.
  14. Ma, H., Zhang, X., Zeng, W., Zhou, J., Chi, X., Chen, S., Zheng, P., Wang, M., Wu, Y., Zhao, D., et al. (2022) A bispecific nanobody dimer broadly neutralizes SARS-CoV-1 & 2 variants of concern and offers substantial protection against Omicron via low-dose intranasal administration, Cell Discov., 8, 132, https://doi.org/10.1038/s41421-022-00497-w.
  15. De Marco, A. (2015) Recombinant antibody production evolves into multiple options aimed at yielding reagents suitable for application-specific needs, Microb. Cell Factories, 14, 125, https://doi.org/10.1186/s12934-015-0320-7.
  16. Sandomenico, A., Sivaccumar, J. P., and Ruvo, M. (2020) Evolution of Escherichia coli expression system in producing antibody recombinant fragments, Int. J. Mol. Sci., 21, 6324, https://doi.org/10.3390/ijms21176324.
  17. Huleani, S., Roberts, M. R., Beales, L., and Papaioannou, E. H. (2022) Escherichia coli as an antibody expression host for the production of diagnostic proteins: significance and expression, Crit. Rev. Biotechnol., 42, 756-753, https://doi.org/10.1080/07388551.2021.1967871.
  18. Skerra, A., and Plückthun, A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli, Science, 240, 1038-1041, https://doi.org/10.1126/science.3285470.
  19. Le Gall, F., Reusch, U., Little, M., and Kipriyanov, S. M. (2004) Effect of linker sequences between the antibody variable domains on the formation, stability and biological activity of a bispecific tandem diabody, Protein Eng. Des. Sel., 17, 357-366, https://doi.org/10.1093/protein/gzh039.
  20. Wang, Q., Chen, Y., Park, J., Liu, X., Hu, Y., Wang, T., McFarland, K., and Betenbaugh, M. J. (2019) Design and production of bispecific antibodies, Antibodies (Basel), 8, 43, https://doi.org/10.3390/antib8030043.
  21. Huang, C., Huang, J., Zhu, S., Tang, T., Chen, Y., and Qian, F. (2023) Chem. Eng. Sci., 270, 118521, https://doi.org/ 10.1016/j.ces.2023.118521.
  22. Roobrouck, A., and Stortelers, C. (2015) Bispecific nanobodies. Applicant – ABLYNX NV (Belgium). WIPO/PCT patent publication number WO2015044386 A1. Publication date April 2, 2015.
  23. Zettl, I., Ivanova, T., Zghaebi, M., Rutovskaya, M. V., Ellinger, I., Goryainova, O., Kollárová, J., Villazala-Merino, S., Lupinek, C., Weichwald, C., Drescher, A., Eckl-Dorna, J., Tillib, S. V., and Flicker, S. (2022) Generation of high affinity ICAM-1-specific nanobodies and evaluation of their suitability for allergy treatment, Front. Immunol., 13, 1022418, https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1022418.
  24. Zettl, I., Ivanova, T., Strobl, M. R., Weichwald, C., Goryainova, O., Khan, E., Rutovskaya, M. V., Focke-Tejkl, M., Drescher, A., Bohle, B., Flicker, S., and Tillib, S. V. (2022) Isolation of nanobodies with potential to reduce patients’ IgE binding to Bet v 1, Allergy, 77, 1751-1760, https://doi.org/10.1111/all.15191.
  25. Горяйнова О. С., Иванова Т. И., Рутовская М. В., Тиллиб С. В. (2017) Метод параллельного и последовательного генерирования однодоменных антител для протеомного анализа плазмы крови человека, Мол. Биол., 51, 985-996.
  26. Conrath, K. E., Lauwereys, M., Galleni, M., Matagne, A., Frère, J. M., Kinne, J., Wyns, L., and Muyldermans, S. (2001) Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae, Antimicrob. Agents Chemother., 45, 2807-2812, https://doi.org/10.1128/AAC.45.10.2807-2812.2001.
  27. Тиллиб С. В., Горяйнова О. С.(2024) Биспецифичные нанотела с удлиненными линкерными последовательностями между антиген-узнающими модулями для наработки в периплазме E. coli. Заявка на патент РФ № 2024101830 (от 25.01.2024), ФИПС, Москва.
  28. Baral, T. N., and Arbabi-Ghahroudi, M. (2012) Expression of single-domain antibodies in bacterial systems, Methods Mol Biol., 911, 257-275, https://doi.org/10.1007/978-1-61779-968-6_16.
  29. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар
Әрекет
1. JATS XML
Жүктеу
2. Fig. 1. The scheme of the expression structure used for the synthesis of bsNT and the sequence of linkers separating the sequences encoding nAT. From left to right, the design indicates: the lactose promoter site (Plac/operator); the ribosome binding site (RBS); the beginning of translation (arrow); the signal peptide for periplasmic localization (pelB); the sequences encoding nAT (VHH1 and VHH2) separated by a linker sequence (the amino acid sequences of the used linkers are indicated at the bottom drawing); HA-tag sequences (YPYDVPDYA) and six histidine residues at the very end. ILZ is a trimerizing domain, "isoleucine lightning"

Жүктеу (95KB)
Метадеректер
3. Fig. 2. SDS-PAGE and enzyme immunoassay of bsNT aBet-l1-aICAM1 and aICAM1-l1-aBet. a is the electrophoretic separation in a 5-19% gradient SDS polyacrylamide gel of proteins from periplasmic extracts (1, 2) and affine purified NATs (3, 4). The arrow shows the position of the bsNT. There is a marker (M) in the leftmost track and the dimensions of the marker strips are indicated (in kDa). b – Immunoassay of binding of the obtained bsNT at a concentration of 0.4 mcg/ml with immobilized recombinant antigens. The averaged data of three dimensions are presented, indicating the area of data dispersion

Жүктеу (75KB)
Метадеректер
4. Fig. 3. SDS-PAGE and enzyme immunoassay of bsNT aHA-l2-E7(aIgA), also referred to as (HN-E7)x3. a – Electrophoretic separation in a 5-19% gradient SDS polyacrylamide gel of affine purified bsNT, initial (1), overshoot on a filter with a nominal molecular cutoff a mass of 100 kDa (2), purified from fine impurities and, presumably, trimerized bsNT (3), delayed above the filter with a molecular weight cutoff of 100 kDa. The arrow shows the position of the monomeric bsNT. A marker (M) is applied in the rightmost track and the dimensions of the marker strips are indicated (in kDa). b – Immunoassay of binding of the obtained bsNT (HN-E7)x3, as well as control monovalent NATs (E7 – against IgA and HN13 – against hemagglutinin HA-H5 avian influenza virus) at a concentration of 1 mcg/ml with immobilized recombinant antigens (IgA and HA-H5). The control wells were without antigen (columns "without AG"). The averaged data of three dimensions are presented, indicating the area of data dispersion

Жүктеу (75KB)
Метадеректер

© Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».