Роль аминокислот каталитического домена интегразы ВИЧ-1, I182, R187, K188, в процессах обратной транскрипции и интеграции

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

В основе структурной организации интегразы ВИЧ-1 лежит тетрамер, сформированный двумя димерами белка. В составе этого тетрамера каталитический домен одной из субъединиц первого димера взаимодействует с N-концевым доменом субъединицы из второго димера. Именно тетрамерная структура позволяет правильно позиционировать два конца вирусной ДНК относительно ДНК клетки и осуществлять каталитические функции интегразы – 3′-процессинг и перенос цепи. Однако в ходе репликативного цикла ВИЧ-1 интеграза отвечает не только за этап интеграции: она участвует в обратной транскрипции, а также необходима на стадии формирования капсида вновь образуемых вирионов. Предполагается, что интеграза ВИЧ-1 является структурно-динамичным белком, и от ее структуры зависят ее биологические функции. Соответственно, изучение взаимодействий между доменами интегразы, обеспечивающими ее структуру, важно для понимания ее множественных функций. В настоящей работе исследована роль трех аминокислот каталитического домена, I182, R187 и K188, из области контакта двух димеров интегразы в структуре тетрамера в протекании стадий обратной транскрипции и интеграции. Установлено, что остаток R187 чрезвычайно важен для формирования правильной структуры интегразы, необходимой на всех этапах ее функциональной активности. Остаток I182 необходим для успешной интеграции и не важен для обратной транскрипции, а остаток K188, наоборот, участвует в формировании структуры интегразы, важной для эффективной обратной транскрипции.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Т. Ф. Кихай

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

Ю. Ю. Агапкина

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

Т. А. Приказчикова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

М. В. Вдовина

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

С. П. Шехтман

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

C. В. Фомичева

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

С. П. Королев

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

М. Б. Готтих

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: gottikh@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Wiskerchen, M., and Muesing, M. A. (1995) Human immunodeficiency virus type 1 integrase: effects of mutations on viral ability to integrate, direct viral gene expression from unintegrated viral DNA templates, and sustain viral propagation in primary cells, J. Virol., 69, 376-386, https://doi.org/10.1128/JVI.69.1.376-386.1995.
  2. Engelman, A. N., and Kvaratskhelia, M. (2022) Multimodal functionalities of HIV-1 integrase, Viruses, 14, 926, https://doi.org/10.3390/v14050926.
  3. Wu, X., Liu, H., Xiao, H., Conway, J. A., Hehl, E., Kalpana, G. V., Prasad, V., and Kappes, J. C. (1999) Human immunodeficiency virus type 1 integrase protein promotes reverse transcription through specific interactions with the nucleoprotein reverse transcription complex, J. Virol., 73, 2126-2135, https://doi.org/10.1128/JVI.73.3. 2126-2135.1999.
  4. Engelman, A., Englund, G., Orenstein, J. M., Martin, M. A., and Craigie, R. (1995) Multiple effects of mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase on viral replication, J. Virol., 69, 2729-2736, https://doi.org/10.1128/JVI.69.5.2729-2736.1995.
  5. Leavitt, A. D., Robles, G., Alesandro, N., and Varmus, H. E. (1996) Human immunodeficiency virus type 1 integrase mutants retain in vitro integrase activity yet fail to integrate viral DNA efficiently during infection, J. Virol., 70, 721-728, https://doi.org/10.1128/JVI.70.2.721-728.1996.
  6. Elliott, J., Eschbach, J. E., Koneru, P. C., Li, W., Puray-Chavez, M., Townsend, D., Lawson, D. Q., Engelman, A. N., Kvaratskhelia, M., and Kutluay, S. B. (2020) Integrase-RNA interactions underscore the critical role of integrase in HIV-1 virion morphogenesis, Elife, 9, e54311, https://doi.org/10.7554/eLife.54311.
  7. Kessl, J. J., Kutluay, S. B., Townsend, D., Rebensburg, S., Slaughter, A., Larue, R. C., Shkriabai, N., Bakouche, N., Fuchs, J. R., Bieniasz, P. D., and Kvaratskhelia, M. (2016) HIV-1 integrase binds the viral RNA genome and is essential during virion morphogenesis, Cell, 166, 1257-1268.e12, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.07.044.
  8. Briones, M. S., Dobard, C. W., and Chow, S. A. (2010) Role of human immunodeficiency virus type 1 integrase in uncoating of the viral core, J. Virol., 84, 5181-5190, https://doi.org/10.1128/jvi.02382-09.
  9. Rozina, A., Anisenko, A., Kikhai, T., Silkina, M., and Gottikh, M. (2022) Complex relationships between HIV-1 integrase and its cellular partners, Int. J. Mol. Sci., 23, 12341, https://doi.org/10.3390/ijms232012341.
  10. Knyazhanskaya, E., Anisenko, A., Shadrina, O., Kalinina, A., Zatsepin, T., Zalevsky, A., Mazurov, D., and Gottikh, M. (2019) NHEJ pathway is involved in post-integrational DNA repair due to Ku70 binding to HIV-1 integrase, Retrovirology, 16, 30, https://doi.org/10.1186/s12977-019-0492-z.
  11. Агапкина Ю., Приказчикова Т., Смолов М., Готтих М. (2005) Структура и функции интегразы ВИЧ-1, Успехи биологической химии, 45, 87-112.
  12. Hare, S., Di Nunzio, F., Labeja, A., Wang, J., Engelman, A., and Cherepanov, P. (2009) Structural basis for functional tetramerization of lentiviral integrase, PLoS Pathog., 5, e1000515, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000515.
  13. Passos, D. O., Li, M., Yang, R., Rebensburg, S. V., Ghirlando, R., Jeon, Y., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Craigie, R., and Lyumkis, D. (2017) Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome, Science, 355, 89-92, https://doi.org/10.1126/science.aah5163.
  14. Ballandras-Colas, A., Maskell, D. P., Serrao, E., Locke, J., Swuec, P., Jónsson, S. R., Kotecha, A., Cook, N. J., Pye, V. E., Taylor, I. A., Andrésdóttir, V., Engelman, A. N., Costa, A., and Cherepanov, P. (2017) A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration, Science, 355, 93-95, https://doi.org/10.1126/science.aah7002.
  15. Berthoux, L., Sebastian, S., Muesing, M. A., and Luban, J. (2007) The role of lysine 186 in HIV-1 integrase multimerization, Virology, 364, 227-236, https://doi.org/10.1016/j.virol.2007.02.029.
  16. Knyazhanskaya, E. S., Smolov, M. A., Kondrashina, O. V., and Gottikh, M. B. (2009) Relative comparison of catalytic characteristics of human foamy virus and HIV-1 integrases, Acta Naturae, 1, 78-80, https://doi.org/ 10.32607/20758251-2009-1-2-78-80.
  17. Mazurov, D., Ilinskaya, A., Heidecker, G., Lloyd, P., and Derse, D. (2010) Quantitative comparison of HTLV-1 and HIV-1 cell-to-cell infection with new replication dependent vectors, PLoS Pathog., 6, e1000788, https://doi.org/ 10.1371/journal.ppat.1000788.
  18. Vandergeeten, C., Fromentin, R., Merlini, E., Lawani, M. B., DaFonseca, S., Bakeman, W., McNulty, A., Ramgopal, M., Michael, N., Kim, J. H., Ananworanich, J., and Chomont, N. (2014) Cross-clade ultrasensitive PCR-based assays to measure HIV persistence in large-cohort studies, J. Virol., 88, 12385-12396, https://doi.org/10.1128/jvi.00609-14.
  19. McKee, C. J., Kessl, J. J., Shkriabai, N., Dar, M. J., Engelman, A., and Kvaratskhelia, M. (2008) Dynamic modulation of HIV-1 integrase structure and function by cellular lens epithelium-derived growth factor (LEDGF) protein, J. Biol. Chem., 283, 31802-31812, https://doi.org/10.1074/jbc.M805843200.
  20. Shadrina, O. A., Zatsepin, T. S., Agapkina, Yu. Yu., Isaguliants, M. G., and Gottikh, M. B. (2015) Influence of drug resistance mutations on the activity of HIV-1 subtypes A and B integrases: a comparative study, Acta Naturae, 7, 78-86, https://doi.org/10.32607/20758251-2015-7-1-78-86.
  21. Takahata, T., Takeda, E., Tobiume, M., Tokunaga, K., Yokoyama, M., Huang, Y.-L., Hasegawa, A., Shioda, T., Sato, H., Kannagi, M., and Masuda, T. (2017) Critical contribution of Tyr15 in the HIV-1 integrase (IN) in facilitating IN assembly and nonenzymatic function through the IN precursor form with reverse transcriptase, J. Virol., https:// doi.org/10.1128/jvi.02003-16.
  22. Lu, R., Limón, A., Devroe, E., Silver, P. A., Cherepanov, P., and Engelman, A. (2004) Class II integrase mutants with changes in putative nuclear localization signals are primarily blocked at a postnuclear entry step of human immunodeficiency virus type 1 replication, J. Virol., 78, 12735-12746, https://doi.org/10.1128/jvi.78.23.12735-12746.2004.
  23. Elliott, J. L., and Kutluay, S. B. (2020) Going beyond integration: the emerging role of HIV-1 integrase in virion morphogenesis, Viruses, 12, 1005, https://doi.org/10.3390/v12091005.
  24. Gallay, P., Hope, T., Chin, D., and Trono, D. (1997) HIV-1 infection of nondividing cells through the recognition of integrase by the importin/karyopherin pathway (nuclear import human immunodeficiency virus), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 9825-9830, https://doi.org/10.1073/pnas.94.18.9825.
  25. Tsurutani, N., Kubo, M., Maeda, Y., Ohashi, T., Yamamoto, N., Kannagi, M., and Masuda, T. (2000) Identification of critical amino acid residues in human immunodeficiency virus type 1 IN required for efficient proviral DNA Formation at steps prior to integration in dividing and nondividing cells the multiple effects of in mutations suggest that, J. Virol., 74, 4795-4806, https://doi.org/10.1128/jvi.74.10.4795-4806.2000.
  26. De Houwer, S., Demeulemeester, J., Thys, W., Taltynov, O., Zmajkovicova, K., Christ, F., and Debyser, Z. (2012) Identification of residues in the C-terminal domain of HIV-1 integrase that mediate binding to the transportin-SR2 protein, J. Biol. Chem., 287, 34059-34068, https://doi.org/10.1074/jbc.M112.387944.
  27. Liat Shimoni, H., and Glusker, J. P. (1995) Hydrogen bonding motifs of protein side chains: descriptions of binding of arginine and amide groups, Protein Sci., 4, 65-74, https://doi.org/10.1002/pro.5560040109.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Относительный уровень люминесценции люциферазы светлячка в клетках, трансдуцированных псевдовирусами с ИН дикого типа (ИН_wt) и ее мутантными вариантами: ИН_I182A, ИН_R187A и ИН_K188A. Сигнал люциферазы измеряли через 24 ч после трансдукции, и результаты нормализовали на экспрессию люциферазы псевдовируса с ИН_wt. Представлены средние значения трех независимых экспериментов. Значимость определялась двусторонним дисперсионным анализом с поправкой Шидака на множественные сравнения; ** p < 0,01; *** p < 0,001

Скачать (93KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Относительное количество общей вирусной кДНК (а) и интегрированной вирусной кДНК (б) после трансдукции клеток HEK 293T псевдовирусами с ИН_wt и мутантными белками. Представлены средние значения трех независимых экспериментов. Значимость определялась двусторонним дисперсионным анализом с поправкой Шидака на множественные сравнения; *** p < 0,001; ns – не значимо

Скачать (164KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофоретический анализ каталитической активности ИН_wt и мутантов ИН_I182A, ИН_R187A, ИН_K188A в реакциях 3′-процессинга (а) и переноса цепи (б). а – Дуплекс U5B/U5A без ИН (дорожка 1); в присутствии ИН_wt (дорожки 2, 3); в присутствии ИН_K188A (дорожки 4, 5); в присутствии ИН_I182A (дорожки 6–9); в присутствии ИН_R187А (дорожки 10–13). Реакцию проводили с 5 нМ ДНК-дуплексом и увеличивающимися концентрациями ИН: 100 нМ (дорожки 2, 4, 6, 10); 200 нМ (дорожки 3, 5, 7, 11); 400 нМ (дорожки 8, 12) и 800 нМ (дорожки 9, 13). б – Дуплекс U5B-2/U5A без ИН (дорожка 1); в присутствии ИН_wt (дорожки 2, 3); в присутствии ИН_K182A (дорожки 4, 5); в присутствии ИН_I187A (дорожки 6, 7); присутствии ИН_R188А (дорожки 8, 9). Реакцию проводили с 10 нМ ДНК-дуплексом и концентрациями ИН: 100 нМ (дорожки 2, 4, 6, 8) и 200 нМ (дорожки 3, 5, 7, 9)

Скачать (155KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Влияние аминокислотных замен I182A, R187A и K188A в ИН на эффективность ее связывания с ДНК-субстратом и с TAR-РНК. a – Кривые связывания ИН с ДНК-дуплексом U5B/U5A, полученные методом торможения в геле. 5 нМ ДНК-субстрат инкубировали с ИН в разных концентрациях: 0, 25, 50, 100, 200 и 500 нМ. б – Кривые связывания ИН с TAR-РНК, полученные методом торможения в геле. 5 нМ TAR-РНК инкубировали с ИН в разных концентрациях: 0, 25, 50, 100, 200, 500 нМ

Скачать (184KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Анализ взаимодействия ОТ с ИН дикого типа (ИН_wt) и с заменами I182A, R187A, K188A, содержащими N-концевой GST-таг, методом соосаждения на глутатион-сефарозе. ОT при отсутствии ИН (дорожка 1); ОT в присутствии ИН_wt (дорожка 2); ОT в присутствии ИН_I182A (дорожка 3); ОT в присутствии ИН_R187A (дорожка 4); ОT в присутствии ИН_K188A (дорожка 5). Инкубация ИН и ОТ в концентрации 250 нM проводилась в течение 30 мин при 4 °С

Скачать (76KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Анализ эффективности обмена субъединицами для ИН_wt и с заменами I182A, R187A и K188A. 100 нМ GST-ИН инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с белками, содержащими His6-таг: ИН_wt (дорожки 1, 2), ИН_K182A (дорожки 3, 4), ИН_I187A (дорожки 5, 6), ИН_R188А (дорожки 7, 8). Концентрации белков с His6-тагом: 100 нМ (дорожки 1, 3, 5, 7) и 200 нМ (дорожки 2, 4, 6, 8). Дорожка 9 – контроль без GST-ИН

Скачать (81KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Расположение аминокислот I182, R187 и K188 в структуре ИН (по данным Passos et al. [13] (PDB 5U1C)). а – Структура тетрамера ИН ВИЧ-1. Разными цветами отмечены отдельные субъединицы ИН. б – Прямоугольником выделено и увеличено место расположения аминокислот I182, R187 и K188 (выделены ярко-желтым) каталитического домена одной субъединицы (выделен зеленым) и N-концевого домена другой субъединицы (выделен бирюзовым). в–д – Окружение аминокислот I182, R187 и K188 соответственно

Скачать (587KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».