DESIGNING A THERMOSTABLE MINI-INTEIN FOR INTEIN-MEDIATED PURIFICATION OF RECOMBINANT PROTEINS AND PEPTIDES

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

This paper reports design of a thermostable temperature-activated mini-intein based on the full-length intein DnaE1 from Thermus thermophilus HB27 (TthDnaE1). We performed rational design of three mini-inteins TthDnaE1 Δ272, Δ280 and Δ287 through deletion mutations in the full-length intein sequence. Two mini-inteins (Δ272 and Δ280) were capable of efficient protein splicing at temperatures above 50°C. The most active mini-intein with the Δ280 deletion was chosen as the basis for further design of a self-cleaving carrier of affinity tags through single-point mutagenesis. We performed the C1A, D405G and C1A/D405G mutations, which were proposed to eliminate the intein’s capability of N-terminal extein cleavage and extein ligation. As a result, the mini-intein Δ280 with double mutation C1A/D405G displayed the highest efficiency of C-terminal extein cleavage at its temperature optimum around 60°C. Thus, we constructed thermostable temperature-activated mini-inteins capable of efficient protein splicing or cleavage of C-terminal extein. The engineered TthDnaE1 Δ280 C1A/D405G mini-intein can serve as basis for the development of new expression system for intein-mediated production of pharmaceutical recombinant proteins and peptides.

About the authors

A. A. Karanov

Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University

Email: andrey-karanov2000@mail.ru
Moscow, Russia; Moscow, Russia

E. A. Zayats

Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Moscow, Russia

M. A. Kostromina

Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Moscow, Russia

Yu. A. Abramchik

Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Moscow, Russia

A. R. Sharafutdinova

Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Moscow, Russia

M. S. Surkova

Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Moscow, Russia

A. A. Zamyatnin

Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

R. S. Esipov

Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia; Moscow, Russia

References

  1. Ben-Bassat, A. (1991) Purification and Analysis of Recombinant Proteins (Seetharam, R., and Sharma, S. K., eds), Marcel Dekker, N.Y., pp. 147-151.
  2. Enfors, S. O. (1992) Control of in vivo proteolysis in the production of recombinant proteins, Trends Biotechnol, 10, 310-315, https://doi.org/10.1016/0167-7799(92)90256-u.
  3. Mahmoodi, S., Pourhassan-Moghaddam, M., Wood, D. W., Majdi, H., and Zarghami, N. (2019) Current affinity approaches for purification of recombinant proteins, Cogent Biol., 5, 1665406, https://doi.org/10.1080/23312025.2019.1665406.
  4. Eskandari, A., Leow, T. C., Rahman, M. B. A., and Oslan, S. N. (2024) Utilization and prospect of purification technologies in natural proteins, peptides and recombinant proteins, J. Proteins Proteom., 15, 233-257, https://doi.org/10.1007/s42485-024-00139-7.
  5. Esipov, R. S., Stepanenko, V. N., Chupova, L. A., Boyarskikh, U. A., Filipenko, M. L., and Miroshnikov, A. I. (2008) Production of recombinant human epidermal growth factor using Ssp dnaB mini-intein system, Protein Expr. Purif., 61, 1-6, https://doi.org/10.1016/j.pep.2008.05.009.
  6. Volkmann, G., and Mootz, H. D. (2013) Recent progress in intein research: from mechanism to directed evolution and applications, Cell Mol. Life Sci., 70, 1185-1206, https://doi.org/10.1007/s00018-012-1120-4.
  7. Yuan, H., Prabhala, S. V., Coolbaugh, M. J., Stimple, S. D., and Wood, D. W. (2024) Improved self-cleaving precipitation tags for efficient column free bioseparations, Protein Expr. Purif., 224, 106578, https://doi.org/10.1016/j.pep.2024.106578.
  8. Lahiry, A., Fan, Y., Stimple, S. D., Raith, M., and Wood, D. W. (2018) Inteins as tools for tagless and traceless protein purification, J. Chem. Technol. Biotechnol., 93, 1827-1835, https://doi.org/10.1002/jctb.5415.
  9. Cui, C., Zhao, W., Chen, J., Wang, J., and Li, Q. (2006) Elimination of in vivo cleavage between target protein and intein in the intein-mediated protein purification systems, Protein Expr. Purif., 50, 74-81, https://doi.org/10.1016/j.pep.2006.05.019.
  10. Hiraga, K., Derbyshire, V., Dansereau, J. T., Van Roey, P., and Belfort, M. (2005) Minimization and stabilization of the Mycobacterium tuberculosis recA intein, J. Mol. Biol., 354, 916-926, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2005.09.088.
  11. Esipov, R. S., Beirakhova, K. A., Chupova, L. A., Likhvantseva, V. G., Stepanova, E. V., and Miroshnokov, A. I. (2012) Recombinant fragment of pigment epithelium-derived factor (44-77) prevents pathological corneal neovascularization, Bioorg. Khim., 38, 1-8.
  12. Shen, B., Sun, X., Zuo, X., Shilling, T., Apgar, J., Ross, M., Bougri, O., Samoylov, V., Parker, M., Hancock, E., Lucero, H., Gray, B., Ekborg, N. A., Zhang, D., Johnson, J. C. S., Lazar, G., and Raab, R. M. (2012) Engineering a thermoregulated intein-modified xylanase into maize for consolidated lignocellulosic biomass processing, Nat. Biotechnol., 30, 1131-1136, e2402, https://doi.org/10.1038/nbt.2402.
  13. Wang, Y., Shi, Y., Hellinga, H. W., and Beese, L. S. (2023) Thermally controlled intein splicing of engineered DNA polymerases provides a robust and generalizable solution for accurate and sensitive molecular diagnostics, Nucleic Acids Res., 51, 5883-5894, https://doi.org/10.1093/nar/gkad368.
  14. Yan, S.-S., Yan, J., Shi, G., Xu, Q., Chen, S.-C., and Tian, Y.-W. (2005) Production of native protein by using Synechocystis sp. PCC6803 DnaB mini-intein in Escherichia coli, Protein Expr. Purif., 40, 340-345, https://doi.org/10.1016/j.pep.2004.12.021.
  15. Wu, H., Xu, M.-Q., and Liu, X.-Q. (1998) Protein trans-splicing and functional mini-inteins of a cyanobacterial dnaB intein, Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-432, https://doi.org/10.1016/s0167-4838(98)00157-5.
  16. Malone, C. L., Boles, B. R., and Horswill, A. R. (2007) Biosynthesis of Staphylococcus aureus autoinducing peptides by using the Synechocystis DnaB mini-intein, Appl. Environ. Microbiol., 73, 6036-6044, https://doi.org/10.1128/AEM.00912-07.
  17. Tian, L., and Sun, S. S. (2011) A cost-effective ELP-intein coupling system for recombinant protein purification from plant production platform, PLoS One, 6, e24183, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024183.
  18. Gangopadhhyay, J. P., Jiang, S.-Q., van Berkel, P., and Paulus, H. (2003) In vitro splicing of erythropoietin by the Mycobacterium tuberculosis RecA intein without substituting amino acids at the splice junctions, Biochim. Biophys. Acta, 1619, 193-200, https://doi.org/10.1016/s0304-4165(02)00495-6.
  19. Banki, M. R., Feng, L., and Wood, D. W. (2005) Simple bioseparations using self-cleaving elastin-like polypeptide tags, Nat. Methods, 2, 659-661, https://doi.org/10.1038/nmeth787.
  20. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254, https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3.
  21. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.
  22. Schägger, H., and von Jagow, G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa, Anal. Biochem., 166, 368-379, https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90587-2.
  23. Van Roey, P., Pereira, B., Li, Z., Hiraga, K., Belfort, M., and Derbyshire, V. (2007) Crystallographic and mutational studies of Mycobacterium tuberculosis recA mini-inteins suggest a pivotal role for a highly conserved aspartate residue, J. Mol. Biol., 367, 162-173, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2006.12.050.
  24. Aranko, A. S., Oeemig, J. S., Zhou, D., Kajander, T., Wlodawer, A., and Iwaï, H. (2014) Structure-based engineering and comparison of novel split inteins for protein ligation, Mol. Biosyst., 10, 1023-1034, https://doi.org/10.1039/c4mb00021h.
  25. Lin, Y., Li, M., Song, H., Xu, L., Meng, Q., and Liu, X. Q. (2013) Protein trans-splicing of multiple atypical split inteins engineered from natural inteins, PLoS One, 8, e59516, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059516.
  26. Chong, S., Mersha, F. B., Comb, D. G., Scott, M. E., Landry, D., Vence, L. M., Perler, F. B., Benner, J., Kucera, R. B., Hirvonen, C. A., Pelletier, J. J., Paulus, H., and Xu, M. (1997) Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element, Gene, 192, 271-281, https://doi.org/10.1016/s0378-1119(97)00105-4.
  27. Perler, F. B. (2002) InBase, the intein database, Nucleic Acids Res., 30, 383-384, https://doi.org/10.1093/nar/30.1.383.
  28. Sievers, F., Wilm, A., Dineen, D., Gibson, T. J., Karplus, K., Li, W., Lopez, R., McWilliam, H., Remmert, M., Söding, J., Thompson, J. D., and Higgins, D. G. (2011) Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega, Mol. Syst. Biol., 7, 539, https://doi.org/10.1038/msb.2011.75.
  29. Hall, B. G. (2013). Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA, Mol. Biol. Evol., 30, 1229-1235, https://doi.org/10.1093/molbev/mst012.
  30. Abramson, J., Adler, J., Dunger, J., Evans, R., Green, T., Pritzel, A., Ronneberger, O., Willmore, L., Ballard, A. J., Bambrick, J., Bodenstein, S. W., Evans, D. A., Hung, C. C., O’Neill, M., Reiman, D., Tunyasuvunakool, K., Wu, Z., Žemgulytė, A., Arvaniti, E., Beattie, C., Bertolli, O., Bridgland, A., Cherepanov, A., Congreve, M., et al. (2024) Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3, Nature, 630, 493-500, https://doi.org/10.1038/s41586-024-07487-w.
  31. Van der Spoel, D., Lindahl, E., Hess, B., Groenhof, G., Mark, A. E., and Berendsen, H. J. (2005) GROMACS: fast, flexible, and free, J. Comput. Chem., 26, 1701-1718, https://doi.org/10.1002/jcc.20291.
  32. Lindorff-Larsen, K., Piana, S., Palmo, K., Maragakis, P., Klepeis, J. L., Dror, R. O., and Shaw, D. E. (2010) Improved side-chain torsion potentials for the Amber ff99SB protein force field, Proteins, 78, 1950-1958, https://doi.org/10.1002/prot.22711.
  33. Sormanni, P., Aprile, F. A., and Vendruscolo, M. (2015) The CamSol method of rational design of protein mutants with enhanced solubility, J. Mol. Biol., 427, 478-490, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2014.09.026.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».